Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Meten in vivo vetweefselkinetiek bij mensen met behulp van de deuterium (2uur)-labelbenadering

723 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64883

⸱

21 juli 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd om in vivo de kinetiek van vetweefsel bij mensen te meten met behulp van de deuterium (2H)-labelmethode.

Samenvatting

Wit vetweefsel is een zeer plastisch orgaan dat nodig is om de energiehomeostase van het hele lichaam te behouden. De vetweefselmassa en veranderingen in de vetmassa of -verdeling worden gereguleerd door veranderingen in de synthese en afbraak (d.w.z. omzet) van vetcellen en triacylglycerolen. Er zijn aanwijzingen dat de manier en omvang van de expansie van het onderhuidse vetweefsel (d.w.z. hypertrofie versus hyperplasie) en de omzet de metabole gezondheid kunnen beïnvloeden, aangezien adipogenese betrokken is bij de pathogenese van obesitas en aanverwante ziekten. Ondanks de mogelijke rol van vetomzetting in de menselijke gezondheid, is er een gebrek aan kennis over de in vivo kinetiek van vetcellen. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de trage omloopsnelheid van de cellen in vetweefsel en de praktische complexiteit van het direct labelen van hun metabole voorlopers in vivo. Hierin beschrijven we methoden om in vivo vetkinetiek en omzettingssnelheden bij mensen te meten door de consumptie van deuterium (2H)-gelabeld water. De opname van 2H in de desoxyribonucleotidegroepen van DNA in pre-adipocyten en adipocyten zorgt voor een nauwkeurige maat voor celvorming en -dood (vetomzet). Over het algemeen is dit een innovatieve benadering voor het meten van in vivo vetkinetiek en vertegenwoordigt het een substantiële afwijking van andere in vitro beoordelingen.

Inleiding

Obesitas is een ziekte die wordt gekenmerkt door overtollig wit vetweefsel (AT) en is een belangrijke risicofactor voor de ontwikkeling van diabetes type II en hart- en vaatziekten1. Witte AT is een zeer plastisch orgaan dat energie opslaat in de vorm van triacylglycerolen (TG's) en is essentieel voor metabole homeostase2. Witte AT behoudt het vermogen om uit te breiden, te verminderen en te hermodelleren tijdens de volwassenheid3, en de AT-massa wordt bepaald door dynamische veranderingen in het adipocytenvolume (via TG-synthese en -afbraak), continue vorming van adipocyten via de proliferatie en differentiatie van pre-adipocyten (d.w.z. hyperplasie of adipogenese) en vetceldood4.

Er zijn aanwijzingen dat er een belangrijk verband bestaat tussen de subcutane AT-omzet (bijv. vorming van adipocyten en overlijden) en cardiometabole gezondheid 5,6,7,8, en de rol van adipogenese in de pathogenese van aan obesitas gerelateerde aandoeningen blijft discutabel4. Er is echter weinig bekend over in vivo AT-omzet bij mensen, deels als gevolg van de trage omloopsnelheid van de cellulaire componenten van de AT en de complexiteit van het direct labelen van hun metabole voorlopers in vivo. Hoewel in vitro methoden enig inzicht hebben verschaft, bieden deze benaderingen geen uitgebreide in vivo beoordeling binnen het natuurlijke milieu van de AT.

Het Hellerstein-laboratorium9 heeft een methode ontwikkeld om in vivo AT-omzet te beoordelen met behulp van de opname van het stabiele isotoop deuterium (2H) uit zwaar water (2H2O) in de AT (Figuur 1)10. Het protocol, dat is gevalideerd bij muizen en mensen, omvat een initiële opschaling van 2uur 2O om de 2uur verrijking van het lichaamswater te verhogen, gevolgd door voldoende dagelijkse inname om stabiele, bijna-plateau verrijkingswaarden te behouden. De 2H van de 2H2O (d.w.z. zwaar water) wordt opgenomen in het deoxyribose (dR) gedeelte van desoxyribonucleotiden in het DNA van vetcellen, en de isotopenverrijking wordt gemeten in het DNA via massaspectrometrie en de toepassing van massa-isotopomeerdistributieanalyse (MIDA)9,10,11. Het labelen van het deoxyribosegedeelte van purinedeoxyribonucleotiden in DNA met stabiele isotopenprecursoren heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerdere methoden, zoals methoden waarbij werd gelabeld met pyrimidinenucleotide-basengroepen (bijv. van 3H-thymidine of broom-deoxyuridine). Merk op dat de endogene heropname van basen, vooral voor pyrimidines, maar niet voor dR, bij het repliceren van DNA eerder de interpretatie van labelopname12 in de war bracht. Bovendien veroorzaakt de opname van een stabiel isotooplabel in dR geen genotoxiciteit, in tegenstelling tot de opname van radioactieve of genotoxische stoffen zoals 3H (tritium) of broomdeoxyuridine. Daarom is het langdurig gebruik van deze techniek in diermodellen en mensen veilig.

De meting van 2H-gelabelde DNA-synthese geeft de passage van een cel door de S-fase van celdeling aan en identificeert nieuw gevormde pre-adipocyten en adipocyten (via pre-adipocytendifferentiatie) of adipogenese13. Cellen die een snelle omzet ondergaan (bijv. monocyten) vervangen hun DNA snel en bereiken een plateau in 2H-verrijking, waardoor ze een interne referentie voor de test vormen. De verhouding van de 2H-verrijking van DNA uit vetcellen tot die van monocyten (referentiecellen) of de geïntegreerde lichaamsmeting 2H2O maakt het mogelijk om de fractie van nieuw gesynthetiseerde vetcellen te berekenen. Hierin beschrijft dit protocol methoden om in vivo de omzetting van vetcellen (adipogenese) bij mensen te meten via het 2H metabole labelingsprotocol, inclusief verfijnde technieken om de vetcellen te zuiveren via negatieve immuunselectie en om de pre-adipocytenpopulatie te verrijken14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Institutional Review Board (IRB) van het Pennington Biomedical Research Center keurde alle procedures goed (#10039-PBRC) en alle menselijke proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Acht weken 2H2O-labeling periode

  1. Dien hoeveelheden van 70% of 99,9% deuterium-gelabeld water (2H2O) toe in steriele plastic containers.
  2. Instrueer de deelnemers om 35 ml doses van 99,9% verrijkt 2H2O of 40 ml doses van 70% verrijkt 2H2O driemaal per dag te drinken in week 1 (primingperiode) en om twee doses van respectievelijk 35 ml of 50 ml per dag te drinken in week 2-8.
    OPMERKING: Voorbijgaande duizeligheid of duizeligheid zijn de enige bekende nadelige effecten van inname van 2uur2O en houden verband met snelle veranderingen in de bulkwaterstroom, die worden waargenomen door de haarzakjes van het binnenoor. Instrueer de deelnemers daarom om de doses ten minste ~ 2 uur na elkaar in te nemen om het zeldzame optreden van voorbijgaande duizeligheid of duizeligheid15 te voorkomen. Maak om dezelfde reden gemiste doses niet in door een enkele dosis te verdubbelen. Toediening van de dosis zoals hierboven beschreven (met een tussenpoos van ≥2 uur) maakt deze nadelige werking uiterst zeldzaam bij menselijke proefpersonen (<1% van enkele honderden proefpersonen).
  3. Bewaak de naleving van de inname van 2uur2O door urineverzamelingen om de 2uur verrijking in het lichaamswater te meten en ook door de wekelijkse terugkeer van de lege injectieflacons om te tellen.
    1. Reinig de urinemonsters met actieve kool en een filter.
      1. Voeg 8 ml urine toe aan een tube van 10 ml met 1 ml actieve kool.
      2. Plaats het monster 10 minuten op een wip en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 x g zodat de houtskool naar de bodem van de buis beweegt. Filtreer het monster met een spuitfilter van 0,2 μm.
    2. Meet de 2H2O verrijking in het lichaamswater (urine) door middel van isotopenverhouding massaspectrometrie (IRMS).
      OPMERKING: 2H2O-verrijking kan worden geanalyseerd met verschillende methoden, waaronder gaschromatografie-massaspectrometrie16, elementaire analysator voor conversie bij hoge temperatuur (TC/EA) in combinatie met IRMS17, cavity ring-down infraroodspectroscopie (IRIS)18, of met een H/apparaat aangesloten op een massaspectrometer (bijv. IRMS)19.
    3. Gebruik de gemiddelde 2H2O-verrijkingen gemeten in de urine tijdens de etiketteringsperiode van 8 weken om de precursor 2H2O blootstelling en de fractie van nieuw gesynthetiseerde AT-cellen te berekenen (zie sectie 7 en sectie 8 hieronder).

OPMERKING: Het 2H2O etiketteringsprotocol handhaaft de 2 Hverrijking in het lichaamswater in de buurt van het plateau binnen het bereik van 1,0%-2,5% voor de duur van de etiketteringsperiode van 8 weken (Figuur 2)10.

2. Collecties vetweefselbiopsie van menselijke proefpersonen

  1. Na het reinigen van de huid met povidon-jodiumoplossing, lokale anesthesie toedienen (bijv. 2% lidocaïne/0,5% bupivacaïne), een incisie van ~0,75 cm in de huid maken en subcutane AT-biopsieën verzamelen via de naaldlipoaspiratietechniek onder steriele omstandigheden13.
  2. Weeg een steriele buis van 50 ml met 5 ml kamertemperatuur (RT) 1 M HEPES-buffer, pH 7,3. Plaats de AT onmiddellijk in de buis met de HEPES-buffer voor verwerking.
  3. Weeg de buis van 50 ml met de AT en noteer het gewicht.

3. Isolatie van gezuiverde vetcellen

  1. Voeg een type 1 collagenase/HEPES (2 mg/ml) oplossing toe aan 2 g/ml AT.
  2. Ontsmet de AT door 1 uur bij 37 °C in een waterbad te schudden (100 rpm) tot er een homogeen mengsel is met enkele grote, intacte stukken AT.
  3. Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 8 minuten bij RT om de adipocyten en de stromale-vasculaire fractie (SVF) te scheiden.
  4. Verwijder voorzichtig de bovenste vetlaag (adipocyten) en breng deze over in een aparte buis. Verstoor de pellet (SVF) op de bodem van de buis niet.
  5. Zoals eerder beschreven14, zuivert u de vetcellen met behulp van immunomagnetische celscheiding.
    OPMERKING: Deze belangrijke stap wordt gedaan om de vetcellen te "reinigen", aangezien andere celtypen met een snelle celomloop, waaronder hematopoëtische, endotheel- en stamcellen, zich aan de zwevende vetcellen kunnen hechten en de metingen kunnen beïnvloeden.
    1. Plaats ~400 μL vetcellen in een tube van 5 ml voor negatieve immunozuivering.
    2. Voeg FcR-blokkerend antilichaam (100 μL/ml) toe.
    3. Voeg een cocktail van gebiotinyleerde antilichamen tegen markers van endotheelcellen (anti-humaan CD31; 1:100), hematopoëtische cellen (anti-humaan CD45; 1:400) en mesenchymale stamcellen (anti-humaan CD34; 1:100) toe aan de adipocytoplossing gedurende 15 minuten bij RT.
    4. Voeg een biotineselectiecocktail (100 μl/ml) toe aan de adipocytenoplossing, meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij RT met zachte kanteling/rotatie.
    5. Meng de magnetische nanodeeltjes door op en neer te pipetteren, voeg de deeltjes (50 μL/ml) toe aan de adipocytenoplossing, meng goed en incubeer gedurende 10 minuten bij RT met zachte rotatie (10 rpm).
    6. Voeg PBS/2% FBS/1 mM EDTA-buffer toe aan de adipocytenoplossing voor een totaal volume van 1 ml.
    7. Plaats de buis in de magneet en laat deze 5 minuten staan.
    8. Pak de magneet op en keer in één continue beweging de magneet met de buis om en giet de inhoud in een nieuwe buis van 5 ml. Tik niet op de tube tijdens het schenken. De cellen die aan de antilichamen vastzitten, worden door de magnetische nanodeeltjes gebonden en verwijderd, terwijl de immunogezuiverde vetcellen worden behouden.
    9. Vries de gezuiverde vetcellen snel in in vloeistof N2 en bewaar ze bij -80 °C tot de DNA-extractie.

4. Isolatie van pre-adipocyten

  1. Om een verrijkte populatie van pre-adipocyten te isoleren, gebruikt u een protocol om hun vermogen om zich aan plastic te hechten te benutten na een kortstondige kweek van de SVF20.
  2. Resuspendeer in een laminaire stromingskap de SVF-pellet in 5 ml erytrocytenlysisbuffer gedurende 5-10 minuten bij RT (grondig mengen) en centrifugeer bij 800 x g. Verwijder de supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in 10% FBS in alpha (α)MEM.
  3. Plaats de cellen gedurende ~8-12 uur op een plastic kweekschaaltje in een weefselkweekincubator bij 37 °C en met een atmosfeer van 5% CO2 .
  4. Was na ~8-12 uur voorzichtig de niet-klevende cellen van de kweekplaat met PBS in een laminaire stromingskap.
  5. Voeg na het opzuigen van de PBS 1-1,5 ml 0,25% trypsine/1 mM EDTA toe aan de kweekschaal om de aanhangende cellen (verrijkte populatie van pre-adipocyten) los te maken. Plaats de kweekschaal in de broedmachine bij 37 °C gedurende ~5-8 minuten om de cellen te helpen liften.
  6. Voeg 10% FBS/αMEM toe aan de plaat en was de plaat grondig om alle cellen van de plaat te verzamelen. Breng de celoplossing over in een buis van 15 ml of 50 ml en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 800 x g .
  7. Verwijder de supernatant en bewaar de pellet (pre-adipocyten) bij -80 °C tot de DNA-extractie.

5. Isolatie van bloedmonocyten

OPMERKING: De monocyten worden geanalyseerd om een (bijna) volledig omgedraaide celpopulatie weer te geven, en de meting van de 2H verrijking in de monocyten kan worden gebruikt als referentiemarker van 2H2O blootstelling in elk individu. Als alternatief kan de verrijkingvan het lichaam 2 H2O worden gemeten en gebruikt om de blootstelling van 2H2O te berekenen.

  1. Zuig vers, volbloed van menselijke proefpersonen op in vacutainerbuisjes die EDTA bevatten.
  2. Centrifugeer het bloed 15 minuten bij 1.000-2.000 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: Gebruik de rem niet.
  3. Verwijder de bovenste laag plasma. Pas op dat u de witte buffy-vacht net onder het plasma niet aanraakt.
  4. Zuig de witte buffy-laag op met behulp van een transferpipet en breng deze over in een tube van 50 ml. Voeg ~10 ml PBS toe aan de buffy coat.
  5. Voeg voorzichtig 10 ml van een dichtheidsgradiëntmedium toe om de buffy-vacht in lagen te leggen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de punt van de pipet de bodem van de buis raakt en werp deze voorzichtig uit zodat er een duidelijke laag dichtheidsgradiëntmedium op de bodem ontstaat. Vermijd het introduceren van bubbels.
  6. Centrifugeer de buis op 800 x g gedurende 30 minuten met uitgeschakelde rem.
  7. Pipetteer (~10 ml) de witte laag (mononucleaire fractie) uit en maak cirkelvormige bewegingen met de punt van de transferpipet dicht bij de rand, maar raak de bovenste laag niet aan. Breng over naar een nieuwe tube van 50 ml en voeg 10 ml PBS toe. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 800 x g (gebruik de rem niet) en gooi het bovenstaande weg.
  8. Voeg 5 ml erytrocytenlysisbuffer toe aan de pellet. Meng en laat het 2 minuten staan op RT.
  9. Voeg 5 ml PBS met 0,1% BSA toe aan de erytrocytenlysisbuffer-/pelletoplossing, centrifugeer 5 minuten op 800 x g en gooi het supernatant weg.
  10. Isoleer de monocyten als CD14+ -cellen met behulp van immunomagnetische kralen. Voer de isolatie van de CD14+ -cellen uit volgens het protocol van de fabrikant.
  11. Bewaar de geïsoleerde monocyten bij -80 °C tot de DNA-extractie.

6. DNA-preparaat (isolatie, hydrolyse en derivatisering)

  1. Isoleer het DNA van de pre-vetcellen, vetcellen en bloedmonocyten met behulp van een DNA-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Om de desoxyribonucleosiden vrij te maken, hydrolyseert u het DNA (~200 μL) een nacht (niet meer dan 24 uur) bij 37 °C in 50 μL enzymhydrolysecocktail die 1 ml S1-nuclease, 1 ml fosfatase-enzym en 36,8 ml 5x hydrolysebuffer bevat in glazen buizen van 16 mm x 100 mm (10 ml) met schroefdop. Voeg daarnaast de volgende monsters toe: een waterblanco, een blanco hydrolysecocktail, een blanco kolom uit de DNA-extractiekit en 500 ng DNA-standaarden.
    1. Om de 5x hydrolysebuffer voor te bereiden, plaatst u 94 ml zuiver water van moleculaire biologische kwaliteit in een steriel bekerglas. Weeg 3,08 g natriumacetaat en 21,5 mg zinksulfaat af, voeg water toe en meng tot het is opgelost. Pas de pH aan op 5,0 met ijsazijn en test met pH-papier. Voeg water toe om een totaal volume van 100 ml te bereiken.
    2. Om het fosfatase-enzym te bereiden, resuspendeert u een injectieflacon zure fosfatase in 1 ml zuiver water.
    3. Om het enzym 0,5 U/μL S1-nuclease te bereiden, verdunt u 2,5 μL S1-nuclease tot 2 ml 1x hydrolysebuffer (voeg 1 ml 5x hydrolysebuffer toe aan 4 ml zuiver water).
  3. Derivatiseer de hydrolysaten tot pentafluorbenzylhydroxylamine (PFBHA) derivaten. Voeg met name het volgende rechtstreeks toe aan de verteerde DNA-monsters, inclusief de standaarden en blanco's, in buizen met schroefdop van 16 mm x 100 mm (10 ml): 100 μl pentafluorbenzylhydroxylaminehydrochloride (PFBHA; 1 mg/ml) en 75 μl ijsazijn. Vortex (kort), sluit de injectieflacons af en plaats de hydrolysaatmonsters op een verwarmingsblok dat gedurende 30 minuten op 100 °C is ingesteld.
  4. Verwijder de monsters en laat ze ~5 minuten afkoelen tot RT. Voeg na afkoeling 2 ml azijnzuuranhydride en 100 μl 1-methylimidazool toe aan elke buis onder een zuurkast. Plaats de buizen gedurende 5 minuten op een warmteblok van 100 °C.
  5. Verwijder de monsters en laat ze vervolgens ~15-20 minuten afkoelen. Eenmaal afgekoeld, voeg je 3 ml water van moleculaire biologiekwaliteit toe aan elk monster, draai kort en laat ze 10 minuten staan.
  6. Voeg 2 ml dichloormethaan (DCM) toe aan de buizen en draai de monsters krachtig gedurende 15 s om het derivaat in de organische fase te extraheren.
  7. Centrifugeer 5 minuten bij 800 x g om de fasen te scheiden. Breng de onderste dichloormethaanlaag voorzichtig over in een schone GC-injectieflacon van 1,6 ml.
    OPMERKING: Breng geen van de waterige fase over, omdat dit de achtergrond zal vergroten.
  8. Verdamp tot droogte met stikstof gedurende ~20 minuten om de DCM en het resterende azijnzuur te verwijderen, gevolgd door een ~10 minuten drogen in een snelheidsvacuüm bij RT om alle sporen van de reagentia te verwijderen.

7. Gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) analyse van het DNA

  1. Eenmaal droog, suspendeer de PFBHA-derivaten in 150 μL ethylacetaat en dop. Analyseer vervolgens op de opname van 2H in het DNA op een gaschromatografie (GC)/massaspectrometrie (MS) instrument uitgerust met een DB-225-kolom met behulp van methaannegatieve chemische ionisatie en het verzamelen van de ionen in selectieve ionenbewakingsmodus bij m/z 435, m/z 436 en m/z 437 (die de M0, M1 en M2 massa-isotopomeren vertegenwoordigen, respectievelijk). Volg de instructies van de fabrikant voor het gebruikte instrument.
    1. Stel de GC-voorwaarden als volgt in: kolom: 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 μm filmcoating; chromatograaf: heliumdraaggas bij een constante stroom van 1,0 ml/min; gepulseerde split-less injecties; temperatuur injector: 250 °C; MS transferlijn: 325 °C; ovenomstandigheden: begintemperatuur 100 °C, 2 minuten vasthouden, helling bij 40 °C/min tot een temperatuur van 220 °C, 7.5 min vasthouden, tweede helling bij 40 °C/min tot 320 °C, 1 minuut vasthouden. De totale speelduur is 16,0 min. De typische dR-elutietijden zijn respectievelijk 10,5 minuten en 10,8 minuten voor de eerste en tweede piek.
    2. Stel de MS-voorwaarden als volgt in: methaannegatieve chemische ionisatiebron met detectie in bewakingsmodus met één ion; ionen verzameld voor dR: m/z 435, m/z 436 en m/z 437 (die respectievelijk M0, M1 en M2 massa-isotopomeren vertegenwoordigen).
      NOTITIE: Siliconiseer de open glazen voering met een kleine prop gesiliconiseerde glaswol in het onderste gedeelte van de voering. Vervang deze liner vaak (elke ~100 injecties).
  2. Bereken de M1-verhoudingen van de massa-isotoomdichtheid in het niet-verrijkte (natuurlijke overvloed) dR-derivaat als volgt:
    M1-verhouding = M1-abundantie/(som van M0-, M1- en M2-abundanties)
    Trek vervolgens de natuurlijke overvloed M1-ratio's af van de M1-ratio's in de dR van de gelabelde monsters om de verrijkingen te berekenen (overtollige isotopenabundanties, of %EM1)21.
  3. Meet de massa-isotomeerconcentraties van de basislijn (niet-verrijkte) DNA-standaarden gelijktijdig over een reeks M0-ionenconcentraties die het bereik van M0-ionenconcentraties in de geanalyseerde monsters overspannen.
    OPMERKING: Deze stap is essentieel om te corrigeren voor de "overvloedsgevoeligheid" van isotopenverhoudingen gemeten door GC/MS22.
  4. Construeer een grafiek van de gemeten M0-ionendichtheid versus de gemeten massa-isotomeer M1-ratio's in de niet-gelabelde standaarden om de monsterconcentratie op de kolom te bepalen die het meest nauwkeurig is voor de M1-massa-isotomeer (d.w.z. waar deze het dichtst bij de bekende, berekende natuurlijke abundantie M1-verhouding ligt, of de "sweet spot"). De M1-ratio voor dit niet-verrijkte dR-derivaat is 0,1669.
  5. Injecteer de experimentele monsters zodat ze zich zo dicht mogelijk in het M0-piekgebied bij deze "sweet spot" bevinden. Gebruik een kwadratische regressie van de M1-ratio van de niet-verrijkte standaarden versus het M0-piekgebied om een "aangepaste natuurlijke abundantie" M1-ratio te schatten voor elk monster bij zijn specifieke M0-concentratie. Trek dit af van de M1-verhouding van het vetcelmonster om het percentage verrijking boven de natuurlijke abundantie te verkrijgen, of %EM1 (Figuur 3)23.
  6. Bereken de theoretische maximale M 1-verrijking (EM1*) in de vetcellen met behulp van massa-isotopomeerverdelingsanalyse (MIDA)-vergelijkingen24 op basis van de blootstelling van het lichaam 2H2O (gemeten in de urine) geïntegreerd over de periode van 8 weken (Figuur 4) of de tussentijds gemeten monocytenverrijkingen (stap 7.5).

8. Berekening van de fractie van nieuw gesynthetiseerde cellen, of in vivo adipogenese

  1. Bereken de fractie van nieuwe cellen (%), die een maat is voor de in vivo adipogenese of de vorming van nieuw gesynthetiseerde pre-adipocyten of adipocyten, met behulp van de volgende formule:
    Fractie van nieuwe cellen (%) = [(M 1-verrijking in het monster [vet]cellen)/EM1* (theoretische maximale M1-verrijking)] x 100
    OPMERKING: *De 2H-verrijking in monocyten kan ook worden gebruikt als noemer van de vergelijking. Deze meting in monocyten vertegenwoordigt een referentiecelmarker van de 2H2O blootstelling in elk individu en kan worden gebruikt om de berekeningen van de theoretische maximale M 1-verrijking van hetgemeten lichaam 2H2O-waarden te bevestigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het 2H2O-etiketteringsprotocol (sectie 1) handhaaft de verrijking van 2H in de buurt van het plateau in het lichaamswater binnen het bereik van 1.0%-2.5% voor de duur van de etiketteringsperiode van 8 weken10, zoals weergegeven in figuur 2. Een eerdere studie maakte gebruik van het 2H2O-labelprotocol om de vetkinetiek te beoordelen via de opname van 2H in het D...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In vivo beoordelingen zijn nodig om nieuwe kennis te verschaffen, over de dynamiek van witte AT-omzet en de rol ervan bij obesitas en gerelateerde stofwisselingsziekten, aangezien in-vitrobeoordelingen de natuurlijke omgeving van de AT niet omvatten. Hoewel het gebruik van retrospectieve radiokoolstofdatering om de vetdynamiek te beoordelen informatief is geweest 7,25, is deze benadering niet geschikt voor het v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de Mass Spectrometry Core van het Pennington Biomedical Research Center.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-methylimidazoleMilliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
Azijnzuur-anhydrideAldridge539996
ACK Lysing Buffer (erytrocyt lysis buffer)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS Agilent
Anti-human CD31 (PECAM-1) BiotinInvitrogen13-0319-82
Anti-human CD34 BiotinInvitrogen13-0349-82
Anti-human CD45BioLegend304004
Antibiotic Antimycotic SolutionMilliporeSigmaA5955
Collageenase type 1Worthington Biochemical CorporationLS004196
Deoxyribose (2-deoxy d-ribose)MilliporeSigma31170
Deuterium OxideMilliporeSigma756822
DB-225 column (30m, 0.25mm, 0.25um)J&W Scientific122-2232
Dichloormethaan (DCM)MilliporeSigma34856
DNA standaard (calf thymus DNA)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (DNA extractie kit)Qiagen69504
Easy Sep Human Biotin kitStem Cell Technologies17663
EasySep Human CD14 Positive Selection CocktailStem Cell Technologies18058C
EthylacetaatFisherEX0241-1
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test TubeVWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
GC vials (2 mL)FisherC-4011-1W
GC vial insertsFisherC-4011-631; C-4012-530
Glacial azijnzuurFisherAC14893-0010
Glasbuisjes (voor hydrolyse)Fisher14-959-35AA
HEPES bufferThermoFisher15630080
Hyclone Water, moleculaire biologie kwaliteitThomas ScientificSH30538.02
MEM alphaFisher Scientific32561-037
PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-pentafluorbenzylhydroxylamine hydrochloride)MilliporeSigma194484
pH indicator stripsFisher987618
Fosfatase zuurCalbiochem (VWR)80602-592
S1 nuclease (van Aspergillus oryzae)MilliporeSigmaN5661
NatriumsulfaatMilliporeSigma23913

Referenties

  1. Cypess, A. M. Reassessing human adipose tissue. The New England Journal of Medicine. 386 (8), 768-779 (2022).
  2. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  3. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  4. White, U., Ravussin, E. Dynamics of adipose tissue turnover in human metabolic health and disease. Diabetologia. 62 (1), 17-23 (2019).
  5. Danforth, E. Failure of adipocyte differentiation causes type II diabetes mellitus. Nature Genetics. 26 (1), 13(2000).
  6. Virtue, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue expandability, lipotoxicity and the metabolic syndrome--An allostatic perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 338-349 (2010).
  7. Arner, E., et al. Adipocyte turnover: relevance to human adipose tissue morphology. Diabetes. 59 (1), 105-109 (2010).
  8. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
  9. Busch, R., Neese, R. A., Awada, M., Hayes, G. M., Hellerstein, M. K. Measurement of cell proliferation by heavy water labeling. Nature Protocols. 2 (12), 3045-3057 (2007).
  10. Neese, R. A., et al. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15345-15350 (2002).
  11. Strawford, A., Antelo, F., Christiansen, M., Hellerstein, M. K. Adipose tissue triglyceride turnover, de novo lipogenesis, and cell proliferation in humans measured with 2H2O. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 286 (4), E577-E588 (2004).
  12. Macallan, D. C., et al. Measurement of cell proliferation by labeling of DNA with stable isotope-labeled glucose: Studies in vitro, in animals, and in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (2), 708-713 (1998).
  13. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Differences in in vivo cellular kinetics in abdominal and femoral subcutaneous adipose tissue in women. Diabetes. 65 (6), 1642-1647 (2016).
  14. Tchoukalova, Y. D., et al. In vivo adipogenesis in rats measured by cell kinetics in adipocytes and plastic-adherent stroma-vascular cells in response to high-fat diet and thiazolidinedione. Diabetes. 61 (1), 137-144 (2012).
  15. Jones, P. J., Leatherdale, S. T. Stable isotopes in clinical research: Safety reaffirmed. Clinical Science. 80 (4), 277-280 (1991).
  16. Bacchus-Souffan, C., et al. Relationship between CD4 T cell turnover, cellular differentiation and HIV persistence during ART. PLoS Pathogens. 17 (1), e1009214(2021).
  17. Simonato, M., et al. Disaturated-phosphatidylcholine and surfactant protein-B turnover in human acute lung injury and in control patients. Respiratory Research. 12 (1), 36(2011).
  18. Tremoy, G., et al. Measurements of water vapor isotope ratios with wavelength-scanned cavity ring-down spectroscopy technology: New insights and important caveats for deuterium excess measurements in tropical areas in comparison with isotope-ratio mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (23), 3469-3480 (2011).
  19. dos Santos, T. H. R., Zucchi, M. D., Lemaire, T. J., de Azevedo, A. E. G., Viola, D. N. A statistical analysis of IRMS and CRDS methods in isotopic ratios of H-2/H-1 and O-18/O-16 in water. Sn Applied Sciences. 1, 664(2019).
  20. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols. 4 (1), 102-106 (2009).
  21. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  22. Patterson, B. W., Zhao, G., Klein, S. Improved accuracy and precision of gas chromatography/mass spectrometry measurements for metabolic tracers. Metabolism. 47 (6), 706-712 (1998).
  23. Mazzarello, A. N., Fitch, M., Hellerstein, M. K., Chiorazzi, N. Measurement of leukemic B-cell growth kinetics in patients with chronic lymphocytic leukemia. Methods in Molecular Biology. 1881, 129-151 (2019).
  24. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: A technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263, E988-E1001 (1992).
  25. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  26. Allerton, T. D., et al. Exercise reduced the formation of new adipocytes in the adipose tissue of mice in vivo. PLoS One. 16 (1), e0244804(2021).
  27. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Association of in vivo adipose tissue cellular kinetics with markers of metabolic health in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (7), 2171-2178 (2017).
  28. White, U., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Adipose depot-specific effects of 16 weeks of pioglitazone on in vivo adipogenesis in women with obesity: A randomised controlled trial. Diabetologia. 64 (1), 159-167 (2021).
  29. Steele, R. Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Annals of the New York Academy of Sciences. 82, 420-430 (1959).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

In vivo labelingdeuteriumlabelingadipose turnoverwit vetweefselcelturnovermeting van adipogenesemenselijk vetmetabolismeadipocytvormingmetabole gezondheid

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.