Methodenartikel

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

DOI:

10.3791/64874

⸱

19 mei 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC's) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritische cellen (DC's) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC's) binnen het immuunsysteem. Ze patrouilleren in het organisme op zoek naar ziekteverwekkers en spelen een unieke rol binnen het immuunsysteem door de aangeboren en adaptieve immuunresponsen te koppelen. Deze cellen kunnen fagocytiseren en vervolgens gevangen antigenen presenteren aan effector-immuuncellen, waardoor een breed scala aan immuunresponsen wordt geactiveerd. Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van van runderen monocyten-afgeleide dendritische cellen (MoDC's) geïsoleerd uit perifere bloedmononucleaire cellen van runderen (PBMC's) en hun toepassing bij het evalueren van vaccinimmunogeniciteit.

Magnetische celsortering werd gebruikt om CD14+ monocyten uit PBMC's te isoleren, en de suppletie van compleet kweekmedium met interleukine (IL)-4 en granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) werd gebruikt om de differentiatie van CD14+ monocyten in naïeve MoDC's te induceren. De generatie van onrijpe MoDC's werd bevestigd door het detecteren van de expressie van belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC II), CD86 en CD40 celoppervlakmarkers. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin werd gebruikt om de onrijpe MoDC's te pulseren, die vervolgens samen met naïeve lymfocyten werden gekweekt.

De flowcytometrie-analyse van de antigeen-gepulseerde MoDC's en lymfocytenco-cultuur onthulde de stimulatie van T-lymfocytenproliferatie door de expressie van Ki-67-, CD25-, CD4- en CD8-markers. De analyse van de mRNA-expressie van IFN-γ en Ki-67, met behulp van kwantitatieve PCR, toonde aan dat de MoDC's de antigeenspecifieke priming van lymfocyten in dit in vitro co-cultuursysteem konden induceren. Bovendien toonde IFN-γ secretie beoordeeld met behulp van ELISA een significant hogere titer (**p < 0,01) in de rabiësvaccin-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur dan in de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur. Deze resultaten tonen de validiteit van deze in vitro MoDC-test om vaccinimmunogeniciteit te meten, wat betekent dat deze test kan worden gebruikt om potentiële vaccinkandidaten voor runderen te identificeren voordat wordt overgegaan tot in vivo onderzoeken, evenals in vaccinimmunogeniciteitsbeoordelingen van commerciële vaccins.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veterinaire vaccinatie is een cruciaal aspect van de veehouderij en gezondheid, omdat het bijdraagt aan het verbeteren van de voedselzekerheid en het dierenwelzijn door bescherming te bieden tegen ziekten die de veehouderij wereldwijd treffen1. Een effectieve in vitro methode om de immunogeniciteit van mogelijke vaccinkandidaten te beoordelen, zou het proces van vaccinontwikkeling en -productie helpen versnellen. Het is daarom noodzakelijk om het veld van immuuntesten uit te breiden met innovatieve methodologieën op basis van in vitro studies, omdat dit zou helpen om de complexiteit van de immuunprocessen met betrekking tot immunisatie en pathogene infectie te onthullen. Momenteel worden in vivo immunisatie- en challengestudies bij dieren, die periodieke bemonstering vereisen (bijv. Bloed en milt), gebruikt om de immunogeniciteit van kandidaat-vaccins en adjuvantia te meten. Deze testen zijn duur, tijdrovend en hebben ethische implicaties, omdat in de meeste gevallen euthanasie bij dieren wordt uitgevoerd aan het einde van de proeven.

Als alternatief voor in vivo assays zijn perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) gebruikt om vaccin-geïnduceerde immuunresponsen in vitrote evalueren 2. PBMC's zijn een heterogene populatie van cellen die bestaat uit 70% -90% lymfocyten, 10% -20% monocyten en een beperkt aantal dendritische cellen (DC's, 1% -2%)3. PBMC's herbergen antigeen-presenterende cellen (APC's) zoals B-cellen, monocyten en DC's, die voortdurend patrouilleren in het organisme op zoek naar tekenen van infectie of weefselbeschadiging. Lokaal uitgescheiden chemokines vergemakkelijken de rekrutering en activering van APC's naar deze plaatsen door zich te binden aan celoppervlakreceptoren. In het geval van monocyten richten chemokines hun lot om te differentiëren in DC's of macrofagen4. Zodra DC's een pathogeen tegenkomen en vangen, migreren ze naar secundaire lymfoïde organen, waar ze de verwerkte pathogene peptide-antigenen kunnen presenteren met behulp van major histocompatibility complex (MHC) klasse I of klasse II oppervlakte-eiwitten aan respectievelijk CD8 + T-cellen of CD4 + T-cellen, waardoor een immuunrespons 5,6 wordt geactiveerd.

De sleutelrol die DC's spelen bij het orkestreren van een beschermende immuunrespons tegen verschillende pathogenen maakt ze een interessant onderzoeksdoel voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, vooral bij het ontwerpen van vaccins en adjuvantia tegen infectieuze agentia7. Aangezien de fractie van DC's die kan worden verkregen uit PBMC's vrij klein is (1%-2%), zijn monocyten in plaats daarvan gebruikt om DC's in vitro8 te genereren. Deze van monocyten afgeleide DC's (MoDC's) werden aanvankelijk ontwikkeld als een mogelijke behandelingsstrategie in kankerimmunotherapie9. Meer recent zijn MoDC's gebruikt voor vaccinonderzoek 10,11,12, en klassieke monocyten zijn het overheersende subtype (89%) voor MoDC-productie 13. De productie van MoDC's in vitro is eerder bereikt door de toevoeging van granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) gegeven in combinatie met andere cytokines zoals interleukine-4 (IL-4), tumornecrosefactor α (TNF-α) of IL-1314,15,16.

Het succes van een in vitro MoDC-test is afhankelijk van het vermogen van antigeen-gestimuleerde volwassen MoDC's om de omvang en het type van de immuunrespons te moduleren die specifiek zijn voor het type antigeen dat is gedetecteerd17. Het type pathogeen dat door MoDC's wordt herkend en gepresenteerd, bepaalt de differentiatie van CD4 + T-helper (Th) -cellen in Th1-, Th2- of Th17-effectorcellen en wordt gekenmerkt door een pathogeenspecifiek secretoir cytokineprofiel. Een Th1-respons wordt opgewekt tegen intracellulaire pathogenen en resulteert in de secretie van interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor bèta (TNF-β), die fagocytisch-afhankelijke bescherming moduleert. Een Th2-respons wordt geactiveerd tegen parasitaire organismen en wordt gekenmerkt door IL-4, IL-5, IL-10 en IL-13-secretie, die fagocytisch-onafhankelijke humorale bescherming initieert. Th17 biedt neutrofielafhankelijke bescherming tegen extracellulaire bacteriële en schimmelinfecties gemedieerd door de secretie van IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 en TNF-α 18,19,20,21. Op basis van eerdere studies is opgemerkt dat niet alle pathogenen binnen het verwachte cytokineprofiel vallen. Dermale MoDC's stimuleren bijvoorbeeld, als reactie op leishmania parasitaire infectie, IFN-γ secretie van CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen, waardoor een beschermende pro-inflammatoire Th1-respons wordt geïnduceerd22.

Het is ook aangetoond dat MoDC's bij kippen die zijn geprimed met Salmonella lipopolysaccharide (LPS), een variabele respons tegen Salmonella typhimurium kunnen induceren door zowel Th1- als Th2-responsen te activeren, terwijl Salmonella gallinarum alleen een Th2-respons induceert, wat de hogere weerstand van de laatste tegen MoDC-klaring23 zou kunnen verklaren. De activering van MoDC's tegen Brucella canis (B. canis) is ook gemeld in zowel honden- als menselijke MoDC's, wat betekent dat dit een zoönotisch infectiemechanisme kan vertegenwoordigen24. Menselijke MoDC's geprimed met B. canis induceren een sterke Th1-respons die weerstand biedt tegen ernstige infectie, terwijl Canine MoDC's een dominante Th17-respons induceren met een verminderde Th1-respons, wat vervolgens leidt tot de oprichting van chronische infectie25. Runder-MoDC's vertonen een verhoogde affiniteit voor mond- en klauwzeervirus (FMDV) geconjugeerd met immunoglobuline G (IgG) in vergelijking met niet-geconjugeerde FMDV alleen, aangezien de MoDC's een viraal antilichaamcomplex vormen als reactie op de eerste10. Samen laten deze studies zien hoe MoDC's zijn gebruikt om de complexiteit van immuunresponsen tijdens pathogene infectie te analyseren. De adaptieve immuunresponsen kunnen worden geëvalueerd door de kwantificering van specifieke markers geassocieerd met lymfocytenproliferatie. Ki-67, een intracellulair eiwit dat alleen in delende cellen wordt gedetecteerd, wordt beschouwd als een betrouwbare marker voor proliferatiestudies26, en evenzo komt CD25 uitgedrukt op het oppervlak van T-cellen tijdens de late fase van activering overeen met lymfocytenproliferatie27,28.

Deze studie toont een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van runder-MoDC's, gevolgd door hun toepassing in een in vitro immuuntest die wordt gebruikt voor het testen van de immunogeniciteit van vaccins. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin (RV) werd gebruikt om de werkzaamheid van deze test te valideren. T-lymfocytenactivatie en -proliferatie werden gemeten door flowcytometrie, real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) door de analyse van gevestigde celactivatiemarkers zoals Ki-67 en CD25 en de secretie van IFN-γ 28,29,30,31. Er worden geen dier- of menselijke experimentele proeven uitgevoerd tijdens de MoDC-test.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bloedafname wordt uitgevoerd door een gecertificeerde dierenarts in overeenstemming met de ethische richtlijnen van het Oostenrijkse Agentschap voor Gezondheid en Voedselveiligheid (AGES) en in overeenstemming met de geaccepteerde dierenwelzijnsnormen32. De studie kreeg ethische goedkeuring van het Oostenrijkse ministerie van Landbouw. Het experimentele ontwerp voor het genereren van MoDC's en de daaropvolgende toepassing ervan wordt geïllustreerd in figuur 1.

1. Productie van naïeve MoDC's

OPMERKING: Volbloedmonsters werden verkregen van een enkel pathogeenvrij kalf door jugulaire aderpunctie met gehepariniseerde vacutainers (acht bloedbuizen van 9 ml werden gebruikt voor deze studie). Transporteer het bloed in een ijskist. Bewaar de monsters bij 2-4 °C voor later gebruik of verwerk ze onmiddellijk. Houd het bloed draaiende om bloedstolling te voorkomen. Steriliseer de vacutainers met 70% ethanol. Alle volgende experimenten werden uitgevoerd met één biologisch monster en zes technische replicaties.

  1. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie om PBMC's te isoleren uit het gehepariniseerde bloed
    1. Meng het bloed goed door het 10x om te keren.
    2. Breng met behulp van een pipet van 10 ml 20 ml gehepariniseerd bloed over naar een steriele buis van 50 ml en verdun deze met 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    3. Pipetteer 15 ml lymfocytenisolatiemedium tot een steriele buis van 50 ml.
      OPMERKING: Laat het lymfocytenisolerende medium op kamertemperatuur komen voordat u gaat pipetteren.
    4. Kantel de buis van 50 ml met het lymfocytenisolatiemedium in een positie van 45°. Richt de punt van een pipet van 25 ml loodrecht en leg de 30 ml bloed-PBS voorzichtig op het lymfocytenisolatiemedium, zonder de twee te mengen. Breng heel langzaam de buis van 50 ml terug naar een verticale positie.
    5. Centrifugeer bij 800 × g gedurende 35 minuten bij 20 °C bij maximale acceleratie en zonder remmen (vertragingsfunctie uitgeschakeld).
    6. Gebruik een Pasteur-pipet om de PBMC-laag (de dunne witte laag direct na de eerste laag plasma) te verzamelen en over te brengen in een nieuwe buis van 50 ml.
      OPMERKING: Dichtheidsgradiëntcentrifugatie scheidt volbloed in verschillende lagen. Als gevolg hiervan bezinken de erytrocyten aan de onderkant als een pellet, de mononucleaire cellen (PBMC's) bezinken op de interfacelaag en vormt het plasma de bovenste laag. Granulocyten worden gevonden tussen de pellet en de PBMC-laag.
    7. Was de geoogste PBMC's 2x door PBS toe te voegen tot een volume van 40 ml en meng grondig door op en neer te pipetteren. Centrifugeer vervolgens gedurende 7 minuten bij 500 × g bij 4 °C met maximale versnelling en maximale vertraging.
    8. Gooi het supernatant weg door decantatie, resuspensie van de pellet in 15 ml 1x ammoniumchloride-kalium (ACK) buffer en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
      OPMERKING: Incubeer niet langer dan 15 minuten. In de handel verkrijgbare ACK-buffer wordt gebruikt om de lysis van de resterende rode bloedcellen (RBC's) in de PBMC-fractie te waarborgen.
    9. Voeg PBS toe tot een volume van 40 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 7 minuten bij 500 × g en 4 °C met maximale versnelling en vertraging.
    10. Gooi het supernatant weg door te decanteren en herhaal stap 1.1.9.
    11. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 10 ml volledig kweekmedium (bij kamertemperatuur).
      OPMERKING: Het volledige kweekmedium bestaat uit RPMI 1640 celkweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Magnetische scheiding van de CD14+/− cellen van de PBMC-populatie met behulp van CD14-geconjugeerde magnetische kralen
    1. Tel de cellen met een schone hemocytometer celteller met behulp van 10 μL celsuspensie gemengd met 10 μL trypan blauwe (0,4%) oplossing.
      OPMERKING: Trypan blauwe kleurstof is een giftige chemische stof en potentieel carcinogeen. Het moet worden gehanteerd terwijl u persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) draagt om contact te voorkomen, en afval moet worden weggegooid in een luchtdichte gespecialiseerde container voor giftig afval. Dode cellen zullen blauw lijken, terwijl levende cellen helder onder de microscoop zullen verschijnen.
    2. Centrifugeer gedurende 7 minuten bij 500 × g.
    3. Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet en resuspensie van de pellet in fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuffer (FACS) met een volume van 40 μL voor elke 1 × 107 cellen. Meng grondig met behulp van een pipet.
      OPMERKING: FACS-buffer bestaat uit 2% FBS en 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) opgelost in PBS.
    4. Voeg 5 μL CD14 microbeadbuffer per 1 × 107 cellen toe en meng grondig met een pipet.
    5. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4-8 °C voor de positieve selectie van runder-CD14+ monocyten33. Vortex elke 15 minuten tijdens de incubatietijd.
    6. Optionele stap (voor flowcytometrie-analyse): Voeg 10 μL CD14-FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) kleuringsantilichaam toe met daaropvolgende incubatie gedurende 15 minuten bij 4-8 °C. Raadpleeg de flowcytometrie-analyse in stap 5 voor meer informatie.
    7. Voeg 1 ml FACS-buffer toe en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 500 × g.
    8. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 500 μL FACS-buffer per 1 ×10 8 cellen.
    9. Plaats de immunomagnetische celscheidingskolom in de separator (magnetische kolomhouder) en plaats een opvangbuis van 15 ml onder de kolomuitlaat voor het opvangen van de doorstroming.
    10. Was de kolom met 1 ml ontgaste FACS-buffer. Vervang na het spoelen de gebruikte buis van 15 ml door een nieuwe.
    11. Laat de celsuspensie (vanaf stap 1.2.8) door de kolom gaan door 1 × 108 cellen in 500 μL buffer per keer te pipetteren.
      OPMERKING: Let op dat u geen luchtbellen genereert tijdens het mengen van de cellen voordat u ze door de kolom laat.
    12. Spoel de kolom 3x af met telkens 3 ml ontgaste FACS-buffer.
    13. Verzamel de doorstroming en label deze eerste geëlueerde fractie als de CD14− -celfractie (PBMC's minus CD14+ monocyten); Dit wordt ook wel de naïeve lymfocytenfractie genoemd.
      OPMERKING: De CD14− -cellen worden in volledig kweekmedium bewaard totdat antigeengepulseerde MoDC's worden geproduceerd.
    14. Verwijder de kolom uit het scheidingsteken.
    15. Plaats een nieuwe steriele buis van 15 ml onder de kolom voor het opvangen van het effluent.
    16. Pipetteer 5 ml FACS-buffer in de kolom en duw deze er onmiddellijk doorheen met een zuiger.
    17. Verzamel de doorstroming en label deze tweede geëlueerde fractie als de CD14+ celfractie; Dit wordt ook wel de naïeve monocytenfractie genoemd.
    18. Voeg een compleet kweekmedium toe aan de geoogste CD14+ monocyten om 1 × 106 cellen/ml te verkrijgen.
      OPMERKING: Tel de levende cellen in de geëlueerde CD14+ celfractie om het volume van het volledige kweekmedium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken.
    19. Neem een steriele plaat met 24 putten en voeg 1 ml van de celsuspensie (1 × 106 cellen / ml) toe aan elke put.
  3. Differentiatie van de CD14+ naïeve monocyten in naïeve MoDC's door toevoeging van 3% w/v cytokinecocktail (GM-CSF + IL-4) met in totaal 5 dagen incubatie
    1. Vul elke put met CD14+ monocyten aan met 40 μL (3% m/v) van de cytokinecocktail in de kit.
    2. Incubeer de plaat in een bevochtigde incubator met 5% CO2 en bij 37 °C gedurende 48 uur.
    3. Breng op dag 2 de helft van de inhoud van elke put (500 μL) met behulp van een pipet over in afzonderlijke buizen van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 500 × g bij 4 °C.
    4. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 500 μL vers volledig kweekmedium.
    5. Breng 500 μL van deze celsuspensie van stap 1.3.4 terug naar elke aangewezen put, zodat het uiteindelijke volume 1 ml is.
    6. Verrijk elk putje met 20 μL cytokinecocktail.
    7. Incubeer de kweek gedurende 72 uur in een bevochtigde incubator met 5% CO2 en bij 37 °C.
    8. Verwijder na de incubatie op dag 5 de plaat uit de couveuse.
      OPMERKING: Elke put bevat 1 ml van een celsuspensie van naïeve MoDC's. Het aantal MoDC's is een percentage (~20%) van de oorspronkelijke monocyten (1 × 106/ml).

2. MoDC endocytische activiteit assay

OPMERKING: De antigeenopnametest of endocytische activiteitstest meet het vermogen van naïeve MoDC's om vreemd materiaal te internaliseren. Voer de test uit met naïeve MoDC's gekweekt met 3% w / v cytokinecocktail en met 5 dagen incubatie, zoals eerder beschreven34.

  1. Oogst de naïeve MoDC-celsuspensie van de 24-putplaat en breng deze over naar een buis van 15 ml; verzamel ook eventuele resterende cellen door de putten te spoelen met PBS.
  2. Centrifugeer gedurende 500 × g gedurende 7 min. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 1 ml kweekmedium aangevuld met 1% FBS.
  3. Tel de levende MoDC-cellen om het volume medium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken (2 × 105 cellen/ml).
  4. Kweek de naïeve MoDC's in 100 μL volledig kweekmedium in een 24-well plaat met een uiteindelijke celconcentratie van 2 × 105 cellen/ml.
  5. Vul elke put aan met 1 mg / ml FITC-geconjugeerd dextran (fluorescerende sonde gebruikt als de endocytose tracer).
    OPMERKING: De FITC-dextran werkt als een fluorescerende sonde en wordt gebruikt als een endocytose tracer.
  6. Dek de plaat af en incubeer in het donker bij 5% CO2 en 37 °C gedurende 60 min.
    OPMERKING: Incubeer voor de achtergrondcontrole de extra MoDC-cellen (2 × 105 cellen / ml) met 1 mg / ml FITC-dextran op ijs, omdat dit type incubatie voorkomt dat het tracermolecuul (FITC-dextran) in de cellen binnendringt.
  7. Breng na incubatie onmiddellijk de 24-putplaat op ijs over om de endocytose van FITC-dextran te stoppen.
  8. Was de cellen met ijskoude FACS-buffer.
  9. Oogst, centrifugeer en resuspensie van de pellet in 500 μL FACS-buffer.
  10. Analyseer de fluorescentie-intensiteit van het FITC-dextran in de cellen met behulp van flowcytometrie. Raadpleeg de flowcytometrie-analyse in stap 5.2 voor meer informatie.

3. Generatie van antigeen-gepulseerde MoDC's

OPMERKING: Een commercieel verkrijgbaar en klinisch goedgekeurd vaccin tegen rabiësvirus (RV) kan de differentiatie van naïeve MoDC's in volwassen antigeen-presenterende MoDC's induceren. Gebruik 0,1% (~ 1 μL) van een enkele RV-vaccinatiedosis om antigeen-gepulseerde MoDC's te genereren. Bovendien verdient het de voorkeur om RV-gepulste MoDC's te produceren in dezelfde kweekplaat die wordt gebruikt (in stap 1.3.8) om naïeve MoDC's te genereren, omdat het overbrengen van de naïeve MoDC's naar een nieuwe 24-putplaat een negatief effect op hen zal hebben.

  1. Vanaf stap 1.3.8) Voeg 1 μL/ml RV-suspensie toe aan 1 ml naïeve MoDC-cultuur in de 24-putplaat en incubeer gedurende 48 uur bij 5% CO2 en 37 °C.
    OPMERKING: Naïeve MoDC's gekweekt zonder RV-stimulatie worden gebruikt als achtergrondcontrole (en als niet-specifieke stimulatie voor co-cultuur met lymfocyten in de volgende stappen).
  2. Houd na incubatie, op dag 7, de 24-putplaat met de antigeen-gepulseerde MoDC's gedurende 10 minuten op ijs.
  3. Voeg 1 ml ijskoude PBS per put toe. Meng elk goed grondig door pipetteren en breng de suspensie over in een buis van 15 ml.
  4. Was de putjes met 2 ml ijskoude PBS om de resterende cellen in elke put te verzamelen.
  5. Breng de inhoud over in hun respectievelijke buizen en centrifugeer de celsuspensie gedurende 7 minuten op 500 × g .
  6. Gooi het supernatant weg, resuspendien de celkorrel (antigeengepulseerde MoDC's) in volledig kweekmedium en pas het volume aan tot een uiteindelijke celconcentratie van 1 × 105 cellen/ml.
    OPMERKING: Tel de levende cellen om het volume van het medium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken. Gebruik RV-gepulseerde MoDC's vanaf dag 7 voor het MoDC-lymfocyt co-cultuur systeem.

4. MoDC-lymfocyten co-cultuur

OPMERKING: Het in vitro MoDC-lymfocytencocultuursysteem bepaalt het vermogen van MoDC's om antigeenspecifieke lymfocyten te primen. De verschillende behandelingsgroepen van cellen na 16 dagen co-cultuur omvatten specifieke, niet-specifieke en controle. De specifieke groep wordt gedefinieerd als lymfocyten die samen met RV-gepulseerde MoDC's zijn gekweekt; de niet-specifieke groep wordt gedefinieerd als lymfocyten die samen met niet-antigeengepulseerde MoDC's worden gekweekt; en de controlegroep wordt gedefinieerd als lymfocyten gekweekt zonder MoDC's.

  1. Voeg een volledig kweekmedium toe aan de geëlueerde naïeve lymfocytenfractie (CD14− cellen) om een celconcentratie van 2 × 106 cellen/ml te bereiken.
    OPMERKING: Tel de levende cellen in de CD14− -celcultuur die sinds hun verzameling in een volledig kweekmedium in een 24-well-plaat zijn bewaard om het volume medium te schatten dat nodig is om het gewenste celgetal te bereiken.
  2. Neem op dag 7 een steriele plaat met 24 putten en zaai de putjes in met 1 ml naïeve lymfocytencelsuspensie (2 × 106 cel / ml) plus 1 ml antigeen-gepulseerde of niet-antigeen-gepulste MoDC-suspensie (1 × 105 cel / ml).
    OPMERKING: Het totale volume in elke put is 2 ml met een verhouding van 1:20 MoDC's tot lymfocyten per put.
  3. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  4. Kweekverrijking en -restimulatie met antigeen-gepulseerde MoDC's
    1. Na de incubatie van de antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur, op dag 9, vul elke put aan met 20 ng / ml recombinant IL-2 en blijf nog eens 120 uur incuberen (5 dagen incubatie).
    2. Breng op dag 14 1 ml van de co-cultuur over in een steriele buis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 7 minuten op 500 × g .
    3. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de celpellet met 1 ml antigeen-gepulseerde of niet-gepulseerde MoDC's (1 × 105 cel / ml). Meng voorzichtig door pipetteren en breng de celsuspensies terug naar hun aangewezen putjes.
      OPMERKING: Bij deze stap is het totale volume in elke put 2 ml.
    4. Ga door met incubatie bij 5% CO2 en 37 °C gedurende 48 uur. Na incubatie op dag 16 is de co-cultuur klaar voor analyse met behulp van flowcytometrie, qPCR en ELISA.
      OPMERKING: Voor elke 2 ml in elke put van de MoDC-lymfocytencocultuur wordt 1 ml geresuspendeerde cellen gekleurd voor flowcytometrie, 1 ml wordt gebruikt voor RNA-extractie en de supernatanten van beide worden gebruikt voor ELISA.

5. Flowcytometrische analyse

OPMERKING: Kleur de cellen met de juiste markers/mAb voordat u de monsters op een flowcytometer uitvoert. Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over de reagentia (kleuring mAb- en isotypecontroles), de kit, het instrument en de software die worden gebruikt voor de analyse van de flowcytometrie.

  1. Flow cytometer kleuringsprotocol
    OPMERKING: Voer celoppervlakkleuring uit voor de PBMC's en naïeve lymfocyten en monocyten met behulp van anti-CD14 mAb (stap 1.2.6). Gebruik voor de celoppervlakkleuring van naïeve MoDC's anti-CD86-specifieke, anti-CD40-specifieke en anti-MHC II-specifieke mAb. Gebruik voor de celoppervlakkleuring van cellen vanaf dag 16 co-culturen anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs; gebruik voor intracellulaire kleuring anti-Ki-67 mAb. Bovendien kleurt u de cellen met negatieve isotypecontrole mAb of zonder mAb (FMO: fluorescerend min één). Het belangrijkste verschil bij het kleuren voor oppervlakte- en intracellulaire markers is dat voor celoppervlakmarkers de cellen moeten worden gekleurd met specifieke oppervlakte-mAb voorafgaand aan levend / dood (L / D) kleuring of andere processen. Intracellulaire kleuring wordt echter uitgevoerd na L / D-kleuring en vereist een fixatie plus permeabilisatiestap om intracellulaire penetratie mogelijk te maken.
    1. Breng 1 ml celsuspensie over in een steriele buis van 1,5 ml met behulp van een pipet en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 × g.
      OPMERKING: Bewaar na centrifugatie bij het verwerken van de cellen uit de MoDC-lymfocytencocultuur het supernatant voor ELISA-analyse.
    2. Resuspensie van de pellet in 1 ml PBS en breng deze over in een buis van 15 ml. Verzamel de resterende cellen met behulp van 1 ml PBS en combineer dit met de geresuspendeerde pellet.
    3. Voeg 10 ml PBS toe aan de buis van 15 ml met de cellen, meng door pipetteren en centrifugeer gedurende 7 minuten bij 850 x g.
    4. Gooi het supernatant weg en herhaal stap 5.1.3.
    5. Gooi het supernatant weg en resuspensie de celkorrel voorzichtig met de resterende suspensie (ongeveer 180 μL) die overblijft na het decanteren van het supernatant.
    6. Breng de celophanging over op een V-bodem 96-putplaat en sluit de putten af om morsen te voorkomen.
    7. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten op 1.400 × g . Veeg na het centrifugeren de plaat over een afvalcontainer om de putten van vloeistof te legen en tik de plaat op absorberend papier om ervoor te zorgen dat overtollige vloeistof wordt verwijderd.
    8. Voeg 25 μL oppervlaktekleuringshoofdmengsel per put toe en meng voorzichtig met een pipet, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Om oppervlaktekleuringsmastermix voor een enkele put te bereiden, voegt u 2,5 μL oppervlakte-mAb toe aan 20 μL FACS-buffer.
    9. Voeg 200 μL FACS-buffer per put toe en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.400 × g . Na het centrifugeren leegt u de putten van vloeistof door te decanteren en tikt u de plaat op absorberend papier om overtollige vloeistof te verwijderen.
    10. Voeg 100 μL L/D-kleuringsoplossing per put toe. Meng grondig met een pipet, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 15 minuten in het donker.
      OPMERKING: Los voor een enkele put 0,25 μL L/D-kleurstof op in 100 μL FACS-buffer. De L/D-kleurstof helpt onderscheid te maken tussen levende en dode cellen.
    11. Voeg 100 μL FACS-buffer toe. Bedek de putjes met het deksel en centrifugeer de plaat gedurende 1.400 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    12. Herhaal stap 5.1.11.
    13. Voeg 50 μL fixatieoplossing per put toe (meegeleverd met de kit) en meng met een pipet voordat u de plaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker incubeert.
    14. Voeg 150 μL van de 1x permeabilisatie-wasbuffer (PW) toe die bij de kit is geleverd en bedek de putjes met het deksel.
      OPMERKING: Om 10 ml 1x PW-buffer te bereiden, verdunt u 1 ml 10x permanentbuffer in 10 ml dH2O.
    15. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 1.400 × g bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    16. Voeg 200 μL 1x PW toe, gevolgd door centrifugeren bij 1.400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    17. Voeg voor intracellulaire kleuring 25 μL intracellulaire kleuringsmastermix (anti-humane Ki-67 mAb) per put toe. Meng goed en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 4 °C of op ijs in het donker.
      OPMERKING: Om intracellulaire kleuringsmastermix voor een enkele put te bereiden, voegt u 1 μL Ki-67 mAb toe aan 24 μL 1x PW. De intracellulaire kleuringsmarker wordt alleen gebruikt bij het verwerken van cellen vanaf dag 16 co-cultuur. Intracellulaire kleuring wordt niet gedaan tijdens het verwerken van PBMC's, naïeve lymfocyten, monocyten en naïeve MoDC's.
    18. Voeg na incubatie 200 μL 1x PW toe aan elke put. Meng met een pipet en centrifugeer gedurende 1.400 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    19. Voeg 200 μL FACS-buffer toe, gevolgd door centrifugeren bij 1.400 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door te decanteren en tik op de plaat op absorberend papier.
    20. Resuspendie van de celpellet in 200 μL FACS-buffer en breng de inhoud van elke put over naar afzonderlijke steriele flowcytometerbuizen. Gebruik 300 μL FACS-buffer per put om de resterende cellen te verzamelen. De cellen zijn nu klaar voor flowcytometrie-analyse.
  2. Het monster uitvoeren op een flowcytometer
    OPMERKING: De monsters werden uitgevoerd op een flowcytometer (met behulp van 488 nm, 638 nm en 405 nm lasers) volgens de handleiding van de fabrikant35. Raadpleeg de handleiding voor meer informatie, probleemoplossing en aanpassing van het protocol.
    1. Voer routinematige reinigingsprocedures uit voor en na het lezen van de monsters.
      OPMERKING: Sla geen positie over tijdens het laden van de buizen in het instrument.
      1. Gebruik voor de reinigingscyclus in totaal vier buizen, waarbij de eerste buis een stroomreinigingsreagens bevat en de overige drie buizen dH2O bevatten; elke buis heeft 3 ml. Verkrijg tijdens de reinigingsrun gegevens met een gemiddeld debiet gedurende ongeveer 1 minuut door 100.000 gebeurtenissen per buis onder 330 V vast te leggen voor voorwaartse verstrooiing (FSC) tegen 265 V voor zijverstrooiing (SSC).
        OPMERKING: Er mogen geen vuil of cellulaire gebeurtenissen worden gemeld tijdens de reiniging; Als dit gebeurt, voert u de reinigingsstap opnieuw uit. Voor het uitvoeren van de monsters, moet u ervoor zorgen dat alle monsters zich in een homogene suspensie bevinden voordat u de gegevens ophaalt, omdat dit een nauwkeurige meting garandeert.
    2. Om de cytometer aan te sluiten en in te schakelen, klikt u op de toepassingsknop in de linkerhoek van de titelbalk. Selecteer in het vervolgkeuzemenu van de toepassing de optie Cytometrie en klik op de optie Inschakelen.
      OPMERKING: Vanuit het vervolgkeuzemenu van de toepassing kunnen gebruikers met de optie Openen door de voorgeprogrammeerde assays bladeren, terwijl gebruikers met de optie Nieuw protocol nieuwe protocollen kunnen maken.
    3. Laad in eerste instantie het negatieve controlemonster in de houder met meerdere buizen. Selecteer Nieuw protocol en bekijk de werklijst aan de linkerkant van de werkruimte/het scherm.
    4. Definieer op de werklijst de positie van het monster in de houder met meerdere buizen en geef een naam aan het monster en het protocol voor identificatie.
    5. Pas in het hardwarepaneel aan de linkerkant van de werkruimte meerdere parameters aan en selecteer deze, zoals de detectoren (FSC, SSC en 10 fluorescentiebereiken), de spanningen (V ) en winsten van de fotomultipliers en de gebiedshoogte-breedte (AHW) van het signaal.
      OPMERKING: De volgende instellingen voor de detectoren zijn geselecteerd op basis van het experiment en het gebruikte instrument: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Pas in het configuratiescherm voor instrumentacquisitie onder de titelbalk de gewenste opties aan voor debiet (gemiddeld), tijd (5 min) en gebeurtenissen (zie stap 5.2.8). Klik op de optie Single verwerven om het instrument in staat te stellen het monster te tekenen / uit te voeren en de real-time preview van de gedetecteerde gebeurtenissen weer te geven.
    7. Pas vanuit de real-time preview de drempel van fluorescentie (spanning en versterking) en celgrootte aan om uiteindelijk poorten rond de gewenste celpopulatie te tekenen terwijl cellulair puin wordt uitgesloten.
      OPMERKING: FSC helpt om cellen te onderscheiden op basis van grootte, waardoor gebruikers onderscheid kunnen maken tussen cellen van het immuunsysteem, zoals monocyten en lymfocyten; monocyten zijn groter en vertonen een hogere FSC-intensiteit in vergelijking met lymfocyten.
    8. Verkrijg in totaal ongeveer 5.000 live MoDC, 50.000 live lymfocyten en 50.000 live monocytengebeurtenissen.
    9. Zodra alle parameters zijn aangepast met betrekking tot het negatieve controlemonster, klikt u op Stoppen en slaat u het protocol op.
    10. Laad nu alle monsters op de multi-tube lader. Definieer elk voorbeeld in de werklijst en pas de parameters die zijn aangepast met betrekking tot het negatieve besturingselement toe op alle monsters in het experiment. Klik op de optie Verkrijgen om alle voorbeelden in het experiment achtereenvolgens uit te voeren.
    11. Zodra de gegevens van alle monsters zijn verkregen, slaat u deze op en transformeert u deze in leesbare gegevens met behulp van een geschikte gegevensanalysesoftware waarmee sequentiële biparametrische en monoparametrische histogrammen kunnen worden gegenereerd.

6. Messenger RNA (mRNA) expressie analyse

  1. RNA-extractie
    OPMERKING: Extraheer totaal RNA uit de antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocyt co-cultuur (specifiek), de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocyt co-cultuur (niet-specifiek), de lymfocytencultuur zonder MoDC's (controle) en uit naïeve lymfocyten (CD14− cellen geïsoleerd voorafgaand aan co-kweek). Bereid voor de RNA-extractie ethanol met RNase-vrij water. Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over de extractiekit en reagentia.
    1. Breng 1 ml celsuspensie over van de MoDC-lymfocytencocultuurplaat (~ 1 × 106 cellen / ml) naar een steriele 1,5 ml steriele buis met behulp van een pipet en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 × g.
    2. Bewaar het supernatant voor ELISA. Resuspendeer de celpellet in 1 ml PBS en breng deze over in een buis van 15 ml. Verzamel eventuele resterende cellen met behulp van 1 ml PBS.
    3. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 × g.
      OPMERKING: Alle monsters moeten voorzichtig worden behandeld als levende cellen totdat cellysis wordt uitgevoerd met behulp van de lysisbuffer die in de kit wordt geleverd. Celdood geeft RNases vrij die snel de RNA-sjablonen hydrolyseren die nodig zijn voor kwantificering stroomafwaarts. RLT-buffer lyseert cellen in een oplossing die RNases remt.
    4. Voeg 350 μL lysisbuffer toe aan elke lege put en incuber gedurende 2-3 minuten om de aanhangende cellen te lyseren die niet in de vorige stappen zijn geoogst.
    5. Zodra de centrifugatie in stap 6.1.3 is voltooid, gooit u het supernatant weg en combineert u de celpellet met de 350 μL lysisbuffer die in stap 6.1.4 is toegevoegd.
      OPMERKING: Op dit punt is het mogelijk om de buizen op te slaan bij −80 °C of door te gaan met RNA-extractie (volgende stappen).
    6. Pipetteer 350 μL van 70% ethanol naar het lysaat in stap 6.1.5. Het uiteindelijke volume per monster is 700 μL.
    7. Plaats de extractiekolom in een opvangbuis van 2 ml (meegeleverd met de kit).
    8. Breng het monster van 700 μL per extractiekolom over en centrifugeer gedurende 15 s met 10.000 × g . Gooi de doorstroming in de opvangbuis weg en plaats deze terug in de draaikolom.
    9. Voeg in de extractiekolom 350 μL strenge wasbuffer toe (meegeleverd in de kit) en centrifugeer gedurende 15 s met meer dan 10.000 × g . Gooi de doorstroming weg.
    10. Voeg 80 μL DNase I-incubatiemix per monster toe aan het membraan van de extractiekolom en laat het gedurende 15 minuten op 20-30 °C inwerken.
      OPMERKING: Om DNase I-incubatiemix per monster te bereiden, voegt u 10 μL DNase I-stamoplossing toe aan 70 μL DNase-buffer voor een eindvolume van 80 μL. Meng grondig door de buis meerdere keren om te keren, gevolgd door een korte spin in de centrifuge.
    11. Was de extractiekolom met 350 μL strenge wasbuffer, gevolgd door centrifugeren op 10.000 × g gedurende 15 minuten. Gooi de doorstroming in de opvangbuis na centrifugeren weg.
    12. Was de extractiekolom 2x met 500 μL milde wasbuffer telkens en met centrifugeren op 10.000 × g gedurende 15 s en een tweede keer gedurende 2 min. Gooi de doorstroming na elke centrifugatie weg.
    13. Centrifugeer de kolom op maximale snelheid gedurende 1 minuut om het membraan te drogen en gooi de opvangbuis weg.
    14. Plaats de afzuigkolom in een nieuwe opvangbuis van 1,5 ml.
    15. Pipetteer 50 μL RNase-vrij water op het kolommembraan en incubeer gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Voor RNA-concentraties lager dan 100 ng, verlaag het elutievolume tot 30 μl en elueer het membraan van de extractiekolom opnieuw met behulp van het product van de eerste elutie om het eindproduct te concentreren.
    16. Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 1 minuut om het RNA te elueren.
    17. Meet de concentratie van RNA door de absorptie bij 260 nm te detecteren met behulp van 0,5-2 μL monster. Pas de uiteindelijke RNA-concentratie aan op 0,1-1 μg/μl met behulp van RNase-vrij water.
    18. Bewaar de RNA-aliquots bij −80 °C voor later gebruik.
  2. Synthese van complementair DNA
    1. Synthetiseer complementair DNA (cDNA) uit geëxtraheerd sjabloon-RNA volgens het protocol van de fabrikant dat bij de kit is geleverd (raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie).
      OPMERKING: Een samenvatting van de gebruikte reagentia en de gebruikte volumes is weergegeven in tabel 1 en tabel 2. Een volledig protocol is gedetailleerd in Aanvullend Dossier 1.
  3. Real-time kwantitatieve polymerase kettingreactie
    1. Voor qPCR voert u de cDNA-monsters in drievoud uit. Kwantificeer de runder-mRNA-transcriptniveaus voor Ki-67 en IFN-γ met behulp van specifieke primersets met betrekking tot het GAPDH-gen , zoals weergegeven in tabel 3.
      OPMERKING: Een volledig protocol wordt gedetailleerd beschreven in Aanvullend Dossier 1.

7. Enzymgebonden immunosorbenttest

  1. Verwerk de verzamelde kweeksupernatanten die rijk zijn aan secretoire eiwitten voor de kwantificering van IFN-γ via ELISA.
    OPMERKING: Raadpleeg de materiaaltabel voor meer informatie over het gebruik van de kit. Een volledig protocol is gedetailleerd in Aanvullend Dossier 1.

8. Statistische analyse

  1. Analyseer de gegevens en maak grafische illustraties van experimenteel ontwerp met behulp van commerciële software. Gebruik een ongepaarde niet-parametrische test voor de vergelijkende analyse. Beschouw P-waarden < 0,05 als statistisch significant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methodologie beschrijft de in vitro generatie van runder-MoDC's voor de evaluatie van kandidaat-vaccinantigenen voorafgaand aan het uitvoeren van in vivo studies. Figuur 1 illustreert het experimentele schema van de productie van MoDC's bij runderen en de toepassing van de MoDC's voor de in vitro test. Met behulp van de magnetische celsorteertechniek was het mogelijk om ongeveer 26 miljoen CD14+ myocyten te verzamelen uit de geoogste PBMC's, die eer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie toont een gestandaardiseerde in vitro methode voor het genereren en fenotyperen van boviene MoDC's en hun daaropvolgende gebruik bij het meten van de vaccinimmunogeniciteit van een commercieel vaccin (bijv. RV). Runder-MoDC's kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van potentiële vaccinantigenen tegen veeziekten en het voorspellen van hun potentiële klinische impact op basis van immuunresponsen voordat wordt overgegaan tot in vivo dierproeven. De gegenereerde MoDC's werde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Dr. Eveline Wodak en Dr. Angelika Loistch (AGES) voor hun steun bij het bepalen van de gezondheidsstatus van de dieren en voor het verstrekken van BTV, Dr. Bernhard Reinelt voor het verstrekken van runderbloed en Dr. Bharani Settypalli en Dr. William Dundon van de IAEA voor nuttig advies over respectievelijk de real-time PCR-experimenten en taalbewerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACK Lysing BufferGibco, Thermo FisherA1049201Ammonium-Chloride-Potassium buffer voor lysis van resterende RBC's in geoogste PBMC fractie
BD Vacutainer Heparine TubesBecton, Dickinson (BD) and Company36648010 mL, additief natriumheparine 158 USP eenheden, glazen buis, 16 x 100 mm formaat
Bovine Dendritic Cell Growth KitBio-Rad, UKPBP015KZZCytokine cocktail bestaande uit recombinant bovien IL-4 en GM-CSF
Bovine IFN-γ ELISA KitBio-RadMCA5638KZZKit voor het meten van IFN-γ expressie in cultuursupernatant
CD14 AntilichaamBio-RadMCA2678FMuis anti-bovens CD14 monoklonaal antilichaam, klon CC-G33, isotype IgG1
CD25 AntilichaamBio-RadMCA2430PEMuis anti bovien CD25 monoklonaal antilichaam, klon IL-A11, isotype IgG1
CD4 AntilichaamBio-RadMCA1653A647Muis anti bovien CD4 monoklonaal antilichaam, klon CC8, isotype IgG2a
CD40 AntilichaamBio-RadMCA2431FMuis anti-bovens CD40 monoklonaal antilichaam, klon IL-A156, isotype IgG1
CD8 AntilichaamBio-RadMCA837FMuis anti bovien CD8 monoklonaal antilichaam, klon CC63, isotype IgG2a
CD86 AntilichaamBio-RadMCA2437PEMuis anti-bovens CD86 monoklonaal antilichaam, klon IL-A190, isotype IgG1
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad-Thermische cyclus PCR machine
Corning Centrifuge TubeFalcon Corning 352096 & 35207015 mL en 50 mL, hoge helderheid polypropyleen conische bodem, gegradueerd, sterieel, schroefdop, falcon buis
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028Fixatie/permeabilisatie kit met BD golgiPlug, gebruikt voor flow cytometer celkleuring
EthanolSigma Aldrich1009832500Absoluut voor analyse EMSURE ACS,ISO, Reag. Ph Eur
Fetaal bovien Serum (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064Gekwalificeerd, warmte geïnactiveerd
Ficoll Plaque PLUSGE Health care Life Sciences, USA341691Lymfocyte-isolatie medium
FlowClean ReinigingsmiddelBeckman Coulter, Life SciencesA64669500 mL
FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA-Flow cytometer Histogram software
FlowTubes/ FACS  (Fluorescentie-geactiveerde single-cel sortering) BuisFalcon Corning 3522355 mL, sterieel, ronde bodem polystyreen testbuis met celzeef snap cap, gebruikt in flow cytometrie analyse
Fluoresceïnisothiocyanaat-DextranSigma Aldrich, Germany60842-46-8FITC-dextran MW
Gallios Flow CytometerBeckman Coulter-Flow cytometer machine
Hard-Shell 96-Well PCR PlatesBio-RadHSP960196 well, laag profiel, dunne wand, gerand, wit/helder
Human CD14 MicroBeadsMiltenyi Bioteck, Germany130-050-2012 mL microbeads geconjugeerd aan monoklonaal anti-human CD14 antilichaam isotype IgG2a, gebruikt voor selectie van boviene monocyten uit PBMC's
KaluzaBeckman Coulter, Germany-Flow cytometer software voor multicolor data analyse
MACS ColumnMiltenyi Bioteck, Germany130-042-401Magneet geactiveerde cel sortering of immuun magneet scheiding kolom voor scheiding van verschillende CD14 cel populaties op basis van celoppervlakte antigenen
MHC Klasse II DQ DR Polymorfe AntilichaamBio-RadMCA2228FMuis anti-schapen MHC Klasse II DQ DR Polymorf:FITC, klon 49.1, isotype IgG2a, kruis reactief met bovien
MicrocentrifugebuisSigma AldrichHS43251.5 mL, conische bodem, gegradueerd, steriele buis
Microsoft Power PointMicrosoft-De grafische illustraties van experimenteel ontwerp
Muis IgG1 Negatieve Controle:FITC voor CD14, CD40 AntilichaamBio-RadMCA928FIsotype controle CD14 en CD40 monoklonaal antilichaam 
Muis IgG1 Negatieve Controle:PE voor CD86 AntilichaamBio-RadMCA928PEIsotype controle CD86 monoklonaal antilichaam 
Muis IgG1 Negatieve Controle:RPE voor CD25 AntilichaamBio-RadMCA928PEIsotype controle CD25 monoklonaal antilichaam 
Muis IgG2a Negatieve Controle:FITC voor MHC Klasse II AntilichaamBio-RadMCA929FIsotype controle voor MHC klasse II monoklonaal antilichaam 
Nobivac RabiesMSD Animal Health, UK-1 µL/mL van cel gekweekte geïnactiveerde vaccin bevattende > 2 I.U./mL Rabies virus stam
Optische afdichtingenBi0-RadTCS08030.2 mL platte PCR buis 8-cap strips, optisch, ultrahelder, compatibel voor qPCR machine
Penicilline-StreptomycineGibco, Thermo Fisher15140122100 mL
Fosfaat Buffer Saline (PBS)Gibco, Thermo Fisher10010023pH 7.4, 1x concentratie
Prism - GraphPad 5 Software Dotmatics-Statistisch software
Gezuiverde Anti-mens Ki-67 antilichaamBiolegend, USA350501Monoklonaal antilichaam, kruis reactief met koe, klon ki-67
Gezuiverde Muis IgG1 k Isotype Ctrl Antilich

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502(2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424(2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214(2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72(2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215(2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112(2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132(2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369(2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252(2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Boviene dendritische cellenmononucleaire cellen uit perifeer bloedmagnetische cel sorteringflowcytometrielymfocytproliferatieantigeenpresentatiekwantitatieve PCRinterferon gamma

Gerelateerde artikelen