Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar beige vetbiologie en metabolisme met behulp van het CRISPR SunTag-p65-HSF1-activeringssysteem

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64849

⸱

6 januari 2023

 ,  , 
1Obesity and Comorbidities Research Center, State University of Campinas, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert het gebruik van CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) in adipocyten (AdipoSPH) als een alternatieve strategie voor adeno-geassocieerd virus (AAV) voor het onderzoeken van beige vetbiologie. In vivo injectie van AAV-dragend sgRNA gericht op het endogene Prdm16-gen is voldoende om de ontwikkeling van beige vet te induceren en het thermogene genprogramma te verbeteren.

Samenvatting

Geclusterde regelmatig interspaced short palindromic repeats (CRISPR) -technologie heeft een revolutie in de biologie teweeggebracht en recente hulpmiddelen zijn veel verder toegepast dan de oorspronkelijk beschreven genbewerking. Het CRISPR-activeringssysteem (CRISPRa) combineert het katalytisch inactieve Cas9 (dCas9)-eiwit met verschillende transcriptiemodules om endogene genexpressie te induceren. SunTag-p65-HSF1 (SPH) is een recent ontwikkelde CRISPRa-technologie die componenten van synergetische activeringsmediatoren (SAM's) combineert met de SunTag-activatoren. Dit systeem maakt de overexpressie van enkele of meerdere genen mogelijk door een aangepast single-guide RNA (sgRNA) te ontwerpen. In deze studie werd een eerder ontwikkelde SPH-muis gebruikt om een voorwaardelijke muis te genereren die SPH tot expressie brengt in adipocyten (adiponectine Cre-afstamming), genaamd AdipoSPH. Om een wit-naar-beige vet (bruining) fenotype te induceren, werd een adeno-geassocieerd virus (AAV) met sgRNA gericht op het endogene Prdm16-gen (een gevestigde transcriptiefactor gerelateerd aan de ontwikkeling van bruin en beige vet) geïnjecteerd in het inguinale witte vetweefsel (iWAT). Dit muismodel induceerde de expressie van endogene Prdm16 en activeerde het thermogene genprogramma. Bovendien verhoogde in vitro SPH-geïnduceerde Prdm16-overexpressie het zuurstofverbruik van beige adipocyten, waardoor de resultaten van een eerder Prdm16-transgeen muismodel werden gefenocopeerd. Dit protocol beschrijft dus een veelzijdig, kosteneffectief en tijdeffectief muismodel voor het onderzoeken van vetweefselbiologie.

Inleiding

Beige (of brite) adipocyten zijn ontkoppelende eiwit 1 (UCP1) -tot expressie brengende en mitochondriaal-rijke adipocyten die zich bevinden in depots van wit vetweefsel (WAT). Beige vet komt voort uit een subset van adipocytenvoorlopers of rijpe witte adipocyten als reactie op blootstelling aan koude en andere stimuli 1,2. Beige adipocyten kunnen energie omzetten in warmte op een UCP1-afhankelijke of onafhankelijke manier3. Ongeacht de thermogene functie kan beige vet ook de metabole gezondheid verbeteren door andere middelen, zoals de afscheiding van adipokines en ontstekingsremmende en anti-fibrotische activiteiten. Studies bij muizen en mensen hebben aangetoond dat de inductie van beige vet de glucose van het hele lichaam en de lipidehomeostase verbetert3. Hoewel onze kennis van beige vetbiologie de afgelopen jaren snel is geëvolueerd, zijn de meeste metabole voordelen en gerelateerde mechanismen nog steeds niet volledig begrepen.

Geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) werden voor het eerst beschreven in eukaryote cellen als een hulpmiddel dat in staat is om een dubbelstrengsbreuk (DSB) te genereren op een specifieke plaats in het genoom door de nucleaseactiviteit van het Cas9-eiwit 4,5. Cas9 wordt geleid door een synthetisch single-guide RNA (sgRNA) om zich te richten op een specifiek genomisch gebied, wat leidt tot een DNA-DSB. Naast het gebruik van het nuclease Cas9 voor bewerkingsdoeleinden, is de CRISPR-Cas9-technologie geëvolueerd om te worden gebruikt als een sequentiespecifiek genregulatie-instrument6. De ontwikkeling van een katalytisch inactief Cas9-eiwit (dCas9) en de associatie van transcriptionele modules die de genexpressie kunnen verbeteren, heeft geleid tot CRISPR-activeringstools (CRISPRa). Er zijn verschillende CRISPRa-systemen ontstaan, zoals VP647,8, synergetische activeringsmediator (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 en SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, die de componenten van SAM- en SunTag-activatoren combineert. Onlangs is aangetoond dat de geïnduceerde expressie van neurogene genen in N2a-neuroblasten en primaire astrocyten hoger is met behulp van SPH in vergelijking met andere CRISPRa-systemen14, wat SPH aantoont als een veelbelovend CRISPRa-hulpmiddel.

Hier maakten we gebruik van een eerder ontwikkelde SPH-muis14 om een voorwaardelijk muismodel te genereren dat SPH specifiek in adipocyten tot expressie brengt met behulp van de adiponectine Cre-afstamming (AdipoSPH). Met behulp van een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat het gRNA draagt dat zich richt op het endogene Prdm16-gen, werd bruining (witte naar beige conversie) van inguinale WAT (iWAT) geïnduceerd om de expressie van het thermogene genprogramma te verhogen. Bovendien verhoogde in vitro Prdm16-overexpressie het zuurstofverbruik. Daarom biedt dit protocol een veelzijdig SPH-muismodel voor het verkennen van de mechanismen van beige vetontwikkeling in vetweefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de University of Campinas Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (protocol CEUA #5810-1/2021).

1. Moleculair klonen

  1. Ontwerp van single guide RNA's (sgRNA's)
    1. Ontwerp sgRNA's voor CRISPR-activering met CHOPCHOP, verkrijgbaar bij https://chopchop.cbu.uib.no/, of een ander geschikt hulpmiddel. Gebruik de volgende parameters om sgRNA te ontwerpen dat gericht is op het Prdm16-gen: Target: Prdm16; In: Mus musculus; Gebruik: Crispr/Cas9; Voor: Activering.
      OPMERKING: Ontwerp sgRNA's voor elke regio van belang verspreid over een 200 bp upstream transcriptie start site (TSS) regio. Het sgRNA gericht op Prdm16 dat in deze studie wordt gebruikt, bindt bijvoorbeeld 154 bp stroomopwaarts van TSS.
    2. Voeg overhangen toe aan het sgRNA om overeen te komen met de SacI-restrictieplaats in de vectorbackbone pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (zie materiaaltabel). Inclusief: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nucleotiden). De sequentie gericht op het Prdm16-gen is bijvoorbeeld 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', en met overhangen is 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGAGGAGCT-3'.
    3. Verkrijg de 3' sgRNA reverse complement sequence met behulp van de tool die beschikbaar is op https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. De 3' sgRNA-sequentie gericht op het Prdm16-gen is bijvoorbeeld 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
  2. Gloeien van enkelstrengs complementaire oligonucleotiden
    1. Voeg 1 μL van elk 5' en 3' enkelstrengs oligonucleotide (voorraadconcentratie: 100 μM), 1 μL T4-ligasebuffer, 0,5 μL T4-polynucleotidekinase (PNK) (1 × 104 eenheden/ml) en 6,5 μl H2O toe aan een eindreactievolume van 10 μL. Gloei de complementaire enkelstrengs oligonucleotiden met behulp van een thermocycler onder de volgende omstandigheden: 37 °C gedurende 30 minuten en 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door een hellingssnelheid van 5 °C/min.
      OPMERKING: Het PNK-enzym wordt geleverd met PNK-buffer en bevat niet genoeg ATP dat nodig is voor de fosforyleringsreactie (zie materiaaltabel). Om de reactie te vereenvoudigen, gebruikt u de T4 ligasebuffer (in plaats van PNK-buffer). T4-ligasebuffer levert de juiste hoeveelheid (1 mM ATP) fosfaat voor de fosforyleringsreactie. Het PNK-enzym levert 5' eindfosforylering van oligonucleotiden voor de daaropvolgende ligatiereactie.
  3. Ligatie van gegloeide sgRNA oligonucleotiden
    1. Voeg 25 ng plasmide pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry toe aan 2 μL gegloeide sgRNA oligonucleotiden, 1 μL SacI-enzym, 2 μL 10x T4 DNA-ligasebuffer, 1 μL T4 DNA-ligase (1-3 u/μL) (zie Materiaaltabel) en H2O tot een eindreactievolume van 10 μL.
    2. Voer ligatie uit door het reactiemengsel te incuberen met behulp van een thermocycler onder de volgende omstandigheden: 15 cycli van 37 °C gedurende 5 minuten en 25 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door vasthouden bij 4 °C.
  4. Transformatie gevolgd door koloniepolymerasekettingreactie (PCR)
    1. Transformeer de bevoegde E. coli DH10B-cellen (zie materiaaltabel) met 4 μl van het ligatieproduct met behulp van een hitteschok (42 °C gedurende 45 s) en verspreid over een agarplaat met 100 μg/ml ampicilline.
    2. Bevestig getransformeerde kolonies per kolonie-PCR met behulp van de PCR-mastermix (zie Materiaaltabel). Kies de kolonie en meng met 5 μL mastermix, 0,1 μL universele primer (voorraadconcentratie: 100 μM), 0,1 μL sgRNA reverse primer (voorraadconcentratie: 100 μM) (tabel 1) en 5 μL H 2 O. Voer de PCR uit met behulp van een thermocycler onder de volgende omstandigheden: initiële denaturatie (94 °C gedurende2min), gevolgd door 35 cycli van denaturatie (94 °C gedurende 20 s), gloeien (60 °C gedurende 30 s), extensie (72 °C gedurende 30 s) en een laatste rekstap (72 °C gedurende 5 minuten). Los het DNA op met behulp van agarose (1,5%) gelelektroforese in 0,5x TAE-buffer bij 90 V gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Positieve klonen geven een band van ~280 bp.
    3. Dien positieve monsters in voor Sanger-sequencing met behulp van universele primer (tabel 1, aanvullend bestand 1).
  5. Plasmide zuivering
    1. Zuiver het plasmide van een positieve kloon met behulp van een plasmidezuiveringskit (zie materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Zuiver het plasmide met behulp van anionenuitwisselingshars of een andere kit die geschikt is voor gebruik bij celtransfectie.
    2. Incubeer de positieve kloon (12 uur bij 37 °C met schudden bij 200 tpm) met behulp van een standaard bacterieel groeimedium dat 100 μg/ml ampicilline bevat.
    3. Centrifugeer de bacteriële cellen bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Volg de volgende stappen volgens de instructies van de kit van de fabrikant.

2. AAV-verpakking

OPMERKING: AAV-verpakking werd uitgevoerd volgens eerdere publicaties15,16 met kleine wijzigingen.

  1. Plaat 293T cellen (zie tabel van materialen) in een 175 cm2 kolf (zaaien 5 × 106 cellen per kolf) met behulp van 25 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S). Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en 95% vochtigheid totdat de cellen 50%-70% samenvloeiing bereiken.
  2. Meng 14 μL polyethylenimine (1 μg/μL) met 1 ml 150 mM NaCl. Meng de drie plasmiden die nodig zijn voor AAV-productie in een molaire verhouding van 1:1:1 (d.w.z. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (zie materiaaltabel) en 5,9 μg gekloond sgRNA uit stap 1 in 1 ml 150 mM NaCl. Breng het polyethyleenimine:NaCl-mengsel druppelsgewijs over in de buis met het DNA (mengsel van plasmiden) en incubeer gedurende 20 minuten bij 25 °C.
    OPMERKING: pAdDeltaF6 is een Helper-plasmide en pCapsid pAAV2/8 is een verpakkingsplasmide dat replicatie- (Rep) en capsid-genen (cap) tot expressie brengt. Beide plasmiden zijn nodig om AAV te produceren.
  3. Vervang vóór transfectie het celgroeimedium door 18 ml DMEM met 1% FBS en L-alanyl-L-glutamine (0,5 g/l). Voeg 2 ml van het polyethyleenimine:DNA-mengsel toe aan elke kweekkolf en incubeer de cellen in een CO 2-incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
  4. Voeg na 5 uur 5 ml DMEM toe, aangevuld met 10% FBS en L-alanyl-L-glutamine (0,5 g / L).
  5. Maak na 3 dagen incubatie de cellen los van de kweekkolf met behulp van een celschraper. Verzamel de 293T-cellen uit 10 (175 cm2) celkweekkolven in conische buisjes van 50 ml en voeg DMEM (zie materiaaltabel) toe tot 30 ml.
  6. Voeg 3 ml chloroform toe aan elke conische buis van 50 ml die de 293T-cellen bevat en meng met behulp van een vortexmixer op hoge snelheid gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen door 7,6 ml 5 M NaCl en vortex kort toe te voegen. Centrifugeer bij 3.000 × g en 4 °C gedurende 5 minuten.
  7. Breng de waterige fase over in een nieuwe conische buis en voeg 9,4 ml 50% (v / v) polyethyleenglycol (PEG) 8000 toe. Meng met een vortexmixer op hoge snelheid gedurende 10 s en zet de monsters gedurende 1 uur op ijs.
  8. Centrifugeer bij 3.000 × g bij 4 °C gedurende 30 min. Verwijder het supernatant en laat de pellet 10 minuten drogen.
  9. Voeg 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) toe en meng gedurende 5 minuten met behulp van een vortexmixer op hoge snelheid. Voeg 3,5 μl 1 M MgCl2, 14 μl DNase I (20 eenheden/μl) en 1,4 μl RNase A (10 μg/μl) toe. Incubeer gedurende 20 minuten in een waterbad van 37 °C en breng de monsters vervolgens over in nieuwe buizen van 1,5 ml (700 μl in elke buis).
  10. Voeg 700 μL chloroform toe aan elke buis van 1,5 ml en meng met behulp van een vortexmixer op hoge snelheid gedurende 10 s. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3.000 × g bij 4 °C en breng de waterige fase over in een nieuwe buis. Herhaal deze stap 3x.
  11. Verdamp de chloroform gedurende 30 minuten in een bioveiligheidskast. Breng vervolgens 300 μL van de waterige fase over in een ultracentrifugatiebuis van 0,5 ml (zie materiaaltabel). Draai het filter op 14.000 × g bij 25 °C gedurende 5 min. Verwijder de doorstroming en draai het filter opnieuw totdat het volledige volume door het filter is gegaan.
  12. Was het filter door 300 μL van Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) toe te voegen en meng de oplossingen door pipetteren. Centrifugeer het filter gedurende 5 minuten bij 14.000 × g bij 25 °C. Herhaal deze wasstap 4x.
  13. Centrifugeer het filter gedurende 8 minuten bij 14.000 × g bij 25 °C. Plaats het filter ondersteboven in een nieuwe buis en draai gedurende 2 minuten bij 1.000 × g bij 25 °C.

3. Titratie van de AAV door qPCR

  1. Maak een standaardcurve voor AAV-titratie en bepaal de AAV-titer volgens de oorspronkelijke studie van Fripont et al.15.

4. In vivo injectie van AAV in het inguinale witte vetweefsel (iWAT)

  1. Scheid de chirurgische hulpmiddelen en benodigdheden die nodig zijn voor een operatie en steriliseer ze zoals aanbevolen voor elk specifiek materiaal.
  2. Verdoof de muis met 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine door intraperitoneale injectie. Bevestig de anesthesie door krachtige druk uit te oefenen op de poot en staart en te controleren op een reflex. Breng zalf aan op de ogen van de muis om droogheid van de ogen tijdens de operatie te voorkomen.
  3. Plaats de verdoofde muis in rugligging en scheer een klein gebied op de flanken, proximaal aan de heupgewrichten voor iWAT-injecties, met een scheerapparaat. Breng ontharingscrème gedurende 5 minuten aan. Verwijder resterende crème met water om huidverbranding te voorkomen.
  4. Desinfecteer de huid met behulp van drie afwisselende rondes van het aanbrengen van antiseptische oplossing (povidon-jodium) op de huid met een schoon gaas en 70% alcohol. Gooi het gaas na elk gebruik weg.
  5. Voer een laatste toepassing van een antiseptische oplossing op de huid uit. Maak vervolgens een incisie van 1-2 cm met een gesteriliseerde schaar in het proximale gebied van de gewrichten en houd de huid open met een tang om het vetdepot bloot te leggen. De WAT is aan beide zijden aan de huid bevestigd en strekt zich uit van het begin op de rug en naar beneden naar de testis.
    OPMERKING: Gebruik gordijnen om besmetting tijdens een operatie of hechtingsprocedures te voorkomen.
  6. Trek met een tang, door de incisie, het vetdepot voorzichtig omhoog om ervoor te zorgen dat de injectie op de juiste locatie en diepte is.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het weefsel niet van de oorspronkelijke locatie verwijdert.
  7. Vul de microliterspuit (dikte: 33; puntstijl: 4; hoek: 12; lengte: 10) (zie materiaaltabel) met 2,5 μl (5,6 × 1010 virale genomen [VG]/μL) van de AAV (die het sgRNA bevat dat gericht is op het endogene Prdm16-gen). Steek de naald voorzichtig in een hoek van 30°-45° in de iWAT. Herhaal de injectie 5x op verschillende locaties van het weefsel om het hele iWAT-vetkussen homogeen te infecteren. Een totaal volume van 15 μL wordt aanbevolen om de iWAT te infecteren.
    OPMERKING: De diepte van het inbrengen van de spuit is afhankelijk van de dikte van de afzetting van het vetkussen. Gebruik de no-touch techniek om de injectie op te stellen.
  8. Sluit de geschoren huidincisie met behulp van 4/0 monofilament hechtingen. Plaats de muis op een warmtekussen totdat het bewustzijn is herwonnen. Controleer het dier elke 10-15 minuten totdat het volledig herstelt. Nadat het dier weer bij bewustzijn is gekomen, observeert u de locomotorische profilering, die lineair moet zijn en geen tekenen van angst of pijn moet hebben.
  9. Voer postoperatieve pijnbestrijding uit binnen 48 uur na de operatie door tramadolhydrochloride (5 mg/kg) intraperitoneaal toe te dienen gedurende 3 dagen (2x/dag).
    OPMERKING: Let op tekenen van nood en ongemak en controleer de water- en voedselinname. Geef preventief een effectieve dosis pijnstiller, bij voorkeur voor of aan het begin van de operatie.
  10. Houd de muis in een kooi met vrije toegang tot voedsel en water tijdens de genezingsperiode. Ga na de genezingsperiode verder met het euthanaseren van de muis. In deze studie werd euthanasie uitgevoerd door een overdosis injecteerbare anesthetica (intraperitoneaal) van 3x de inducerende dosis (300-360 mg/kg ketaminehydrochloride + 30-40 mg/kg xylazinehydrochloride) gevolgd door onthoofding.
    OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om de dieren in individuele kooien te houden totdat ze volledig hersteld zijn van de anesthesie.

5. In vitro differentiatie van stromale vasculaire cellen (SVF's) in beige adipocyten

  1. Voer isolatie en plating uit van primaire SVF's uit de iWAT van AdipoSPH-muizen volgens Aune et al.17. Zaad-SVF's afgeleid van AdipoSPH-muizen iWAT in een 6-well-plaat met volledig medium (DMEM met 3,1 g / L glucose, 0,5 g / L L-alanyl-L-glutamine, 10% FBS en 2,5% P / S) gedurende 1-2 uur.
    OPMERKING: De SVF-fractie bevat een mengsel van verschillende celtypen. In deze stap is het niet mogelijk om het aantal gezaaide voorlopercellen te definiëren die aanleiding geven tot adipocyten.
  2. Zuig het medium op, was de put 2x met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) en vervang door vers compleet medium. Incubeer de cellen bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid totdat de cellen 70%-80% confluentie bereiken.
  3. Induceer differentiatie (dag 0) door de cellen te behandelen met het inductiemedium (tabel 2).
    OPMERKING: De medicijncocktail van het inductiemedium is nodig om de beige adipocytendifferentiatie te verbeteren en voor expressie van het thermogene genprogramma17.
  4. Vervang na 2 dagen (dag 2) het inductiemedium door het onderhoudsmedium (tabel 2).
  5. Vervang na 2 dagen (dag 4) het onderhoudsmedium gedurende 2 tot 3 dagen door vers onderhoudsmedium (tabel 2).
  6. Vervang het onderhoudsmedium elke 48 uur totdat de preadipocyten volledig zijn gedifferentieerd in adipocyten (meestal 6 dagen na de toevoeging van het inductiemedium). Volwassen adipocyten kunnen worden waargenomen met behulp van lichtmicroscopie, omdat de gedifferentieerde cellen lijken te zijn geladen met lipidedruppels.

6. In vitro AAV-infectie van SVF's

OPMERKING: SVF's afgeleid van AdipoSPH-muizen iWAT werden geïnfecteerd met AAV-dragende sgRNA-Prdm16 zoals eerder beschreven door Wang et al.18 met een paar wijzigingen.

  1. Laat de cellen groeien op een 6-well kweekplaat met volledig medium totdat de cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken, zoals eerder beschreven in stappen 5.1-5.3.
  2. Meng 5,6 × 1010 VG/μL AAV-dragend sgRNA-Prdm16 met 2 ml volledig medium en hexadimethrinebromide (8 μg/ml) (zie materiaaltabel). Transduceer de cellen door het volledige medium te vervangen en het volledige medium met AAV toe te voegen. Incubeer de getransduceerde cellen gedurende 12 uur bij 37 °C, 95% vochtigheid en 5% CO2.
  3. Splits en zaai de cellen zoals beschreven in stap 5 voor celproliferatie en differentiatie in beige adipocyten.
    OPMERKING: Voor de zuurstofverbruikstest, zaad 4,0 × 104 cellen (vanaf stap 6.2) per put met inductiemedium in een 24-well celkweekplaat. De volgende stappen van celproliferatie en differentiatie worden uitgevoerd zoals beschreven in stap 5. De zuurstofverbruikstest wordt uitgevoerd wanneer de cellen 80% -100% samenvloeiing bereiken en volledig gedifferentieerd zijn, zoals eerder gemeld19.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

AdipoSPH-muizen werden ontwikkeld door SPH- en Adipoq-Cre-muizenstammen te fokken. Beide muizenstammen hadden een hybride C57BL6J-DBA/2J-achtergrond (volgens de commerciële leverancier; zie Materiaaltabel). De SPH-muizenlijn werd oorspronkelijk beschreven door Zhou et al.14.

In vivo beige adipocytenontwikkeling door AdipoSPH-gemedieerde Prdm16-overexpressie
Om de capaciteit van het in deze studie beschreven ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een van de meest bruikbare niet-bewerkende toepassingen van CRISPR-technologie is de ondervraging van de genfunctie door de activering van endogene genen met behulp van CRISPRa-systemen6. SPH is een krachtige CRISPRa die oorspronkelijk werd beschreven om de omzetting van astrocyten in actieve neuronen te induceren door zich te richten op verschillende neurogene genen14. In deze studie werd aangetoond dat AdipoSPH een geschikt hulpmiddel is voor het onderzoeken van de biolog...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de steun van Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, voor de generatie van AdipoSPH-muizen, het Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory en het National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) voor alle experimentele ondersteuning. We danken de financiële steun van Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3,3'5-Triiodo-L-thyronineSigma-AldrichT2877
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI5879
AAVpro 293T Cell LineTakarabio632273
Amicon Ultra Centrifugal FilterMerckmilliporeUFC510008100 KDa
DexamethasonSigma-AldrichD1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX® supplementGibco10565-018hoge concentraties glucose, aminozuren en vitaminen
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Sigma-AldrichD8662
Excelta Self-Opening Micro ScissorsFisher Scientific17-467-496
Fetal bovine serumSigma-AldrichF2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk)Fisher Scientific08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/ForcepsFisher Scientific12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting ScissorsFisher Scientific08-940
GlycerolSigma-AldrichG5516
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene)Sigma-AldrichH9268
IndomethacinSigma-AldrichI7378
InsulinSigma-AldrichI9278
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8225
Maxiprep purification kitQiagen12162
Microliter syringeHamilton80308Model 701
NEB 10-beta/StableNew England BiolabsC3019HE. coli competent cellen
pAAV2/8Addgene112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherryAddgene91947
pAdDeltaF6Addgene112867
PEG 8000Sigma-Aldrich89510
Penicillin/streptomycinGibco15140-122
PolyethylenimineSigma-Aldrich23966Lineair, MW 25000
Povidone-jodiumRioquímica510101303Antisepticum
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
SacI enzymeNew England BiolabsR0156
Surgical Design Premier Adson ForcepsFisher Scientific22-079-741
SyringeHamilton475-40417
T4 DNA LigasePromegaM180B
T4 DNA ligase bufferNew England BiolabsB0202S
T4 PNK enzyme kitNew England BiolabsM0201S
Tramadol HydrochlorideSEM43930
Vidisic GelBausch + Lomb99620

Referenties

  1. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  9. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  10. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  13. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  14. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  15. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960(2019).
  16. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103(2020).
  17. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  18. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  19. Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118(2020).
  20. Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  21. Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
  22. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
  23. Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
  24. Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
  25. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  26. Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  27. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  28. Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
  29. Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

CRISPR-activatiegenexpressie in adipocytenPrdm16-overexpressieadeno-geassocieerd viruswit vetweefselthermogeen genprogrammazuurstofverbruikstromale vasculaire cellen
Onderzoek naar beige vetbiologie en metabolisme met behulp van het CRISPR SunTag-p65-HSF1-activeringssysteem
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.