Mitochondriale morfologie analyseren door middel van simulatie supervised learning

Summary

In dit artikel wordt uitgelegd hoe u machine learning onder toezicht van simulatie kunt gebruiken voor het analyseren van mitochondriale morfologie in fluorescentiemicroscopiebeelden van vaste cellen.

Abstract

De kwantitatieve analyse van subcellulaire organellen zoals mitochondriën in celfluorescentiemicroscopiebeelden is een veeleisende taak vanwege de inherente uitdagingen in de segmentatie van deze kleine en morfologisch diverse structuren. In dit artikel demonstreren we het gebruik van een machine learning-ondersteunde segmentatie- en analysepijplijn voor de kwantificering van mitochondriale morfologie in fluorescentiemicroscopiebeelden van vaste cellen. De op deep learning gebaseerde segmentatietool is getraind op gesimuleerde afbeeldingen en elimineert de vereiste voor annotaties van grondwaarheid voor supervised deep learning. We demonstreren het nut van deze tool op fluorescentiemicroscopiebeelden van vaste cardiomyoblasten met een stabiele expressie van fluorescerende mitochondriënmarkers en gebruiken specifieke celkweekomstandigheden om veranderingen in de mitochondriale morfologie te induceren.

Introduction

In dit artikel demonstreren we het nut van een op fysica gebaseerde machine learning-tool voor subcellulaire segmentatie¹ in fluorescentiemicroscopiebeelden van vaste cardiomyoblasten die fluorescerende mitochondriënmarkers tot expressie brengen.

Mitochondriën zijn de belangrijkste energieproducerende organellen in zoogdiercellen. In het bijzonder zijn mitochondriën zeer dynamische organellen en worden ze vaak aangetroffen in netwerken die voortdurend veranderen in lengte en vertakking. De vorm van mitochondriën beïnvloedt hun functie en cellen kunnen hun mitochondriale morfologie snel veranderen om zich aan te passen aan een verandering in de omgeving². Om dit fenomeen te begrijpen, is de morfologische classificatie van mitochondriën als stippen, staafjes of netwerken zeer informatief³.

De segmentatie van mitochondriën is cruciaal voor de analyse van mitochondriale morfologie in cellen. Huidige methoden om fluorescentiemicroscopiebeelden van mitochondriën te segmenteren en te analyseren, zijn afhankelijk van handmatige segmentatie of conventionele beeldverwerkingsbenaderingen. Thresholding-gebaseerde benaderingen zoals Otsu⁴ zijn minder nauwkeurig vanwege de hoge ruisniveaus in microscopiebeelden. Typisch, afbeeldingen voor de morfologische analyse van mitochondriën bevatten een groot aantal mitochondriën, waardoor handmatige segmentatie vervelend is. Wiskundige benaderingen zoals MorphoLibJ⁵ en semi-supervised machine learning-benaderingen zoals Weka⁶ zijn zeer veeleisend en vereisen deskundige kennis. Een overzicht van de beeldanalysetechnieken voor mitochondriën⁷ toonde aan dat op deep learning gebaseerde technieken nuttig kunnen zijn voor de taak. Inderdaad, beeldsegmentatie in afbeeldingen in het dagelijks leven voor toepassingen zoals zelfrijdend rijden is gerevolutioneerd met het gebruik van op deep learning gebaseerde modellen.

Deep learning is een subset van machine learning die algoritmen biedt die leren van grote hoeveelheden gegevens. Supervised deep learning-algoritmen leren relaties van grote sets afbeeldingen die zijn geannoteerd met hun ground truth (GT) -labels. De uitdagingen bij het gebruik van supervised deep learning voor het segmenteren van mitochondriën in fluorescentiemicroscopiebeelden zijn tweeledig. Ten eerste vereist supervised deep learning een grote dataset van trainingsbeelden, en in het geval van fluorescentiemicroscopie zou het verstrekken van deze grote dataset een uitgebreide taak zijn in vergelijking met het gebruik van gemakkelijker beschikbare traditionele camera-gebaseerde beelden. Ten tweede vereisen fluorescentiemicroscopiebeelden GT-annotaties van de objecten die van belang zijn in de trainingsbeelden, wat een vervelende taak is die deskundige kennis vereist. Deze taak kan gemakkelijk uren of dagen van de tijd van de expert in beslag nemen voor een enkele afbeelding van cellen met fluorescerend gelabelde subcellulaire structuren. Bovendien vormen variaties tussen annotators een probleem. Om de noodzaak van handmatige annotatie weg te nemen en om gebruik te kunnen maken van de superieure prestaties van deep learning-technieken, werd hier een op deep learning gebaseerd segmentatiemodel gebruikt dat werd getraind op gesimuleerde afbeeldingen. Op fysica gebaseerde simulatoren bieden een manier om het proces van beeldvorming in een microscoop na te bootsen en te beheersen, waardoor afbeeldingen van bekende vormen kunnen worden gemaakt. Met behulp van een op fysica gebaseerde simulator werd hiervoor een grote dataset van gesimuleerde fluorescentiemicroscopiebeelden van mitochondriën gemaakt.

De simulatie begint met de geometriegeneratie met behulp van parametrische curven voor het genereren van vormen. Emitters worden willekeurig op het oppervlak van de vorm geplaatst op een gelijkmatig verdeelde manier, zodat de dichtheid overeenkomt met de experimentele waarden. Een 3D-puntspreidingsfunctie (PSF) van de microscoop wordt berekend met behulp van een computationeel efficiënte benadering⁸ van het Gibson-Lanni-model⁹. Om de gesimuleerde beelden nauw aan te sluiten bij experimentele beelden, worden zowel de donkere stroom als de opnameruis nagebootst om fotorealisme te bereiken. De fysieke GT wordt gegenereerd in de vorm van een binaire kaart. De code voor het genereren van de dataset en het trainen van het simulatiemodel is beschikbaar¹⁰, en de stap voor het maken van deze gesimuleerde dataset wordt beschreven in Figuur 1.

We laten het nut zien van op deep learning gebaseerde segmentatie die volledig is getraind op een gesimuleerde dataset door confocale microscopiebeelden van vaste cardiomyoblasten te analyseren. Deze cardiomyoblasten drukten een fluorescerende marker uit in het mitochondriale buitenmembraan, waardoor de mitochondriën in de fluorescentiemicroscopiebeelden konden worden gevisualiseerd. Voorafgaand aan het uitvoeren van het experiment dat hier als voorbeeld wordt gegeven, werden de cellen beroofd van glucose en aangepast aan galactose gedurende 7 dagen in cultuur. Het vervangen van glucose in de groeimedia door galactose dwingt de cellen in cultuur om meer oxidatief te worden en dus afhankelijk van hun mitochondriën voor energieproductie^11,12. Bovendien maakt dit de cellen gevoeliger voor mitochondriale schade. Mitochondriale morfologische veranderingen kunnen experimenteel worden geïnduceerd door een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel zoals carbonylcyanide m-chloorfenylhydrazon (CCCP) toe te voegen aan het celkweekmedium¹³. CCCP leidt tot een verlies van mitochondriaal membraanpotentiaal (ΔΨm) en resulteert dus in veranderingen in de mitochondriën van een meer buisvormige (staafachtige) naar een meer bolvormige (puntachtige) morfologie¹⁴. Bovendien hebben mitochondriën de neiging om op te zwellen tijdens CCCP-behandeling¹⁵. We tonen de morfologische verdeling van mitochondriale veranderingen wanneer de galactose-aangepaste cardiomyoblasten werden behandeld met de mitochondriale ontkoppelaar CCCP. De deep learning-segmentaties van de mitochondriën stelden ons in staat om ze te classificeren als stippen, staafjes of netwerken. Vervolgens hebben we kwantitatieve statistieken afgeleid om de taklengtes en abundantie van de verschillende mitochondriale fenotypen te beoordelen. De stappen van de analyse worden beschreven in figuur 2 en de details van de celcultuur, beeldvorming, het maken van datasets voor op deep learning gebaseerde segmentatie, evenals de kwantitatieve analyse van de mitochondriën, worden hieronder gegeven.

Protocol

OPMERKING: Secties 1-4 kunnen worden weggelaten als u werkt met bestaande microscopiebeelden van mitochondriën met bekende experimentele omstandigheden.

1. Celkweek

1. Kweek de H9c2-cellen in DMEM zonder glucose aangevuld met 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 10 mM galactose, 10% FBS, 1% streptomycine / penicilline en 1 μg / ml puromycine. Laat de cellen zich aanpassen aan galactose gedurende ten minste 7 dagen in cultuur vóór de experimenten.
   OPMERKING: De H9c2-cellen die hier worden gebruikt, zijn genetisch gemodificeerd om fluorescerende mitochondriën tot expressie te brengen en hebben ook een puromycineresistentiegen verworven. De toevoeging van dit antibioticum zorgt voor de groei van cellen met het resistentiegen en dus fluorescerende mitochondriën.
2. Zaai de H9c2-cellen voor het experiment wanneer de celconfluentie ongeveer 80% bereikt (T75-kweekkolf, beoordeeld door brightfield-microscopie). Verwarm het medium en trypsine voor tot 37°C gedurende ten minste 15 minuten alvorens verder te gaan.
   OPMERKING: Het is mogelijk om het experiment parallel uit te voeren met twee of meer verschillende celkweekomstandigheden. De H9c2-celconfluentie mag niet hoger zijn dan 80% om het verlies van myoblastische cellen te voorkomen. Bij 100% samenvloeiing vormen de cellen myotubes en beginnen ze te differentiëren.
3. Bereid je voor op het zaaien van de cellen, werkend in een steriele laminaire stromingskap, door een # 1,5 glazen afdeklip voor elke experimentele toestand in een put van een 12-well plaat te plaatsen. Label elke voorwaarde en de experimentele details op de 12-well plaat.
4. Verplaats de celkweekkolf van de incubator naar het werkoppervlak in de kap. Aspirateer het medium met behulp van een aspiratiesysteem of elektronische pipet en was vervolgens tweemaal met 5 ml PBS (kamertemperatuur).
5. Verplaats het voorverwarmde trypsine naar het werkoppervlak en zuig de uiteindelijke PBS-was aan; voeg vervolgens het voorverwarmde trypsine toe om de cellen los te maken (1 ml voor een T75-kweekkolf). Plaats de kweekkolf terug in de broedmachine gedurende 2-3 min bij 37°C.
6. Verplaats het voorverwarmde medium naar het werkoppervlak tegen het einde van de incubatie. Controleer of cellen zijn losgemaakt met behulp van een brightfield-microscoop.
   1. Als niet alle cellen zijn losgemaakt, breng dan een aantal voorzichtige maar stevige tikken aan op de zijkant van de kolf om de resterende cellen los te maken.
7. Breng de kweekkolf terug naar het werkoppervlak. Voeg 4 ml celkweekmedium toe aan de kweekkolf met behulp van een elektronische pipet om de trypsine-werking te stoppen. Wanneer u kweekmedium aan de kolf toevoegt, gebruikt u de pipet om het medium herhaaldelijk over het oppervlak te verspreiden om de cellen los te maken en te verzamelen in een celsuspensie.
8. Pipetteer de celsuspensie (5 ml) uit de kolf in een buis van 15 ml.
9. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 min. Open de buis in de kap, verwijder het supernatant door aspiratie en resuspenseer de celkorrel voorzichtig in 5 ml celkweekmedia.
10. Beoordeel het aantal cellen door een klein volume van de celsuspensie in een geautomatiseerde celteller te analyseren. Let op het aantal levende cellen per milliliter kweekmedia.
11. Verplaats het gewenste volume (bijv. 150 μL per putje) van de celsuspensie, berekend voor een zaaidichtheid van ongeveer 2 x 10⁴ cellen/cm², in een vooraf gelabelde centrifugebuis van 15 ml. Voeg het voorverwarmde celkweekmedium toe aan de centrifugebuis van 15 ml met een vooraf berekend volume op basis van het aantal putjes. Gebruik voor 12-well platen een totaal volume van 1 ml voor elke put.
12. Zorg ervoor dat de verdunde celsuspensie goed wordt gemengd door de inhoud van de centrifugebuis meerdere keren op en neer te pipetteren voordat u het juiste volume aan elke put dispenseert. Zodra de celsuspensie in de put is afgegeven, schudt u de plaat op een zorgvuldig gecontroleerde manier in elke richting om de cellen beter door de putten te verdelen. Plaats de 12-wells plaat in de incubator op 37°C tot de volgende dag.
13. Controleer de cellen met een brightfield microscoop om de groei te evalueren. Als de cellen voldoende groei hebben bereikt tot ongeveer 80% samenvloeiing, ga dan verder met de volgende stappen; anders herhaalt u de evaluatie dagelijks totdat voldoende groei is bereikt.

2. Experimentele procedure

1. Bereken de hoeveelheden die nodig zijn van de materialen voor het experiment op basis van de concentraties van de stamoplossing. Ontdooi de bevroren materialen (30 mM CCCP-stamoplossing) bij 37 °C en stel het celkweekmedium in op voorverwarming bij 37 °C.
2. Eenmaal ontdooid, creëert u een werkoplossing van 10 μM CCCP door de stamoplossing (1:3.000) in celkweekmedium te verdunnen.
   OPMERKING: Pipetvolumes niet kleiner dan 1 μL.
3. Start de experimentele behandelingen zodra alle benodigde materialen zijn voorbereid en voorverwarmd. Giet het celkweekmedium uit de putten van de 12-wellsplaat en breng vervolgens snel het verse voorverwarmde medium aan op de controleputten en het voorverwarmde medium met 10 μM CCCP-oplossing op de testconditieputten.
4. Incubeer de 12-well plaat in de 37°C celincubator gedurende 2 uur. Bereid tijdens de incubatietijd de fixatieoplossing voor.
5. Gebruik voor de bereiding van de fixatieoplossing kant-en-klare 4% paraformaldehyde (PFA) om 25% glutaaraldehyde (GA) stockoplossing te verdunnen tot 0,2% (1:125). Stel de oplossing in op voorverwarmen op 37°C. Voor een 12-well plaat is 500 μL voldoende per put.
   LET OP: PFA en GA zijn giftige chemicaliën. Werk in een chemische kap met beschermende kleding. Zie hun respectieve SDS voor meer informatie.
6. Wanneer de incubatietijd is voltooid, verwijdert u de 12-wellsplaat uit de incubator en plaatst u deze op het werkoppervlak.
   LET OP: Het werk vereist niet langer een steriele omgeving.
7. Aspirateer het celkweekmedium uit de putten en breng de voorverwarmde fixatieoplossing aan. Breng de 12-well plaat terug naar de 37°C incubator gedurende 20 min.
8. Aspirateer de fixatieoplossing na het voltooien van de incubatie en was elke put twee keer met PBS op kamertemperatuur. Het is mogelijk om het experiment in dit stadium van het protocol te pauzeren en later verder te gaan.
   1. Als het experiment wordt gepauzeerd, voeg dan 1 ml PBS per put toe, sluit de 12-wellsplaat af met plastic film (parafilm) en bewaar bij 4 °C.

3. Kleuring en montage van de cellen op de coverslips

1. Ontdooi DAPI (nucleaire vlek) voorraad en draai af in een minicentrifuge voordat u deze opent. Bereid DAPI-kleuringsoplossing door DAPI-voorraad in PBS (1:1.000) te verdunnen.
2. Aspirateer de PBS uit de 12-well plaat en breng 1 ml DAPI-kleuringsoplossing aan op elke put. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
3. Aspirateer de DAPI-kleuringsoplossing. Was tweemaal met 2 ml PBS per putje.
4. Bereid matglas microscoopglaasjes (glasglaasjes) voor door ze te wassen in 70% ethanol, gevolgd door drie wasbeurten in PBS. Droog de dia's zorgvuldig af met pluisvrije papieren handdoeken en richt ze naar het licht om te controleren op tekenen van stof of vet.
   OPMERKING: Handschoenen zijn vereist voor deze stap.
5. Label de glazen dia's met de experimentele details. Breng het montagemedium over naar een microcentrifugebuis en draai af in een minicentrifuge.
6. Bereid u voor op het monteren van de coverslips door de werkruimte te rangschikken. Houd een 12-wells plaat met coverslips, gelabelde glazen dia's, montagemedium, een pipet, 10 μL pipetpunten, pluisvrije papieren handdoeken en pincetten bij de hand.
7. Breng 10 μL montagemedium (ProLong Glass) aan op een voorbereide glasplaat om een afdekplaat te monteren.
8. Pak de coverslip van de 12-wellsplaat met een pincet en dep vocht van de coverslip door de rand en achterkant van de coverslip kort aan te raken aan het voorbereide pluisvrije papieren handdoekje. Laat de afdekking voorzichtig zakken op de druppel van het montagemedium.
9. Herhaal de bovenstaande twee stappen voor elke coverslip. Plaats de montagemediumdruppels zo dat er tussen één en vier afdekplaten per glasplaat mogelijk zijn.
10. Zorg ervoor dat de glazen platen zich op een vlak oppervlak bevinden om te voorkomen dat de gemonteerde coverslips bewegen. Plaats de glasglaasjes 's nachts op een donkere locatie bij kamertemperatuur om het montagemedium te laten instellen. De monsters zijn nu klaar voor beeldvorming. Het experiment kan in dit stadium van het protocol worden gepauzeerd en later worden voortgezet.
11. Als het experiment in dit stadium wordt gepauzeerd, bedek ze dan, nadat u de monsters 's nachts op kamertemperatuur hebt laten instellen, met aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen en bewaar ze bij 4 °C.

4. Microscopie en beeldvorming

1. Bedek de monsters met aluminiumfolie voor transport (als dit nog niet is gebeurd).
2. Gebruik bij aankomst in de microscopiefaciliteit dubbel gedestilleerd H₂O met microscoopfilterpapier om de PBS-residuen van de coverslips op de glasglaasjes te reinigen. Controleer of er geen vlekken op de coverslips zijn door de glasglijders naar een fel licht te houden.
3. Doorloop de opstartprocedure voor de microscoop. Selecteer het juiste objectief (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) en voeg een dompelmedium toe.
4. Plaats het monster in de monsterhouder. Gebruik in de microscoopsoftware het tabblad "Lokaliseren" om de EGFP-fluorescentieverlichting te activeren en pas met behulp van de oculairen handmatig het z-niveau aan om het monster scherp te stellen. Schakel de fluorescentieverlichting uit bij het vinden van de focus.
5. Schakel over naar het tabblad "Verwerven" in de microscoopsoftware. Gebruik de "Smart Setup" om de fluorescentiekanalen te selecteren die moeten worden gebruikt voor beeldvorming. Voor dit experiment zijn de EGFP- en DAPI-kanaalvoorinstellingen geselecteerd.
6. Pas elke kanaalintensiteit aan ten opzichte van de initiële instellingen met behulp van het intensiteitshistogram als leidraad voor geoptimaliseerde signaalsterkte. De beeldvorming kan nu beginnen.
7. Gebruik voor beeldvorming de optie van de software om de beeldposities in een array te plaatsen en de array in het midden van de coverslip te centreren met 12 totale posities die in beeld moeten worden gebracht. Controleer of elke positie in de array cellen bevat. Als er geen cellen zijn, past u de positie aan op een gebied met cellen.
8. Pas de focus van elke positie in de array aan met behulp van de autofocus van de microscoopsoftware en volg dit met een handmatige fijnaanpassing om ervoor te zorgen dat zoveel mogelijk mitochondriën scherp zijn.
   OPMERKING: Het EGFP-kanaal wordt gebruikt voor deze handmatige aanpassingen.
9. Verkrijg de afbeeldingen met behulp van deze methode voor elke coverslip. Sla de afbeeldingsbestanden op en ga verder met de stappen voor morfologische analyse.

5. Gesimuleerde trainingsgegevens genereren

1. Download de code¹⁰ en pak de inhoud uit. Volg de instructies in README.md om de vereiste omgeving in te stellen.
2. Navigeer naar de map met de naam "src", de thuismap voor dit project. De genummerde mappen bevatten codes die specifiek zijn voor verschillende stappen van het gebruik van het gereedschap.
   OPMERKING: Gebruik het commando "cd <
3. Maak een kopie of gebruik de map "2. Mitochondria Simulation Airy", en hernoem het (Airy wordt hier gebruikt omdat het de PSF-functie is die het dichtst bij een confocale microscoop ligt, die werd gebruikt als de huidige microscoop). Ga naar de map met de naam "simulator".
   OPMERKING: Deze map bevat alle bestanden met betrekking tot de simulatie van de trainingsgegevens. Er zijn drie sets parameters die moeten worden ingesteld voor de simulatie.
4. Ten eerste, voor de simulator in het batchconfiguratiebestand "simulator / batch / bxx.csv", stel de parameters in voor ongeveer het monster, inclusief het aantal mitochondriën, het bereik van diameters en de lengtes van de structuren, het bereik van de z-as dat de structuur vertoont en de dichtheid van de fluoroforen.
5. Stel vervolgens de parameters in die betrekking hebben op het optische systeem.
   1. Deze set omvat het type microscoop (die bepaalt welk PSF-model wordt geselecteerd), het numerieke diafragma (N.A.), de vergroting (M), de pixelgrootte (in μm), de emissiegolflengte van de fluoroforen en de parameter achtergrondruis, enz.
   2. Stel de optische parameters van N.A., de vergroting en de minimale golflengte van de dataset in het bestand "simulator/microscPSFmod.py" in.
   3. Stel de gewenste waarde in voor de pixelgrootte en stel de emissiegolflengte van de dataset in als parameter voor de functie "process_matrix_all_z" in het bestand "simulator/generate_batch_parallel.py".
   4. Stel de laatste drie parameters van de functie "save_physics_gt" in het bestand "simulator/generate_batch_parallel.py" in. De parameters zijn pixelgrootte (in nm), grootte van de uitvoerafbeelding en max_xy.
6. Stel de derde set parameters in met betrekking tot de uitvoergegevensset, zoals de grootte van de uitvoerafbeeldingen, het aantal tegels in elke afbeelding en het aantal totale afbeeldingen, in het bestand "simulator / generate_batch_parallel.py".
7. Voer het bestand "simulator/generate_batch_parallel.py" uit om de simulatie te starten.
8. Als u de afbeelding van het uiteindelijke formaat wilt verkrijgen, maakt u een kopie van de map met de naam '5. Data Preparation and Training/data preparation" in de homemap, en navigeer erin.
   OPMERKING: Elke afbeelding van de synthetische dataset wordt gevormd door een montage van vier gesimuleerde afbeeldingen van 128 pixels x 128 pixels, wat een uiteindelijke beeldgrootte van 256 pixels x 256 pixels oplevert. Dit genereert eerst veel individuele tegels (ongeveer 12.000) voor zowel de microscoopbeelden (in de map "output") als de grondwaarheidssegmentaties (in de map "output/physics_gt").
   1. Stel de parameters van het batchnummer, het aantal afbeeldingen per batch en het ruisbereik in "data_generator.py" in.
   2. Voer het bestand "data_generator.py" uit om de montageafbeeldingen te maken.
   3. Kopieer de mappen met de naam "afbeelding" en "segment" naar de "5. Data Preparation and Training/datatrain/train" folder uit de map "5. Gegevensvoorbereiding en training/gegevensvoorbereiding/gegevens".

6. Deep learning-gebaseerde segmentatie

1. Train het segmentatiemodel op de gesimuleerde afbeeldingen als volgt:
   1. Voor het trainen van het segmentatiemodel voor een nieuwe microscoop navigeert u naar de "5. Map Data Preparation and Training/train, en stel de parameters van de batchgrootte, het backbonemodel voor de segmentatie, het aantal tijdperken en de leersnelheid voor training in het bestand "train_UNet.py" in.
   2. Voer "train_UNet.py" uit om de training te starten. Het trainingsproces geeft de statistiek weer voor de prestaties van de segmentatie op de gesimuleerde validatieset.
      OPMERKING: Nadat de training is voltooid, wordt het model opgeslagen als "best_model.h5" in de "5. Data Preparation and Training/train" map.
2. Test het model op echte microscoopafbeeldingen die zijn gesplitst tot een formaat dat wenselijk is voor het getrainde model door middel van de volgende stappen.
   1. Navigeer naar "6. Testgegevens voorbereiden" en de ". png" bestanden van de gegevens op te maken in de map "png".
   2. Voer het bestand "split_1024_256.py" uit om de afbeeldingen te splitsen tot een grootte die wenselijk is voor het getrainde model. Dit creëert 256 pixel x 256 pixel grootte bijsnijdingen van de afbeeldingen in de map "data".
   3. Kopieer de gemaakte map "gegevens" naar de map "7. Test Segmentatie" map.
   4. Navigeer naar de map "7. Testsegmentatie" en stel de naam in van het opgeslagen model dat moet worden gebruikt.
   5. Als u de gewassen wilt segmenteren, voert u het bestand "segment.py" uit. De gesegmenteerde afbeeldingen worden opgeslagen in de map "uitvoer".

7. Morfologische analyse: Analyse van de mitochondriale morfologie van de twee gegevensgroepen, "Glucose" en "CCCP"

1. Rangschik de te analyseren gegevens (één map voor elke afbeelding, waarbij elke map de gesegmenteerde uitvoeruitsnedes van één afbeelding bevat).
2. Download en plaats het aanvullende bestand met de naam "make_montage.py" in de map met de naam "7. Testsegmentatie".
3. Voer het bestand "make_montage.py" uit om de gesegmenteerde uitvoer terug te voegen naar de oorspronkelijke grootte van de afbeelding.
4. Maak een nieuwe map met de naam "9. Morfologische analyse" in de map "src" .
5. Installeer de Skan¹⁶ - en Seaborn Python-pakketten in de omgeving met behulp van het commando "pip install seaborn[stats] skan".
   OPMERKING: De segmentatiemaskers worden geskeletiseerd met behulp van de bibliotheek met de naam Skan om de analyse van de topologie van elk individueel mitochondrion mogelijk te maken.
6. Plaats het aanvullende bestand "analyze_mitochondria.py" in de map "9. Morfologische analyse".
7. Rangschik de afbeeldingen van verschillende groepen van het experiment in verschillende mappen in de map "7. Testsegmentatie".
8. Stel de parameters "pixelgrootte" en "invoerpad" in het bestand "analyze_mitochondria.py" in.
9. Voer het bestand "analyze_mitochondria.py" uit om de code uit te voeren om te skeletoniseren en plots van de analyse te maken.

Results

De resultaten van de deep learning-segmentaties van mitochondriën in confocale beelden van vaste cardiomyoblasten die fluorescerende mitochondriënmarkers tot expressie brengen, tonen het nut van deze methode. Deze methode is compatibel met andere celtypen en microscopiesystemen en vereist alleen omscholing.

Galactose-aangepaste H9c2 cardiomyoblasten met fluorescerende mitochondriën werden behandeld met of zonder CCCP gedurende 2 uur. De cellen werden vervolgens gefixeerd, gekleurd met een nucleaire kleurstof en gemonteerd op glazen dia's voor fluorescentiemicroscopieanalyse. Een confocale microscoop werd gebruikt om beelden te verkrijgen van zowel de controle- als cccp-behandelde cellen. We voerden onze analyse uit op 12 confocale beelden, met ongeveer 60 cellen per aandoening. De morfologische toestand van de mitochondriën in elk beeld werd vervolgens bepaald en gekwantificeerd. De segmentatiemaskers verkregen uit het getrainde model werden geskeletiseerd om de analyse van de topologie van elk individueel mitochondrion voor dit experiment mogelijk te maken. De taklengte van de individuele mitochondriën werd gebruikt als parameter voor classificatie. De individuele mitochondriën werden ingedeeld in morfologische klassen door de volgende regel. In het bijzonder werd elk mitochondriaal skelet met een lengte van minder dan 1.500 nm als een stip beschouwd en de langere mitochondriën werden verder gecategoriseerd in netwerk of staaf. Als er ten minste één knooppunt was waar twee of meer takken elkaar kruisten, werd dit gedefinieerd als een netwerk; anders werd het mitochondrion geclassificeerd als een staaf. Een voorbeeldafbeelding met de mitochondriale skeletten gelabeld met de morfologieklassen is weergegeven in figuur 3.

De mitochondriale morfologiecategorisatie in figuur 4A laat zien dat het mogelijk is om significante veranderingen te detecteren wanneer CCCP gedurende 2 uur wordt toegepast; dit wordt het duidelijkst aangetoond door de toename van stippen voor de met CCCP behandelde cellen.

De gemiddelde taklengte in figuur 4B is een andere manier om detecteerbare en significante veranderingen in de morfologie te illustreren. Zowel de staafjes als de netwerken waren, zoals verwacht, significant verminderd ten opzichte van de controle toen de cellen werden behandeld met CCCP. De significante toename van de gemiddelde taklengtes van stippen werd ook verwacht gezien de zwelling die mitochondriën ondergaan bij blootstelling aan CCCP.

Figuur 1: Pijplijn voor de simulatie van fluorescentiemicroscopiebeelden. De pijplijn omvat (i) 3D-geometriegeneratie, (ii) emitters en fotokinetische emulatie, (iii) 3D PSF-convolutie, (iv) ruistoevoeging en (v) binarisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Stappen van op machine learning gebaseerde analyse van mitochondriale morfologie. (1) De te segmenteren afbeeldingen worden eerst bijgesneden in formaten die aanvaardbaar zijn voor het segmentatiemodel. (2) De op deep learning gebaseerde segmentatie wordt toegepast op de beelduitsnedes. (3) De gesegmenteerde productiegewassen worden teruggestikt tot hun oorspronkelijke grootte. (4) De gemonteerde segmentaties zijn geskeletiseerd. (6) Morfologische analyse wordt uitgevoerd op basis van de topologie van de skeletisaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Mitochondriaal skelet bedekt met de segmentatie-uitvoer van microscopiebeelden. (A) De segmentatie-uitvoer. (B) Het rechtlijnige skelet (Euclidische afstand tussen het begin- en eindpunt van een tak) wordt bovenop de segmentatie-output gelegd. De kleurcodering van het skelet toont de klasse van mitochondriën. Netwerken zijn rood, staafjes zijn groen en stippen zijn paars van kleur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Analyse van mitochondriale morfologie. (A) Een overzicht van het relatieve percentage van verschillende morfologische categorieën op basis van de totale mitochondriale lengte. (B) Vergelijking van de gemiddelde mitochondriale taklengte tussen de experimentele omstandigheden en tussen morfologische categorieën. De x-as geeft de morfologische categorisaties weer en de y-as geeft de gemiddelde taklengte van de mitochondriën weer in nanometers (nm). Statistische significantie in de vorm van p-waarden wordt weergegeven als * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 en **** p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Faalgeval van segmentatie. Een hoge dichtheid van mitochondriën is een uitdagend scenario voor het segmentatiemodel. Het gekleurde skelet toont de langste enkele mitochondriën die in de afbeelding zijn gedetecteerd. Door de lengtemetingen te doorlopen, kunnen deze scenario's worden gedetecteerd en gewerkt om de segmentatieresultaten te verbeteren met behulp van de morfologische operatorrode (slankt het gedetecteerde skelet af). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

We bespreken voorzorgsmaatregelen met betrekking tot de kritieke stappen in het protocol in de paragrafen over "geometriegeneratie" en "simulatorparameters". De paragraaf met de titel "transfer learning" bespreekt wijzigingen voor een hogere doorvoer bij aanpassing aan meerdere microscopen. De paragrafen over "deeltjesanalyse" en "het genereren van andere subcellulaire structuren" verwijzen naar toekomstige toepassingen van deze methode. De paragraaf over het "verschil met biologische waarheid" bespreekt de verschillende redenen waarom de simulaties kunnen verschillen van echte gegevens en of deze redenen van invloed zijn op onze toepassing. Tot slot bespreken we een uitdagend scenario voor onze methode in de paragraaf "dicht opeengepakte structuren".

Geometrie generatie
Om de 3D-geometrie van mitochondriën te genereren, werkt een eenvoudige 2D-structuur gemaakt van b-spline-curven als skeletten goed voor het maken van de synthetische dataset. Deze synthetische vormen bootsen nauw de vormen van mitochondriën na die worden waargenomen in 2D-celculturen. In het geval van 3D-weefsel zoals hartweefsel zijn de vorm en rangschikking van mitochondriën echter heel anders. In dergelijke gevallen kunnen de prestaties van het segmentatiemodel verbeteren door de toevoeging van directionaliteit in de gesimuleerde beelden.

Simulatorparameters
Voorzichtigheid is geboden bij het instellen van de parameters van de simulator om ervoor te zorgen dat ze overeenkomen met die van de gegevens waarop de gevolgtrekking moet worden uitgevoerd, omdat het niet doen hiervan kan leiden tot lagere prestaties bij segmentatie. Een van die parameters is het signaal-ruisverhouding (SNR) bereik. Het bereik van de SNR van de te testen gegevens moet overeenkomen met de waarden van de gesimuleerde gegevensset. Bovendien moet de gebruikte PSF overeenkomen met die van de doeltestgegevens. Modelgetrainde beelden van een confocale PSF mogen bijvoorbeeld niet worden gebruikt om beelden van een epi-fluorescerende microscoop te testen. Een andere parameter om op te letten is het gebruik van extra vergroting in de testgegevens. Als extra vergroting is gebruikt in de testgegevens, moet de simulator ook op de juiste manier worden ingesteld.

Transferleren
Transfer learning is het fenomeen van het gebruik van een geleerd model dat op de ene taak is getraind voor gebruik in een andere taak. Dit fenomeen is ook van toepassing op ons probleem met betrekking tot verschillende soorten microscoopgegevens. De gewichten van het segmentatiemodel (geleverd met de broncode) dat is getraind op één type microscopiegegevens kunnen worden gebruikt om een segmentatiemodel te initialiseren voor gebruik op een ander soort optische microscoopgegevens. Dit stelt ons in staat om te trainen op een aanzienlijk kleinere subset van de trainingsdataset (3.000 afbeeldingen in vergelijking met 10.000), waardoor de computationele kosten van simulatie worden verlaagd.

Deeltjesanalyse
Deeltjesanalyse kan ook worden uitgevoerd op de gesegmenteerde maskers. Dit kan informatie geven over het gebied en de kromming, enz., Van de individuele mitochondriën. Deze informatie kan ook dienen als metriek voor de kwantitatieve vergelijking van mitochondriën (niet gebruikt voor dit experiment). Op dit moment definiëren we bijvoorbeeld de puntmorfologie met behulp van een drempel op basis van de lengte van de mitochondriën. Het kan in sommige gevallen nuttig zijn om ellipticiteit op te nemen om kleine staafachtige mitochondriën beter te scheiden van puncta- of puntachtige mitochondriën. Als alternatief, als bepaalde biologische omstandigheden ervoor zorgen dat de mitochondriën opkrullen, kan krommingskwantificering van belang zijn om de mitochondriale populatie te analyseren.

Het genereren van andere subcellulaire structuren
De op fysica gebaseerde segmentatie van subcellulaire structuren is aangetoond voor mitochondriën en blaasjes¹. Hoewel blaasjes verschillende vormen vertonen, zijn hun maten kleiner en lijken ze als eenvoudige bollen wanneer ze worden waargenomen door een fluorescentiemicroscoop. Daarom wordt de geometrie van blaasjes gesimuleerd met behulp van bolvormige structuren met een geschikt diameterbereik. Dit impliceert een verandering in de functie genereert de geometrie (cilinders in het geval van mitochondriën en bollen in het geval van blaasjes) van de structuren en de respectieve parameters (stap 5.4 in de protocolsectie). Geometrisch zijn het endoplasmatisch reticulum en de microtubuli ook gesimuleerd als buisvormige structuren¹⁷. Het modelleren van het endoplasmatisch reticulum met een diameter van 150 nm en microtubuli met een gemiddelde buitendiameter van 25 nm en een binnenste holle buis van 15 nm in diameter biedt benaderingen van de vormen van deze structuren. Een andere parameter die voor elk van deze subcellulaire structuren zal variëren, is de fluorofoordichtheid. Dit wordt berekend op basis van de verdeling van het biomolecuul waaraan de fluoroforen binden en de kans op binding.

Verschil met biologische grondwaarheid
De gesimuleerde gegevens die worden gebruikt voor de simulatie-begeleide training van het deep learning-model verschillen op veel manieren van echte gegevens. (i) De afwezigheid van niet-specifieke etikettering in de gesimuleerde gegevens verschilt van echte gegevens, aangezien er vaak vrij zwevende fluoroforen in de echte gegevens zitten. Dit zorgt voor een hogere gemiddelde achtergrondwaarde in het echte beeld. Dit verschil wordt verzacht door de SNR te matchen en de achtergrondwaarde zo in te stellen dat deze overeenkomt met de waargenomen reële waarden. (ii) De beweging van subcellulaire structuren en fotokinetiek zijn twee bronnen van dynamica in het systeem. Bewegende structuren in levende cellen (die in het bereik van enkele milliseconden bewegen) veroorzaken bewegingsonscherpte. De belichtingstijd wordt verkort tijdens echte data-acquisitie om het vervagingseffect te voorkomen. Aan de andere kant simuleren we geen timelapse en gaan we uit van onbeweeglijke structuren; deze veronderstelling is geldig wanneer de blootstellingstijd in de reële gegevens klein is. Deze aanname kan echter een fout in de uitvoer veroorzaken als de belichtingstijd van de echte gegevens groot genoeg is om bewegingsonscherpte te introduceren. Fotokinetiek daarentegen is in de orde van nanoseconden tot microseconden en kan in de simulatie worden weggelaten, omdat de gebruikelijke belichtingstijden van experimenten lang genoeg zijn (in de orde van milliseconden) om de effecten van fotokinetiek te gemiddelden. (iii) Ruis in microscoopbeelden heeft verschillende bronnen en deze bronnen hebben verschillende waarschijnlijkheidsdichtheidsfuncties. In plaats van deze individuele bronnen van ruis te modelleren, benaderen we het als een Gaussische ruis over een constante achtergrond. Dit verschil verandert niets significant aan de gegevensverdeling voor de omstandigheden van een lage signaal-achtergrondverhouding (in het bereik van 2-4) en bij het omgaan met de macrodichtheid van fluoroforen¹. (iv) Artefacten in beeldvorming kunnen ontstaan door aberraties, drift en systematische vervagingen. We gaan ervan uit dat de microscoop goed is uitgelijnd en dat de regio's die zijn gekozen voor analyse in de echte gegevens verstoken zijn van deze artefacten. Er is ook de mogelijkheid om enkele van deze artefacten te modelleren in de PSF 18,19,20.

Dicht opeengepakte structuren
De problemen met het niet kunnen onderscheiden van overlappende staven van netwerken is een hardnekkig probleem bij de segmentatie van 2D-microscopiegegevens. Een extreem uitdagend scenario wordt gepresenteerd in figuur 5, waar de mitochondriën dicht opeengepakt zijn, wat leidt tot suboptimale resultaten in het segmentatiemodel en de volgende analyse. Ondanks deze uitdaging kan het gebruik van morfologische operatoren in dergelijke situaties om de skeletvorming af te slanken, helpen om deze overdreven verbonden netwerken te doorbreken, terwijl significante veranderingen in alle mitochondriale morfologiecategorieën nog steeds kunnen worden gedetecteerd. Bovendien is het gebruik van een confocale in plaats van een widefield-microscoop voor beeldvorming een methode om dit probleem gedeeltelijk te verminderen door onscherp licht te elimineren. Verder zou het in de toekomst nuttig zijn om 3D-segmentatie uit te voeren om mitochondriën te onderscheiden die elkaar kruisen (d.w.z. fysiek een netwerk vormen) van staafachtige mitochondriën waarvan de projecties in een enkel vlak elkaar overlappen.

Deep-learning segmentatie is een veelbelovend hulpmiddel dat biedt om de analysemogelijkheden van microscopiegebruikers uit te breiden, waardoor de mogelijkheid wordt geopend voor geautomatiseerde analyse van complexe gegevens en grote kwantitatieve datasets, die voorheen onbeheersbaar zouden zijn geweest.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12-well plate	FALCON	353043
Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25%	Electron Microscopy Sciences	16200
Axio Vert.A1	Zeiss		Brightfield microscope
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Computer	n/a	n/a	Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory
Coverslips	VWR	631-0150
DAPI (stain)	Sigma-Aldrich	D9542
DMEM	gibco	11966-025
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
Glass Slides (frosted edge)	epredia	AA00000112E01MNZ10
H9c2 mCherry-EGFP-OMP25			In-house stable cell line derived from purchased cell line
Incubator	Thermo Fisher Scientific	51033557
LSM 800	Zeiss		Confocal Microscope
Mounting Media (Glass)	Thermo Fisher Scientific	P36980
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Thermo Fisher Scientific	J19943-K2
Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4	Zeiss	420782-9900-000
Sterile laminar flow hood	Labogene		SCANLAF MARS
Trypsin	Sigma-Aldrich	T4049
Vacusafe aspiration system	VACUUBRAND	20727400
ZEN 2.6	Zeiss