Methodenartikel

Coherente Raman-microscopie: van instrumentatie tot toepassingen

DOI:

10.3791/64882

⸱

20 januari 2023

1Department of Chemistry, University of Washington

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BESPROKEN ARTIKELEN:

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Directe vergelijking van hyperspectral gestimuleerde Raman-verstrooiing en coherente anti-Stokes Raman-verstrooiingsmicroscopie voor chemisch beeldvorming. Journal of Visualized Experiments. (182), e63677 (2022)

De la Cadena, A. et al. Multiplex chemisch beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman

verstrooiingsmicroscopie. Journal of Visualized Experiments. (185), e63709 (2022).

Shi, L., Wei, M., Min, W. Zeer veelvoudige weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547 (2022).

Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose. Journal of Visualized Experiments. (180), e63484 (2022).

Miao, K., Lin, L. E., Qian, C., Wei, L. Label-vrije superresolutiebeeldvorming mogelijk gemaakt door vibratiebeeldvorming van gezwollen weefsel en analyse. Journal of Visualized Experiments. (183), e63824 (2022).

Yuan, Y., Lu, F. Een flexibele kamer voor time-lapse live-celbeeldvorming met gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie. Journal of Visualized Experiments. (186), e64449 (2022).

Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo beeldvorming van biologische weefsels met gecombineerde twee-fotonfluorescentie en gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie. Journal of Visualized Experiments. (178), e63411 (2021).

Redactioneel

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afgelopen tien jaar is er een toename van belangstelling voor het toepassen van coherente Raman-microscopie (CRM) op cel- en weefselbeeldvorming1,2. CRM is een krachtige chemische beeldvormingstechniek met twee populaire varianten: coherente anti-Stokes Raman-scattering (CARS) microscopie en gestimuleerde Raman-scattering (SRS) microscopie. SRS wordt steeds populairder in vergelijking met CARS omdat het minder wordt beïnvloed door niet-Raman achtergrondinterferentie en een lineaire afhankelijkheid heeft van de concentratie3. CRM verwerft moleculaire vibratie-informatie vergelijkbaar met Raman-spectroscopie, maar biedt een aanzienlijk verbeterde verwervingssnelheid4. Dit wordt bereikt door middel van coherente trillingsexcitatie door een paar gepulseerde lasers met hoge piekintensiteit. Omdat CRM ruimtelijk opgeloste chemische kartering biedt met hoge ruimtelijke en temporele resolutie, heeft het belangrijke toepassingen gevonden in kankerdiagnose, lipidemetabolisme, celmetabolisme, geneesmiddeltransport en vele andere5,6,7,8. Echter, een belangrijke bottleneck die de wijdverbreide toepassing van de techniek belemmert, is de technische complexiteit en het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen. Hoewel commerciële lasers en microscopen al beschikbaar zijn, omvatten bijna alle systemen die momenteel in het veld worden gebruikt verschillende niveaus van aanpassing van lasers, optica, microscopen en detectoren, wat een aanzienlijke barrière vormt voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het betreden van het veld of het adopteren van deze technologie. Het gebrek aan toegang belemmert verder biologische toepassingen. Het doel van deze verzameling methoden is om gedetailleerde voorbeelden en richtlijnen te geven over instrumentatie, nieuwe beeldvormingsbenaderingen en in vitro/in vivo cel- of weefselbeeldvormingstoepassingen. We hebben zeven publicaties van experts op het gebied opgenomen die hier worden samengevat.

Clark et al. presenteren een zij-aan-zij vergelijking van hyperspectrale SRS en CARS in termen van gevoeligheid, ruimtelijke resolutie en spectrale resolutie9. Beide technieken worden geïmplementeerd met spectraal focussen van femtoseconde lasers, een veelgebruikte aanpak die gebruik maakt van de spectraal gechirpte breedband femtoseconde lasers om nauwebandige Raman-resolutie te bereiken. Een directe vergelijking maakt de beoordeling van detectieverscheidenheden en optimale selectie van de modaliteit voor verschillende chemische beeldvormingstoepassingen mogelijk.

De la Cadena et al. publiceren een nieuwe multiplex SRS-methode die snel breedbandige SRS-beelden kan verwerven10. De techniek is gebaseerd op een aangepaste differentiële multikanaals lock-in versterker detectie, die toelaat om tot 32 kanalen gelijktijdig te detecteren. Bovendien wordt gedetailleerde ruiskarakterisering getoond, en een uitgebalanceerde detectiemethode wordt gedemonstreerd om laserruis te elimineren. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor gebruikers die geïnteresseerd zijn in het bouwen van multiplex SRS-systemen.

Shi et al. demonstreren het gebruik van hoog multiplexed Raman-kleurstoffen in SRS-beeldvorming11. Met pre-resonantie verbetering, demonstreren ze dat SRS een gevoeligheid kan bieden die vergelijkbaar is met standaard immunofluorescentie. Deze methode omzeilt de limiet van spectraal oplosbare kanalen in conventionele immunofluorescentie en maakt het mogelijk om veel eiwitten tegelijkertijd te monitoren en hun interacties te bestuderen. Gedetailleerde richtlijnen over de monsterverwerking en Raman-kleurstofkleuring worden gegeven om de adoptie van deze krachtige methode te vergemakkelijken.

Miao et al. presenteren vibratiebeeldvorming van gezwollen weefsel en analyse (VISTA), een superresolutie beeldvormingstechniek die SRS combineert met expansiemicroscopie12. VISTA omzeilt obstakels geassocieerd met fluorescente beeldvorming en bereikt labelvrije superresolutie volumetrische beeldvorming in biologische monsters met een ruimtelijke resolutie tot 78 nm. Ze exploiteren verder een deep learning-algoritme om multi-component segmentatie te bereiken, inclusief eiwitaggregaten in cellen en hersenweefsels.

Espinoza et al. presenteren het gebruik van real-time twee-kleur SRS-beeldvorming van eiwitten en lipiden voor weefseldiagnostische toepassingen13. Twee-kleur SRS-beeldvorming kan H&E-equivalente afbeeldingen genereren voor pathologie toepassingen. Dit protocol beschrijft de details van het implementeren van een orthogonale modulatietechniek en spectraal focussen voor gelijktijdige twee-kleur SRS-beeldvorming. Conversie van twee-kleur SRS-beelden naar pseudo-H&E-beelden wordt ook gedemonstreerd met muizenhersenweefsel om weefseldiagnosetoepassingen te illustreren.

Yuan et al. publiceren een flexibel kamersysteem voor langetermijn SRS-beeldvorming van levende cellen14. De meeste bestaande observatiekamers voor levende cellen zijn ontworpen voor helder veld en fluorescentiebeeldvorming. Ze zijn onverenigbaar met SRS-detectie vanwege de vereiste van een objectief en condensor met hoge NA. De auteurs demonstreren 24 uur tijdsverloop SRS-beeldvorming met de flexibele kamer, die constante temperatuur, CO2 en vochtigheid handhaafde.

Ten slotte, Wu et al. demonstreren gelijktijdige in vivo twee-foton fluorescentie (TPEF) en SRS-beeldvorming15. Twee aparte lasersystemen worden gecombineerd om optimale gevoeligheid voor beide beeldvormingsmodaliteiten te bereiken om complementaire informatie te bieden. In vivo SRS-beeldvorming van weefsel heeft unieke uitdagingen vanwege de noodzaak van epi-detectie van gedepolariseerd, terugverstrooid licht. Dit protocol bespreekt de details van de optimale opstelling van een TPEF-SRS microscoop en hoe deze kan worden gebruikt voor in

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur erkent financiële steun van het National Institute of Health (NIH R35 GM133435) en de Eli Lilly Young Investigator Award.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  2. Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
  3. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: Beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  4. Freudiger, C. W., et al. Label-Free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  5. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  6. Yue, S., et al. Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness. Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).
  7. Fu, D., et al. In vivo metabolic fingerprinting of neutral lipids with hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (24), 8820-8828 (2014).
  8. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  9. Clark, M. G., Brasseale, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct comparison of hyperspectral stimulated Raman scattering and coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for chemical imaging. Journal of Visualized Experiments. (182), e63677(2022).
  10. Dela Cadena, A., et al. Multiplex chemical imaging based on broadband stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (185), e63709(2022).
  11. Shi, L., Wei, M., Min, W. Highly-Multiplexed tissue imaging with Raman dyes. Journal of Visualized Experiments. (182), e63547(2022).
  12. Miao, K., Lin, L. E., Qian, C., Wei, L. Label-Free super-resolution imaging enabled by vibrational imaging of swelled tissue and analysis. Journal of Visualized Experiments. (183), e63824(2022).
  13. Espinoza, R., Wong, B., Fu, D. Real-Time, two-color stimulated Raman scattering imaging of mouse brain for tissue diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (180), e63484(2022).
  14. Yuan, Y., Lu, F. A flexible chamber for time-lapse live-cell imaging with stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (186), e64449(2022).
  15. Wu, W., Li, X., Qu, J. Y., He, S. In vivo imaging of biological tissues with combined two-photon fluorescence and stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63411(2021).
  16. Manifold, B., Fu, D. Quantitative stimulated Raman scattering microscopy: Promises and pitfalls. Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 269-289 (2022).
  17. Qian, C., et al. Super-resolution label-free volumetric vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 3648(2021).
  18. Graefe, C. T., et al. Far-Field super-resolution vibrational spectroscopy. Analytical Chemistry. 91 (14), 8723-8731 (2019).
  19. Wei, L., Min, W. Electronic preresonance stimulated Raman scattering microscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 9 (15), 4294-4301 (2018).
  20. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  21. Wei, L., et al. Super-multiplex vibrational imaging. Nature. 544 (7651), 465-470 (2017).
  22. Manifold, B., Men, S., Hu, R., Fu, D. A versatile deep learning architecture for classification and label-free prediction of hyperspectral images. Nature Machine Intelligence. 3, 306-315 (2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hyperspectral Stimulated Raman ScatteringCoherent Anti Stokes Raman ScatteringChemical ImagingMultiplex Chemical ImagingStimulated Raman Scattering MicroscopyTissue ImagingVibrational ImagingLive cell ImagingIn Vivo ImagingReal time ImagingSuper resolution Imaging

Gerelateerde artikelen