Recente vooruitgang en beste praktijken voor cryo-EM-analyse voor eiwitstructuurbepaling

Julien Bergeron; Chiara Rapisarda

doi:10.3791/64907

Methodenartikel

Recente vooruitgang en beste praktijken voor cryo-EM-analyse voor eiwitstructuurbepaling

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64907

⸱

10 februari 2023

Julien Bergeron¹ , Chiara Rapisarda²

¹Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, King’s College London, ²Bio Structure and Biophysics (BSB), Sanofi

In dit artikel

Samenvatting

BESPREKTE ARTIKELEN:

de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Bereiding van steunfilms voor monsters in transmissie-elektronenmicroscopie met behulp van een steunzwevend blok. Journal of Visualized Experiments. (170), doi:10.3791/62321 (2021).

Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Snelle roosterbereiding voor tijdsgebonden cryo-elektronenmicroscopie. Journal of Visualized Experiments. (177), doi:10.3791/62199 (2021).

Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-elektronenmicroscopische roosterbereiding voor tijdsgebonden studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. (168), doi:10.3791/62271 (2021).

Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A., Jr. Handmatig blot-en-duikvriezen van biologische monsters voor enkele-deeltje cryogene elektronenmicroscopie. Journal of Visualized Experiments. (180), doi:10.3791/62765 (2022).

Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microkristalelektronendiffractie van kleine moleculen. Journal of Visualized Experiments. (169), doi:10.3791/62313 (2021).

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. Bereiding van lamellen van glasachtige biologische monsters met behulp van een dual-beam scannen elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie. Journal of Visualized Experiments. (174), doi:10.3791/62350 (2021).

Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, een informatiebeheersysteem voor CryoEM-experimenten. Journal of Visualized Experiments. (172), doi:10.3791/62377 (2021).

Redactioneel

Sinds het ontstaan van directe elektronendetectoren en de verbetering van software en hardware, is cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) een techniek geworden die het routinematig mogelijk maakt voor onderzoekers om de structuur van macromoleculen tot bijna-atomair detail te bepalen¹^,². Deze versnelling is gekatalyseerd door een extreem snel tempo van nieuwe ontwikkelingen, van monstervoorbereiding tot dataverzameling en -verwerking. Om een brede democratisering van deze techniek voor niet-experts mogelijk te maken, zijn efficiëntere en toegankelijkere pipelines gecreëerd. Opvallend is dat cryo-EM, minder dan 10 jaar na de “resolutierevolutie”, een essentiële techniek is geworden voor eiwitkarakterisering, zowel in de academische wereld als in de industrie³^,⁴.

Een van de meest opmerkelijke aspecten van de cryo-EM-onderzoeksgemeenschap is de bereidheid om protocollen, strategieën en software openlijk te delen⁵. Deze openheid van technologie en expertise heeft aanzienlijk bijgedragen aan het zeer snelle tempo van ontwikkeling, maar sommige knelpunten blijven het volledig toegankelijk maken verhinderen. In deze methodecollectie beschrijven we enkele van de recente ontwikkelingen in de voorbereiding van roosters die geschikt zijn voor structurele analyse door cryo-EM, wat samen met toegang tot de hardware voor data-analyse, het grootste knelpunt is voor veel projecten. We bespreken ook nieuwe protocollen die momenteel in ontwikkeling zijn in dit veld, voor nieuwe benaderingen in cryo-EM-analyses.

Zoals hierboven vermeld, is een van de huidige knelpunten voor de routinetoepassing van cryo-EM in het laboratorium de monstervoorbereiding. Er kunnen verschillende problemen optreden op het niveau van monstertoepassing op de roosters: het meest gebruikelijke is de voorkeursoriëntatie van het monster in ijs en de denaturering ervan op het lucht-water-interface. Het beschermen van het monster tegen het lucht-water-interface is een oplossing voor dit probleem, door het gebruik van steunfilms van koolstof of grafeen die fysiek voorkomen dat het monster in contact komt met de lucht. Om het aanbrengen van dunne films op roosters te vergemakkelijken, hebben de Martin Garrido et al.⁶ een steunzwevend blok ontwikkeld dat door een 3D-printer wordt geproduceerd en dat kleine druppels water en monster op een gecontroleerde manier toelaat. Met behulp van dit blok worden de grafeen- en koolstoflagen op een goedkope en gebruiksvriendelijke manier afgezet.

Een andere manier om de schade aan het lucht-water-interface te voorkomen, is om de tijd dat het eiwit wordt blootgesteld aan de atmosfeer te beperken. Hiervoor gebruiken twee verschillende instrumenten, ontwikkeld door Klebs et al.⁷ en Budell et al.⁸, nieuwe benaderingen voor snelle (zo laag als 10 ms) roostervoorbereiding, waardoor de kans op problemen met de oriëntatie van deeltjes wordt verkleind. Een ander voordeel van deze apparaten is de mogelijkheid om tijdsafhankelijke experimenten uit te voeren, een opwindende nieuwe grens voor structurele studies.

In een contrasterende aanpak rapporteren Nguyen et al.⁹ een methode om roosters voor cryo-EM-analyse te bevriezen in afwezigheid van commerciële of op maat gemaakte apparaten, die ofwel erg duur of moeilijk te bouwen zijn. Ze laten zien hoe roosters van vergelijkbare kwaliteit kunnen worden verkregen met behulp van een goedkope, zelfgemaakte inrichting die geen dure instrumenten vereist, wat bijdraagt aan de democratisering van cryo-EM.

In cryo-EM is het monster van belang niet altijd een eiwit, maar kan in plaats daarvan een klein molecuul of een groot biologisch systeem zoals een hele cel zijn. De voorbereiding van dergelijke monsters is uniek en vereist specifieke stappen, evenals verschillende strategieën bij gegevensverzameling.

Voor microkristallen elektronendiffractie (MicroED) is het monster dat moet worden bestudeerd een kleine chemische stof die meestal in de vorm van een poeder wordt aangetroffen. Het poeder wordt direct op het EM-rooster aangebracht om een kristallijne vorm te behouden. De gegevensverzameling wordt vervolgens uitgevoerd in diffractiemodus, zoals getoond door Martynowycz en Gonen¹⁰. In tegenstelling daarmee zijn hele cellen te dik voor cryo-EM-analyse. Om dit aan te pakken, rapporteren Bisson et al. een methode om een SEM te gebruiken om fysiek in zo'n monster te boren, om dunne secties te verkrijgen die geschikt zijn voor structurele studies¹¹.

Van monster tot structuur is het belangrijk om voor elke stap van het proces een record bij te houden, omdat veel parameters worden gewijzigd voor elk eiwitmonster, van eiwitconcentratie tot microscoopinstellingen en gegevensanalyse. Daartoe hebben Wypych et al.¹² een webgebaseerde informatiebeheertool ontwikkeld die gebruikers in staat stelt hun werkstroom te organiseren en alle details bij te houden die nodig zijn voor toekomstige publicaties. Dit is vooral van cruciaal belang omdat automatisering steeds meer gebruikelijk wordt in cryo-EM, vooral in industriële omgevingen.

Cryo-EM heeft in het afgelopen decennium een uitstekend tempo gehad, zowel op het gebied van hardware als software. Om de wijdverbreide verspreiding van beste praktijken en de brede acceptatie van nieuwe methoden te garanderen, is een transparante reeks protocollen noodzakelijk. Dit speciale nummer zal bijdragen aan deze inspanning.

Dankbetuigingen

JB erkent financiering van BBSRC (BB/R009759/2) en HFSP (RGY0080/2021).

Referenties

Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Smith, M. T. J., Rubinstein, J. L. Beyond blob-ology. Science. 345 (6197), 617-619 (2014).
Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. 91, 1-32 (2022).
Wigge, C., Stefanovic, A., Radjainia, M. The rapidly evolving role of cryo-EM in drug design. Drug Discovery Today. Technologies. 38, 91-102 (2020).
Tachibana, C. Democratizing cryo-EM: Broadening access to an expanding field. Science. 367 (6484), 1394(2020).
de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Preparation of sample support films in transmission electron microscopy using a support floatation block. Journal of Visualized Experiments. (170), e62321(2021).
Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (177), e62199(2021).
Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-Electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. (168), e62271(2021).
Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).
Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microcrystal electron diffraction of small molecules. Journal of Visualized Experiments. (169), e62313(2021).
Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. Preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (174), e62350(2021).
Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, an information management system for CryoEM experiments. Journal of Visualized Experiments. (172), e62377(2021).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Cryogenic Electron Microscopy Sample Support Films Grid Preparation Time-resolved Cryo-electron Microscopy Robotic System Manual Blot-and-plunge Freezing Microcrystal Electron Diffraction Cryo-electron Tomography Information Management System Biological Specimens