Methodenartikel

Dissectie van pancreasweefsel om levensvatbare afzonderlijke cellen te isoleren

DOI:

10.3791/64871

⸱

26 mei 2023

 ,  , 
1The Lautenberg Center for Immunology and Cancer Research, The Institute for Medical Research Israel-Canada, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaplastische cellen van de alvleesklier zijn voorlopers van kwaadaardige cellen die aanleiding geven tot pancreastumoren. Het isoleren van intacte levensvatbare alvleeskliercellen is echter een uitdaging. Hier presenteren we een efficiënte methode voor dissociatie van pancreasweefsel. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of voor twee- of driedimensionale co-culturing.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De alvleesklier omvat twee belangrijke systemen: het endocriene systeem, dat hormonen produceert en afscheidt, en het exocriene systeem, dat ongeveer 90% van de alvleesklier uitmaakt en cellen omvat die spijsverteringsenzymen produceren en afscheiden. De spijsverteringsenzymen worden geproduceerd in de acinaire cellen van de alvleesklier, opgeslagen in blaasjes die zymogens worden genoemd, en worden vervolgens via het pancreaskanaal in de twaalfvingerige darm vrijgegeven om metabolische processen op gang te brengen. De enzymen die door de acinaire cellen worden geproduceerd, kunnen cellen doden of celvrij RNA afbreken. Bovendien zijn acinaire cellen kwetsbaar en resulteren gemeenschappelijke dissociatieprotocollen in een groot aantal dode cellen en celvrije proteasen en RNases. Daarom is een van de grootste uitdagingen bij de vertering van pancreasweefsel het herstellen van intacte en levensvatbare cellen, met name acinaire cellen. Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, toont een tweestapsmethode die we hebben ontwikkeld om aan deze behoefte te voldoen. Het protocol kan worden gebruikt om normale alvleesklier, alvleesklier met premaligne laesies of alvleeskliertumoren met een groot aantal stromale en immuuncellen te verteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier (PDAC) is een van de meest agressieve kankersoorten1. Klinisch bewijs ondersteunt het idee dat PDAC zich gedurende vele jaren ontwikkelt uit cellen van het exocriene systeem, waaronder acinaire cellen, aangedreven door mutaties in het KRAS-proto-oncogen2.

Pancreastumoren omvatten veel verschillende celtypen en het is aangetoond dat kwaadaardige cellen slechts 20%-50% van de tumormassa uitmaken3. Verschillende celtypen interageren met de epitheelcellen, ondersteunen hun transformatie en verbeteren de vorming en groei van tumoren. Vroege gebeurtenissen veroorzaken acinaire metaplasie, die aanleiding geeft tot microscopisch kleine laesies die intra-epitheliale neoplasie van de pancreas (PanIN's) worden genoemd en die zich in sommige gevallen kunnen ontwikkelen tot PDAC4.

Het is van cruciaal belang om deze interacties te onderzoeken en zich te richten op cruciale signalen. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) is een krachtige methode die genexpressie onthult met een resolutie van één cel, waardoor de veranderingen die epitheelcellen ondergaan worden gevolgd, waardoor de ontwikkeling van alvleesklierkanker kan worden onderzocht.

Weefseldissectie en vertering naar afzonderlijke cellen is de eerste fase in een scRNA-seq-experiment. Verschillende factoren maken de vertering van pancreasweefsel bijzonder uitdagend: i) acinaire cellen zijn goed voor meer dan 90% van de pancreas en acinaire cellen bevatten grote hoeveelheden spijsverteringsenzymen, waaronder proteasen en RNases die de kwaliteit van op RNA gebaseerde bibliotheken verminderen; ii) acinaire cellen zijn zeer gevoelig en kunnen lyseren als standaardprotocollen worden gebruikt; (iii) acinaire cellen brengen een klein aantal genen tot expressie op zeer hoge niveaus. Daarom, als deze cellen tijdens het experiment worden gelyseerd, kan dit het waargenomen genexpressieprofiel van andere cellen besmetten; (iv) pancreasweefsel dat uit tumoren wordt teruggewonnen, is desmoplastisch, waardoor het moeilijk te ontleden is zonder de cellen te beschadigen. Dus hoewel het handhaven van een hoge levensvatbaarheid van alle celtypen vereist is, voegen het grote aantal en de gevoeligheid van acinaire cellen extra complexiteit toe. Deze factoren maken het moeilijk om een eencellige suspensie te bereiken die voor meer dan 80% levensvatbaar is en geen klonten heeft, zoals vereist is voor scRNA-seq-experimenten.

Hier ontwikkelden we een protocol met trypsine C en collagenase P, samen met frequente weefselmonitoring. Dit ondersteunt de dissociatie van afzonderlijke cellen met behoud van een hoge levensvatbaarheid om het succes van scRNA-seq-experimenten te ondersteunen 5,6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gezamenlijke ethische commissie (Institutional Animal Care and Use Committee) van de Hebreeuwse Universiteit (Jeruzalem, Israël) en het Hadassah Medical Center (Jeruzalem, Israël) keurde het onderzoeksprotocol voor dierenwelzijn goed (MD-18-15417-5 "Tissue dynamics in pancreatic cancer in muizen"), en het hier gepresenteerde protocol voldeed aan alle relevante ethische voorschriften voor dierproeven en onderzoek. De Hebreeuwse Universiteit is een door Vereniging voor Beoordeling en Accreditatie van Proefdierverzorging Internationaal geaccrediteerd instituut.

OPMERKING: De muizenstam voorraad #007908, voorraad #019378 en voorraad #008179 zijn verkregen uit het laboratorium van Jackson. PRT (Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato) muizen zijn gemaakt door de bovenstaande stammen te kruisen. Muizen van beide geslachten, tussen 6 weken en 15 maanden oud, werden gebruikt voor het onderzoek. Tamoxifen werd bereid door het poeder op te lossen in maïsolie. Volwassen muizen (6-8 weken oud, vrouwtjes en mannetjes) werden subcutaan geïnjecteerd met tamoxifen op dag 0 en 2 in een dosis van 400 mg/kg en tweemaal per week na de injectie onderzocht. Het was niet mogelijk om tumoren te meten omdat ze zich inwendig bevonden; Daarom werd euthanasie uitgevoerd als abnormale klinische symptomen werden waargenomen volgens het ethische protocol. Muizen werden op verschillende tijdstippen na de introductie van tamoxifen geëuthanaseerd, met behulp van isofluraan en cervicale dislocatie.

1. Alvleesklierdissectie

OPMERKING: Voor een optimale opbrengst tijdens de extractie en om een goede levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, is een snelle dissectie van cruciaal belang. Om de tijd die nodig is voor de isolatie van de alvleesklier te verkorten, moeten alle instrumenten en apparatuur klaar zijn op ijs voordat de muis wordt geëuthanaseerd.

  1. Euthanaseer de muis door CO2 -verstikking en verifieer met behulp van cervicale dislocatie. Vanaf deze stap moeten alle procedures worden uitgevoerd met steriele ontleedinstrumenten.
  2. Fixeer de muis en spuit de buik in met 70% ethanol. Maak met een schaar en pincet een V-vormige incisie van 2,5 cm in het genitale gebied en ga omhoog om de buikholte volledig te openen.
  3. Zoek de maag aan de linkerkant van de muis. Zoek de alvleesklier, die zich in de buurt van de milt bevindt. Scheid de alvleesklier van de maag en de twaalfvingerige darm met behulp van twee pincetten (zonder te scheuren). Ga verder en scheid de alvleesklier van de dunne darm, het jejunum en het ileum.
  4. Verplaats de alvleesklier naar de rechterkant van de muis. Scheid de resterende verbindingen tussen de alvleesklier en de borstholte met een tang om de alvleesklier en de aangehechte milt volledig los te maken.
  5. Verwijder de alvleesklier en spreid deze uit voor onderzoek in een petrischaal op ijs.
    OPMERKING: Tijdens deze stap moet ervoor worden gezorgd dat alleen de alvleesklier wordt verwijderd en niet mesenterisch vetweefsel of ander aangrenzend weefsel samen met de alvleesklier, om cellulaire besmetting te voorkomen.

2. Enzymatische en mechanische dissociatie van de alvleesklier

  1. Bereid de volgende buffers van tevoren voor.
    1. Dissociatiebuffer 1: 4 ml trypsine C + 6 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (zie tabel 1) voor elk monster.
    2. Dissociatiebuffer 2: 9 ml Hanks′ gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) 1x; 4% runderserumalbumine (BSA); 1 ml collagenase P (10 mg/ml); 200 μL trypsineremmer (10 mg/ml); en 200 μL DNase I (10 mg/ml) (zie tabel 1).
    3. Wasbuffer: 50 ml HBSS 1x; 2 g BSA; 1 ml trypsineremmer (10 mg/ml); en 1 ml DNase 1 (10 mg/ml).
    4. Enzymactiviteitstopoplossing: HBSS 1x met 5% foetaal runderserum (FBS) en 150 g DNase I (0,2 mg/ml).
  2. Plaats de alvleesklier in een buis van 50 ml op ijs. Spoel de alvleesklier in 1x, 10% FBS in HBSS. Het vetweefsel gaat drijven en de alvleesklier zinkt. Dit is een gemakkelijke manier om het vervuilende witte vetweefsel dat nog aan de alvleesklier vastzit, te visualiseren en snel te verwijderen.
  3. Breng het alvleesklierweefsel van de muis over in een steriele petrischaal met 5 ml HBSS 1x op ijs. Knip de alvleesklier in kleine stukjes van 1 tot 3mm3 met een Noyes-schaar en een scalpel (figuur 2A). In het geval van meer dan één monster moeten de monsters op ijs worden bewaard in 10% FBS/HBSS 1x.
  4. Breng de weefsels over in een centrifugebuis. Centrifugeer bij 350 x g bij 4 °C gedurende 5 min. Zuig het supernatans op en gooi het weg om celfragmenten en bloedcellen te verwijderen.
  5. Resuspendeer de stukken in dissociatiebuffer 1 met 0,02% trypsine C-0,05% EDTA gedurende 10 minuten bij 37 °C met agitatie (180 rpm). Onmiddellijk wassen met 10% FBS/Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 g bij 4 °C.
  6. Opnieuw wassen door de pellet opnieuw te suspenderen in 10 ml wasbuffer en te centrifugeren op 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C vóór de volgende dissociatiestap.
  7. Incubeer de alvleesklier in dissociatiebuffer 2 gedurende 15 minuten bij 37 °C met agitatie (180 rpm).
  8. Voer na 15 minuten mechanische dissociatie uit door de pancreasfragmenten 10 keer krachtig op en neer te pipetteren in steriele pipetten van afnemende grootte (serologische pipetten van 25, 10 en 5 ml) en breng terug naar 37 °C.
    1. Herhaal na nog eens 5 minuten de mechanische dissociatie en gebruik lichtmicroscopie om de dissociatie te controleren op basis van de hoeveelheid eencellige suspensie. Als in dit stadium minder dan 90% van de suspensie uit geïsoleerde afzonderlijke cellen bestaat, is meestal een langere incubatietijd nodig. Gebruik trypan blue om de levensvatbaarheid van de cel te controleren.
    2. Ga door met de incubatie en neem elke 5 minuten monsters om de dissociatie te detecteren.
      OPMERKING: De totale incubatietijd is afhankelijk van het weefsel en kan per monster verschillen. De incubatie en weefseldissociatie moeten eindigen wanneer 90% van de cellen in afzonderlijke cellen is gescheiden of wanneer een vermindering van de levensvatbaarheid wordt vastgesteld.
  9. Nadat het pancreasweefsel goed is gedissocieerd (overeenkomend met het verdwijnen van pancreasfragmenten en de toenemende troebelheid van de oplossing) (Figuur 2), stopt u de enzymatische reactie door tweemaal te wassen met enzymactiviteit, stop de oplossing gedurende 5 minuten bij 4 °C. Houd vanaf deze stap de celsuspensie op ijs.
  10. Haal de celsuspensie door een nylon gaas van 70 μm en controleer de levensvatbaarheid van de cel onder de microscoop. Kleinere maten nylon gaas kunnen de levensvatbaarheid van de cel verminderen.
  11. Resuspendeer en was de pellet met 5-10 ml ijskoude gebufferde wasoplossing. Tel de cellen.
  12. Als er meerdere rode bloedcellen worden waargenomen, behandel de cellen dan gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur met een lysebuffer voor rode bloedcellen. In gevallen waarin klonters worden waargenomen, moet het monster opnieuw worden behandeld met trypsine, zoals beschreven in stap 2.5. De levensvatbaarheid wordt gedetecteerd met trypanblauw onder de microscoop en als de levensvatbaarheid minder dan 80% is, moeten levende cellen worden geïsoleerd met behulp van de magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) dode cellen verwijderingskit met MACS MS-kolommen (zie tabel 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In een recent gepubliceerd werk5 hebben we het hierboven beschreven protocol toegepast om de vroege stadia van PDAC-ontwikkeling te verkennen met behulp van een muismodel. De muis werd genetisch gemanipuleerd om de cassettes Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7 op te nemen, die de expressie van constitutief actieve KRAS in acinaire cellen na tamoxifen-injectie mogelijk maken.

Na cervicale disloca...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel presenteren we een protocol voor dissociatie van pancreasweefsel. Het protocol is eenvoudig, gebruiksvriendelijk en biedt een hulpmiddel om levensvatbare afzonderlijke cellen uit pancreasweefsel te isoleren in verschillende stadia tijdens het maligniteitsproces, inclusief solide tumoren. In eerdere studies werden verschillende soorten collagenasen gebruikt om de alvleesklier te verteren 8,9. Het gebruik van een zeer krachtig collagenase, zoals coll...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Dr. Avital Sarusi-Portuguez bedanken voor zijn hulp bij de data-analyse en Dr. Dror Kolodkin-Gal voor zijn hulp bij het opstellen van het protocol in een eerdere studie. We danken alle voormalige en huidige leden van het Parnas-lab. We danken Dr. Gillian Kay en Dr. Michael Kanovsky voor hun hulp bij het bewerken. Dit project is gefinancierd door de Israel Science Foundation-subsidie (nr. 526/18 O.P.), het Alex U. Soyka-programma en een subsidie van het Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens of Bronnen
70 µm nylon gaas Corningcat##431751
BSASigma Aldrichcat# A7906
Collagenase PRochecat# 11213857001
Kritieke commerciële test
DAPISigma Aldrichcat#MBD0015
Dnase IRochecat# 10104159001
Experimentele modellen: organismen/stammen
Fetaal bovien serum Zuid-AmerikaansThermoFisherCat#10270106
Hanks' Balanced Salt SolutionBiologische industrieëncat#02-018-1A 
KRASLSL-G12D muizenJackson LaboratoryJAX008179
MACS dode cellen verwijderingskitMilteny Bioteccat#130-090-101
PBSBiologische industrieëncat#02-023-1A 
Ptf1a-CreER muizenJackson LaboratoryJAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdTomato muizenJackson LaboratoryJAX007908
Trypsine C-EDTA 0,05%Biologische industrieëncat# 03-053-1A
Trypsine remmerRochecat#T6522

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
  2. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  3. Peng, J., et al. Author correction: single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Research. 29 (9), 777(2019).
  4. Hruban, R. H., Wilentz, R. E., Kern, S. E. Genetic progression in the pancreatic ducts. The American Journal of Pathology. 156 (6), 1821-1825 (2000).
  5. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nature Communications. 11 (1), 4516(2020).
  6. Kolodkin-Gal, D., et al. Senolytic elimination of Cox2-expressing senescent cells inhibits the growth of premalignant pancreatic lesions. Gut. 71 (2), 345-355 (2021).
  7. Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
  8. Elyada, E., et al. Cross-species single-cell analysis of pancreatic ductal adenocarcinoma reveals antigen-presenting cancer-associated fibroblasts. Cancer Discovery. 9 (8), 1102-1123 (2019).
  9. Bernard, V., et al. Single-cell transcriptomics of pancreatic cancer precursors demonstrates epithelial and microenvironmental heterogeneity as an early event in neoplastic progression. Clinical Cancer Research. 25 (7), 2194-2205 (2019).
  10. Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nature Biotechnology. 38 (3), 333-342 (2020).
  11. Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptome profiling of pancreatic cancer identifies multicellular dynamics associated with neoadjuvant treatment. Nature Genetics. 54 (8), 1178-1191 (2022).
  12. Cui Zhou, D., et al. Spatially restricted drivers and transitional cell populations cooperate with the microenvironment in untreated and chemo-resistant pancreatic cancer. Nature Genetics. 54 (9), 1390-1405 (2022).
  13. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van enkelcellenlevensvatbaarheid van acinaire cellenpancreastumorcellenprotocol voor weefseldissociatiemechanische dissociatieenzymatische digestiebeoordeling van cellevensvatbaarheidfluorescence activated cell sortingsingle cell RNA sequencing

Gerelateerde artikelen