Methodenartikel

De oprichting van een Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

DOI:

10.3791/64855

⸱

13 januari 2023

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Stomatology Hospital, Sichuan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol demonstreert stapsgewijze details over het extraheren van de mandibulaire eerste kies in de muis. Het biedt een alternatieve methode voor onderzoekers die zich richten op kaakbotgenezing en -regeneratie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie introduceert de ontwikkeling van een molair extractiemodel in de murine onderkaak om een praktisch model te bieden voor het bestuderen van alveolaire botregeneratie en intramembraneuze ossificatie. C57/J6 muizen werden gebruikt om de mandibulaire eerste kies te extraheren om dit model vast te stellen. Ze werden geëuthanaseerd en de bilaterale kaken werden geoogst, respectievelijk 1 week en 4 weken na de operatie. Daaropvolgende seriële stereoscopische oogst, histologische beoordeling en immunofluorescentiekleuring werden uitgevoerd om een succesvolle operatie aan te tonen. Direct na de operatie toonden de stereoscopische beelden een lege afzuigkap. De hematoxyline en eosine (H&E) na 1 week en Masson-kleuring 4 weken na de operatie toonden aan dat het gebied van de oorspronkelijke wortel gedeeltelijk en volledig gevuld was met respectievelijk bottrabeculae. De immunofluorescentiekleuring toonde aan dat, in vergelijking met de homeostasezijde, de Sp7-expressie 1 week na de operatie toenam, wat wijst op krachtige osteogenese in de alveolaire fossa. Al deze resultaten toonden een praktisch murine tandextractie socket healing model aan. Aankomende studies die de mechanismen van genezing van kaakbotdefecten of sockethealing onthullen, zouden deze methode kunnen overnemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Socketgenezing na tandextractie is een veel voorkomend klinisch scenario, wat kan leiden tot ongepaste complicaties zoals socketbloeding, droge kom of zelfs kaakosteomyelitis bij ongewenste genezing 1,2,3. Deze comorbiditeiten kunnen de kwaliteit van leven van patiënten aantasten en, erger nog, de prothetische revalidatie van vitaal belang uitdagen als gevolg van massaal botverlies4. Hoewel de genezingsstadia van de socket zijn opgehelderd, zijn ze ontoereikend om klinische zorg na tandextractiechirurgie te sturen bij het tegenkomen van verschillende prognose-uitdagingen4.

Meerdere studies op basis van diermodellen zijn uitgevoerd om een beter begrip te krijgen van de onderliggende mechanismen in het socketgenezingsproces en de bovenstaande situaties te voorkomen. Sp7 is een meesterregulator in osteoblastdifferentiatie en speelt een vitale rol bij de ontwikkeling van skeletten, bothemostase en botregeneratie 5,6. Rationele socket healing modellen zouden de redundantie van Sp7 posttraumatisch in botregeneratie kunnen aantonen. Bovendien, anders dan de genezing van lange botbreuken, omvat slechts een enkel osteogeen proces, intramembraneuze ossificatie, het genezingsproces van de extractiesocket7. Dit maakt het dierlijke tandextractiemodel optimaal voor het bestuderen van op implantaten gebaseerde therapieën, omdat implantaat osseointegratie voldoet aan dezelfde osteogene regel8.

Al tientallen jaren wordt het tandextractiemodel uitgevoerd bij ratten, konijnen en honden, omdat deze soorten grote tanden hebben die handig te bedienen zijn op 9,10,11. Gezien de bloeiende vraag naar genetische modificatie en als een meer adaptieve genetische achtergrond voor mensen, worden muizen echter steeds vaker gebruikt om een tandextractiemodel op te zetten. Vanaf dat moment konden onderzoekers de rol van een specifieke celpopulatie in het socketgenezingsproces ontrafelen met behulp van genoomgemodificeerde muizen in plaats van fenotypen slechts12 te observeren. Onder murine tandextractiesocketmodellen hebben eerdere studies het vestigings- en genezingsproces van murine maxillaire tand- en snijtandextractiesocketsaangetoond 13,14,15,16. Het genezingspatroon van de prognose en de detective- en observatietijdstippen kunnen echter per protocol verschillen. Dit doet een beroep op een universeel criterium voor geleerden om een murine socket healing model vast te stellen.

Deze studie was gericht op het vormen van een praktisch murine socket healing model voor de bovenstaande problemen. Onderkaakkiezen bij muizen hebben onderscheidende morfologische eigenschappen in vergelijking met maxillaire kiezen en snijtanden, wat unieke voor- en nadelen met zich meebrengt. Omdat de modellen die zich richten op de muriene onderkaak momenteel vacuümgebaseerd zijn, probeerde dit protocol een succesvolle methode te bieden om de mandibulaire eerste kies bij muizen te extraheren. We hopen dat dit protocol basisonderzoekers zal verlichten met nieuwe ideeën om onderliggende mechanismen van sockethealing te ontdekken en klinische zorg aan te geven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2017-041). Volwassen C57BL/6-muizen, verkregen uit een commerciële bron (zie materiaaltabel), werden gebruikt voor deze studie.

1. Prechirurgische voorbereiding

  1. Instrumentvoorbereiding
    1. Bereid verschillende naalden van wegwerpspuiten (26G, 25G, 23G; zie tabel met materialen) voor om als elevators te gebruiken. Buig de naaldkop ongeveer 20°-40°, zoals weergegeven in figuur 1.
    2. Bereid een getande oogheelkundige pincet voor als tang. Zorg ervoor dat het past bij de grootte van de kiezen van de muizen en de kiezen stevig kan vastpakken. De ideale pincetgrootte is weergegeven in figuur 1A, B3.
    3. Verkrijg een elastiekje (dat kan worden gescheurd van een medische latex handschoen) om te worden gebruikt als een mondopener, een schuimplaat of kurkbord als het chirurgische platform, een koplamp om het chirurgische gebied te verlichten en een verwarmingskussen voor postoperatieve revival. Scheur een droog watje in kleine stukjes en breng het aan op de operatieplaats als er tijdens de procedure bloedingen optreden.
  2. Anesthesievoorbereiding
    1. De muis kan worden verdoofd door elk geschikt anesthesieprotocol dat algemene anesthesie bereikt die wordt bevestigd door de 'teenknijp'-methode. Breng na anesthesie veterinaire zalf aan op de ogen van de muis.
      OPMERKING: Het voorkeursprotocol voor algemene anesthesie kan zijn: inductie en onderhoud met xylazine (10 mg / kg) en ketamine (100 mg / kg) intraperitoneaal (IP);
      Voor deze studie werden isofluraan en 1% pentobarbital natrium (50 mg / kg, IP) gebruikt voor anesthesie-inductie en onderhoud met extra doses indien nodig.
  3. Desinfectie- en sterilisatiepreparaat
    1. Desinfecteer het bedieningsplatform en de bovengrondse openlucht met een 75% ethanolspuit. Voorafgaand aan elke muisprocedure wordt het gebruik van een nieuwe set wegwerpnaalden aanbevolen.
      OPMERKING: De getande pincet is herbruikbaar en kan worden gesteriliseerd met behulp van elke gewenste methode, zoals stoomsterilisatie.

2. Chirurgisch proces

  1. Fixatie van de muis en zijn onderkaak
    1. Bind de muis met plakband in rugligging aan een chirurgisch platform. Pin twee naalden van 26 G in lijn met het orbitale oorvlak en nog eens twee naalden van 26 G op hun gemak onder de onderkaak.
    2. Breng het elastiekje rond de naalden aan en kruis de snijtanden om de mond open te houden. Trek de tong iets naar buiten en bevestig deze onder het elastiekje tegenover de chirurgische kant, om te voorkomen dat deze het gezichtsveld belemmert (figuur 1C).
  2. Het elimineren van de distale weerstand
    1. Houd de kies met een pincet mesiaal vast, duw een naald van 23 G in het buccale alveolaire bot van de distale wortel en maak een interval.
      OPMERKING: Deze stap moet met grote voorzichtigheid worden genomen, omdat een naald die te diep is ingebed waarschijnlijk de wortel zal breken.
    2. Verander vervolgens naar een naald van 25 G om het interval te blijven uitbreiden en ga voorzichtig naar het periapicale gebied terwijl je de naald langzaam naar voren en linguaal draait (met de anatomische positie van de muis) om de wortel uit de alveolaire fossa te drukken.
  3. Het elimineren van de mesiale weerstand
    1. Wanneer er voldoende ruimte is, gebruikt u een naald van 23 G om in de wortelvork te steken en de kies occlusaal op te tillen. Nadat u de kies stevig hebt vastgehouden, neemt u nog een naald van 23 G en duwt u deze in het linguale mesiale parodontale membraan om een interval te creëren.
    2. Vervang vervolgens door een naald van 25 G en draai langzaam naar voren en buccaal. Als enkele onderliggende obstakels de luxatie van de kies belemmeren, gebruik dan een naald van 26 G om de worteltop te penetreren en herhaal de bewerkingen.
  4. Definitieve extractie
    1. Trek de tand eruit en zorg er tijdens het trekken voor dat de kroon hoog boven het occlusale vlak uitsteekt en dat twee intacte wortels goed te zien zijn.
      OPMERKING: De luxatie (dislocatie) van de tand wordt beschouwd als het meest pijnlijke en verontrustende moment van de procedure. Voordat de tand wordt ontwricht, moet de anesthetische diepte opnieuw worden beoordeeld met behulp van de teenknijptest en dienovereenkomstig moet indien nodig een matige dosis van een verdovingsmiddel worden toegediend.
  5. Postoperatieve zorg
    1. Breng na het extraheren van de tand droog katoen aan om het bloeden te stoppen, verplaats de tong, dien carprofen (5 mg / kg) subcutaan toe en plaats de muis op een verwarmingskussen met constante temperatuur totdat het herstel van de anesthesie is hersteld.

3. Beeldvorming van de onderkaak van de muis en de extractieaansluiting

  1. Bereiding van de monsters
    1. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Gebruik een oogheelkundige schaar om de skeletspieren te knippen die aan de onderkaak en de zygomatische boog zijn bevestigd. Snijd van de keel langs de onderrand van de onderkaak naar de opgaande tak en vervolgens naar de achterkant van de condylus, en trek dan de onderkaak naar beneden en snijd langs de onderste snijtandmiddellijn. Op deze manier worden de twee afzonderlijke kaken geoogst.
    2. Voer fixatie, demineralisatie en uitdroging uit volgens de standaardprocedure17. Zorg er bij het insluiten van17 voor dat het occlusale vlak evenwijdig is aan de rand van de cassette (zie Materiaaltabel). Bevestig de onderkaak aan de onderkant van de cassette, met de onderrand vast (figuur 2).
      OPMERKING: Dit protocol biedt het sagittale vlak van het onderkaakgebied.
  2. Het monster op het microtoom bevestigen
    1. Regel de monsterklem in het microtoom om de condylus en de kroonzijde 5°-20° meer uit te steken, om een geïntegreerd beeld te krijgen van kroonpulp die samengaat met wortelpulp (figuur 2).
  3. Voorbereiding van de secties
    OPMERKING: De condylus is altijd de eerste anatomische structuur die wordt gesneden. Wanneer het vervaagt, kan het kiesgebied vervolgens in verschillende plakjes worden gesneden.
    1. Verschuif het microtoombereik naar 5 μm, verzamel elke acht plakjes en zoek naar dentine in de laatste plak. Als het kroondentine voor het eerst verschijnt zonder wortelapicale dentine, past u de monsterklem aan om het wortelgebied te laten uitsteken en vice versa.
  4. Verzamelen van de secties
    OPMERKING: De snijhoek is geschikt totdat het dentine gelijk is bereikt in zowel de kroon als het apicale gebied.
    1. Snijd langs deze richting en bekijk de plakjes onder de microscoop totdat de tandpulp in zowel de kroon als de wortels verschijnt. Verzamel de secties wanneer een obscure contour van kiezen op het oppervlak van het paraffinemonsterverschijnt 17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het praktische gebruik van deze methode te verduidelijken, werd de rechter mandibulaire eerste kies van twee gezonde C57BL / 6-muizen (3 maanden oud, beide vrouwelijk) geëxtraheerd en gevolgd gedurende respectievelijk 1 week en 4 weken. De onbeschadigde linker kaken werden gebruikt als gezonde controles. Figuur 1A toont de specifieke kenmerken van het chirurgische apparaat, waaronder naalden van 26-23 G en een getande oftalmische pincet. De naald van 26 G wordt nauwkeurig verwijderd en ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het murine socket healing model is een belangrijke methode voor het ontrafelen van de onderliggende mechanismen in botgenezing en regeneratie, waardoor uiteindelijk klinische uitdagingen worden opgelost. Bestaande studies hebben de mogelijkheid van het snijtandextractiemodel en het maxillaire molaire extractiemodel aangetoond, terwijl studies geen gebruik hebben gemaakt van het mandibulaire eerste molaire model13,17,18. Snijtand...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle originele gegevens en afbeeldingen zijn opgenomen in dit artikel. De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 81825005 (L.Y.), 82201045 (F.Y.) en 82100982 (F.L.), en door het Sichuan Province Science and Technology Program 2021JDRC0144 (F.L.), 2022JDRC0130 (F.Y.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
23/25/26 G naaldChengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.SB1-074(IV)
C57/B6J Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, ChinaC57/B6J
DAPI kleuringsoplossing Beyotime Cat#C1005
InbeddingscassettesCITOTEST Scientific80106-1100-16
Hematoxyline en Eosine KleuringskitBiosharpBL700B
IsofluraanRWD Life Science Co.,LtdR510-22-10
Masson’s Trichrome KleuringskitSolarbioG1340
Microtoom LeicaRM2235
Pentobarbital NatriumHuaxia Chemical Reagent Co., Ltd2018042001
Konijn polyklonaal anti-Sp7 Abcam Cat# ab22552
PincetChengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.SB2-115

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mamoun, J. Dry socket etiology, diagnosis, and clinical treatment techniques. Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 44 (2), 52-58 (2018).
  2. Laraki, M., Chbicheb, S., El Wady, W. Alveolitis: review of the literature. Odonto-Stomatologie Tropicale = Tropical Dental Journal. 35 (139), 19-25 (2012).
  3. Soundia, A., et al. Osteonecrosis of the jaws (ONJ) in mice after extraction of teeth with periradicular disease. Bone. 90, 133-141 (2016).
  4. Araújo, M. G., Silva, C. O., Misawa, M., Sukekava, F. Alveolar socket healing: what can we learn. Periodontology 2000. 68 (1), 122-134 (2015).
  5. Hojo, H., Ohba, S. Sp7 Action in the skeleton: its mode of action, functions, and relevance to skeletal diseases. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5647(2022).
  6. Zhou, X., et al. Multiple functions of Osterix are required for bone growth and homeostasis in postnatal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 12919-12924 (2010).
  7. Ito, S., et al. Pathological differences in the bone healing processes between tooth extraction socket and femoral fracture. Bone Reports. 16, 101522(2022).
  8. Vasak, C., et al. Early bone apposition to hydrophilic and hydrophobic titanium implant surfaces: a histologic and histomorphometric study in minipigs. Clinical Oral Implants Research. 25 (12), 1378-1385 (2014).
  9. Araújo, M. G., Lindhe, J. Dimensional ridge alterations following tooth extraction. An experimental study in the dog. Journal of Clinical Periodontology. 32 (2), 212-218 (2005).
  10. Kim, I. -S., Ki, H. -C., Lee, W., Kim, H., Park, J. -B. The effect of systemically administered bisphosphonates on bony healing after tooth extraction and osseointegration of dental implants in the rabbit maxilla. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 28 (5), 1194-1200 (2013).
  11. Kanyama, M., et al. Connective tissue growth factor expressed in rat alveolar bone regeneration sites after tooth extraction. Archives of Oral Biology. 48 (10), 723-730 (2003).
  12. Zhou, S., et al. The role of IFT140 in early bone healing of tooth extraction sockets. Oral Diseases. 28 (4), 1188-1197 (2022).
  13. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is required for osseous healing in extraction sockets in mice. Frontiers in Immunology. 12, 678873(2021).
  14. Avivi-Arber, L., Avivi, D., Perez, M., Arber, N., Shapira, S. Impaired bone healing at tooth extraction sites in CD24-deficient mice: A pilot study. PLoS One. 13 (2), 0191665(2018).
  15. Vieira, A. E., et al. Intramembranous bone healing process subsequent to tooth extraction in mice: micro-computed tomography, histomorphometric and molecular characterization. PLoS One. 10 (5), 0128021(2015).
  16. Min, K. -K., et al. Effects of resveratrol on bone-healing capacity in the mouse tooth extraction socket. Journal of Periodontal Research. 55 (2), 247-257 (2020).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. Kuroshima, S., et al. Transplantation of noncultured stromal vascular fraction cells of adipose tissue ameliorates osteonecrosis of the jaw-like lesions in mice. Journal of bone and Mineral Research. 33 (1), 154-166 (2018).
  19. Ahel, V., et al. Forces that fracture teeth during extraction with mandibular premolar and maxillary incisor forceps. The British Journal of Oral & Maxillofacial Surgery. 53 (10), 982-987 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extractie van muizenmolarenMandibulair extractiemodelRegeneratie van het alveolaire botIntramembraneuze ossificatieGenezing van de tandkasVorming van bottrabekelsImmunofluorescentiekleuringHistologische beoordelingSp7 expressieOsteoblastdifferentiatie

Gerelateerde artikelen