Methodenartikel

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

DOI:

10.3791/64913

⸱

7 april 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In meercellige organismen kunnen ontwikkelingsprogrammering en omgevingsreacties zeer uiteenlopend zijn in verschillende celtypen of zelfs binnen cellen, wat bekend staat als cellulaire heterogeniteit. In de afgelopen jaren zijn single-cell en cell-type isolatie in combinatie met next-generation sequencing (NGS) technieken belangrijke hulpmiddelen geworden voor het bestuderen van biologische processen bij single-cell resolutie. Het isoleren van plantencellen is echter relatief moeilijker vanwege de aanwezigheid van plantencelwanden, wat de toepassing van eencellige benaderingen in planten beperkt. Dit protocol beschrijft een robuuste procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)-gebaseerde eencellige en celtype-isolatie met plantencellen, die geschikt is voor downstream multi-omics-analyse en andere studies. Met behulp van Arabidopsis wortel fluorescerende markerlijnen, laten we zien hoe bepaalde celtypen, zoals xyleem-pool pericycle cellen, laterale wortel initiële cellen, laterale wortel cap cellen, cortexcellen en endodermale cellen, worden geïsoleerd. Bovendien is er ook een effectieve downstream transcriptoomanalysemethode met behulp van Smart-seq2 beschikbaar. De celisolatiemethode en transcriptoomanalysetechnieken kunnen worden aangepast aan andere celtypen en plantensoorten en hebben een breed toepassingspotentieel in de plantenwetenschap.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen zijn de fundamentele eenheid van alle levende organismen en vervullen structurele en fysiologische functies. Hoewel de cellen in meercellige organismen schijnbare synchroniciteit vertonen, vertonen cellen van verschillende typen en individuele cellen verschillen in hun transcriptomen tijdens ontwikkeling en omgevingsreacties. High-throughput single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) biedt ongekende kracht voor het begrijpen van cellulaire heterogeniteit. Het toepassen van scRNA-seq in de plantenwetenschappen heeft bijgedragen aan het succesvol construeren van een plantencelatlas1, is gebruikt om zeldzame cellulaire taxa in plantenweefsels2 te identificeren, heeft inzicht gegeven in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels en is gebruikt om cellulaire identiteit en belangrijke functies te identificeren die worden gebruikt tijdens de ontwikkeling en differentiatie van planten. Daarnaast is het mogelijk om spatiotemporale ontwikkelingstrajecten in plantenweefsels 1,2,3 af te leiden om nieuwe markergenen 4 te ontdekken en de functies van belangrijke transcriptiefactoren5 te bestuderen met behulp van scRNA-seq om het evolutionaire behoud van hetzelfde celtype in verschillende planten te onthullen 3. Abiotische spanningen behoren tot de belangrijkste omgevingsinvloeden op de groei en ontwikkeling van planten. Door de veranderingen in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels onder verschillende behandelingsomstandigheden te onderzoeken door middel van single-cell transcriptoomsequencing, kan men ook het abiotische stressresponsmechanismeoplossen 6.

Het potentieel voor het oplossen van transcriptionele heterogeniteit tussen celtypen met behulp van scRNA-sequencing hangt af van de celisolatiemethode en het sequencingplatform. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een veelgebruikte techniek voor het isoleren van een subpopulatie van cellen voor scRNA-seq op basis van lichtverstrooiing en de fluorescentie-eigenschappen van de cellen. De ontwikkeling van fluorescerende markerlijnen door transgene technologie heeft de efficiëntie van celisolatie door FACS7 sterk verbeterd. Het uitvoeren van scRNA-seq met behulp van Smart-seq28 verbetert verder het vermogen om de cellulaire heterogeniteit te ontleden. De Smart-seq2-methode heeft een goede gevoeligheid voor gendetectie en kan genen detecteren, zelfs met een lage transcriptinvoer9. Naast het verzamelen van bulkcellen bieden moderne celsorteerders een sorteerformaat voor één celindex, waardoor transcriptoomanalyse met eencellige resolutie mogelijk is met behulp van Smart-seq210 of andere gemultiplexte RNA-seq-methoden, zoals CEL-seq211. Eencellige of celachtige sortering kan mogelijk worden gebruikt voor vele andere downstream-toepassingen, zoals parallelle multi-omics-studies12,13. Hier wordt een robuust en veelzijdig protocol gepresenteerd voor het isoleren van plantenceltypen, zoals xyleempolige pericyclecellen, laterale wortelkapcellen, laterale wortelinitiële cellen, cortexcellen en endodermale cellen uit de wortels van Arabidopsis thaliana markercellijnen door FACS. Het protocol omvat verder het bouwen van de Smart-seq2-bibliotheek voor downstream transcriptoomanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor A. thaliana wild-type (WT) zaden zonder fluorescentie en fluorescerende markerlijnen voor de volgende wortelceltypen: xyleempolige pericyclecellen (J0121), laterale wortelinitiële cellen, laterale wortelkapcellen (J3411), endodermis- en cortexcellen (J0571) (figuur 1A). Alle markerlijnen werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen), behalve de laterale wortelinitiatiecelmarkeringslijn, die werd gegenereerd door de introductie van een GATA23-promotorgestuurde GFP-constructie in een wild-type Arabidopsis-plant na een eerder gepubliceerd rapport14.

1. Bereiding van het plantmateriaal

  1. Steriliseer de A. thaliana WT-zaden en fluorescerende markerlijnzaden door de zaden gedurende 15 minuten in 20% bleekmiddel in een roterende incubator bij kamertemperatuur te incuberen.
  2. Spoel de zaden drie tot vijf keer af in dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Voer deze stap uit op een steriele schone bank.
  3. Plak de WT en reporter lijn zaden op halve sterkte Murashige en Skoog (MS) medium met 0,8% agar (w/v)15. Laat de planten verticaal groeien gedurende 5 dagen (16 uur licht bij 23 °C) na 2 dagen stratificeren bij 4 °C.

2. Protoplasting

  1. Bereid de protoplastoplossingen2,5, aangeduid als oplossing A en oplossing B (zie materiaaltabel).
    1. Bereid oplossing A met 400 mM mannitol, 0,05% BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 en 20 mM KCl (zie materiaaltabel). Bewaar oplossing A bij −20 °C gedurende maximaal 1 maand.
    2. Bereid oplossing B door toevoeging van 1% (w/v) cellulase R10, 1% (w/v) cellulase RS, 1% (w/v) hemicellulase, 0,5% (w/v) pectolyase en 1% (w/v) macerozym R10 in een vers aliquot van oplossing A. Bewaar oplossing B bij −20 °C gedurende maximaal 1 maand.
  2. Ontdooi oplossing A en oplossing B voorzichtig op ijs voordat u aan het experiment begint.
  3. Knip de wortels af met een schoon mes of schaar en hak de wortels in stukjes van ~ 0,5 cm. Dompel de wortels onder in 1,5 ml oplossing B, gevolgd door een zachte rotatie (bij ongeveer 18 tpm) bij kamertemperatuur gedurende 1,5-2 uur.
  4. Filter de wortelprotoplasten door het zeefgaas van 40 μm (zie materiaaltabel).
  5. Spoel het zeefgaas af met 1-2 ml oplossing A.
  6. Combineer de vloeistoffen van stap 2.4 en stap 2.5 en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C op 300 x g . Gooi het supernatant weg met een pipet, resuspensie van de celkorrel in 500-600 μL oplossing A en plaats deze onmiddellijk op ijs.
  7. Breng de geresuspendeerde celoplossing over in een nieuwe reageerbuis van 5 ml voor celsortering.

3. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)

  1. Schakel de stappen voor het instellen van het instrument op de sorteerder in en voltooi deze (zie Materiaaltabel). Selecteer de fluorescentiekanalen, gebruik een WT-installatie (geen fluorescentie) als controle om de basislijn voor autofluorescentie te bepalen en pas de sorteerpoort aan op basis van de fluorescentie-intensiteit en FSC / SSC-singlets (figuur 2).
  2. Voeg 500 μL oplossing A (stap 2.1.1) toe aan een opvangbuis van 1,5 ml om te voorkomen dat de cellen worden beschadigd. Verzamel 2.000-3.000 cellen per buis.
  3. Plaats de monsters na het sorteren onmiddellijk op ijs, centrifugeer de opvangbuis met de cellen gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 x g en verwijder het supernatant met een pipet.
  4. Neem 2 μL gesorteerde cellen en controleer op fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop (zie tabel met materialen).
  5. Bewaar de gesorteerde cellen bij −80 °C, of gebruik ze onmiddellijk voor het samenstellen van de bibliotheek (stap 4).
  6. Voor het sorteren van eencellige indexen plaatst u de 96-putplaat in de adapter. Kalibreer de positie van de plaat zodat de druppel in het middelste gat van de plaat valt. Selecteer de sorteermodus met één cel bij het sorteren, voer het doelaantal gesorteerde cellen in als 1 en begin met sorteren.

4. Smart-seq2 bibliotheek voorbereiding

  1. Als gevolg van de ultralage hoeveelheid invoer, voert u de constructie van een RNA-seq-bibliotheek van het type één cel uit in een contaminatievrije omgeving. Voordat u met het experiment begint, reinigt u de bank met een oppervlakteverontreiniging8 (zie materiaaltabel) en 75% ethanol.
  2. Bereid lysisbuffer (mengsel A) (tabel 1) voor door 0,33 μl 10% Triton X-100, 0,55 μl RNaseremmer en 0,22 μl 0,1 M DTT te combineren (zie materiaaltabel).
  3. Voeg 1 μL mengsel A toe aan het gesorteerde monster en maal met een steriele stamper. Het bij voorkeur gewenste monstervolume is ≤0,5 μl; gebruik RNase-vrij water om het volume aan te vullen tot 14 μL. Breng elk afzonderlijk celmonster over in een dunwandige PCR-buis van 0,2 ml.
  4. Bereid mengsel B met 0,44 μl oligo-dT 30 VN reverse transcriptie (RT) reactieprimer (100 μM) en 4,4 μl dNTP's (10mM) (tabel 2) (zie materiaaltabel).
  5. Voeg 4,4 μl mengsel B toe aan de 14 μl monster in elke buis, pipetteer voorzichtig om het monster te mengen en incubeer het monster gedurende 3 minuten bij 72 °C. Na incubatie worden de monsters onmiddellijk op ijs gezet om de oligo-dT te hybridiseren naar de poly A-staart.
  6. Bereid het omgekeerde transcriptiereactiemengsel (mengsel C) (tabel 3) (zie materiaaltabel). Voeg 21,6 μl mengsel C toe aan elke buis die de monsters bevat. Schakel het RT-programma in op een gemeenschappelijk PCR-instrument (tabel 4).
  7. Voer de voorversterkingsreactie uit op ijs. Bereid mengsel D door 44 μL 2x PCR-polymerasemengsel en 0,88 μL IS PCR-primer (10 μM) (tabel 5) te combineren (zie materiaaltabel). Voeg 40,8 μl mengsel D toe aan de 40 μl RT-reactieproduct en voer het voorversterkerprogramma uit (tabel 6).
  8. Zuiver de voorversterkingsreactieproducten met Ampure XP-kralen (zie materiaaltabel). Voeg 48 μL kralen (0,6:1 verhouding) toe aan elk monster uit stap 4.7 en meng de monsters voorzichtig door te pipetteren.
  9. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Plaats de buisjes van 1,5 ml met de monsters gedurende 5 minuten op een magnetische scheidingsstandaard. Gooi het supernatant voorzichtig uit de monsters weg zonder de kralen te verstoren.
  10. Was de kralen door ze opnieuw te gebruiken in 200 μL 80% ethanol en plaats de monsters nog eens 3 minuten op de magnetische scheidingsstandaard (zie materiaaltabel) voordat u het ethanolhoudende supernatant weggooit.
  11. Droog de monsters gedurende 10 minuten aan de lucht en bedek de buis om verontreiniging en kruisbesmetting tijdens het drogen aan de lucht te voorkomen.
  12. Resuspendeer de kralen in 20 μL ddH2O, incuber de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en plaats ze vervolgens gedurende 5 minuten op de magnetische scheidingsstandaard.
  13. Pipetteer 18 μL van het supernatant uit elke buis en breng de monsters over in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml. Gebruik 1 μL van het monster om de kwaliteit van het cDNA te beoordelen met behulp van een DNA-kwantificeringskit, bepaal de grootteverdeling van elke prebibliotheek met behulp van een fragmentanalysator (zie materiaaltabel) en bewaar het resterende monster bij −20 °C.
  14. Bouw een cDNA-bibliotheek8 voor Illumina-sequencing 16 uit het prebibliotheekproduct van stap4.13 met behulp van een voorbereidingskit voor sequencingbibliotheken (zie Materiaaltabel).
  15. Zuiver de bibliotheken (vanaf stap 4.14) met behulp van de Ampure XP-kralen, kwantificeer de gezuiverde bibliotheken en bepaal de grootteverdeling van elke bibliotheek volgens stap 4.13.
    OPMERKING: Pool gelijke nanomol van elke bibliotheek en zorg ervoor dat geen van hen dezelfde combinatie van Illumina-index heeft. Anders kunnen de bibliotheken worden samengevoegd in een verhouding op basis van de gewenste sequencing-uitvoer en samen worden gesequenced op dezelfde baan van de Illumina-sequencer. Over het algemeen biedt het sequentiëren van elke bibliotheek tot een diepte van 4-6 GB, wat > 10 miljoen in kaart gebrachte lezingen oplevert, 20x-30x dekking van het Arabidopsis-genoom . Lagere sequencingdiepten zijn ook acceptabel, maar kunnen van invloed zijn op de betekenis van de differentiaalexpressieanalyse.

5. RNA-seq data-analyse

  1. Trim de onbewerkte reads met Trim-Galore17 gevolgd door mapping naar het referentiegenoom met behulp van hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2), en verwijder de PCR gedupliceerde fragmenten met Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
  2. Voer de ruwe tellingsverwerking en daaropvolgende analyse van de differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG) uit met DESeq220 met behulp van ten minste drie biologische replicaties voor elk monster. Voer clustering van de genexpressie uit met het Pheatmap-pakket en visualiseer in een expressie-heatmap.
    OPMERKING: De RPKM-waarden (reads per kilobase per million mapped reads) van de genen en de TSE's (transponeerbare elementen) werden berekend met Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) en gevisualiseerd in een genoombrowser.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protoplast isolatie
Dit protocol is effectief voor de protoplastsortering van fluorescerende A. thaliana wortelmarkeringslijnen. Deze markerlijnen zijn ontwikkeld door de fusie van fluorescerende eiwitten met genen die specifiek tot expressie komen in doelceltypen, of met behulp van enhancer trap-lijnen (figuur 1). Talrijke weefsels en organen zijn ontleed in celtypen die specifieke fluorescerende markers in modelplanten en gewassen tot expressie brengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het op Smart-seq2 gebaseerde protocol kan betrouwbare sequencingbibliotheken genereren uit enkele honderden cellen8. De kwaliteit van het uitgangsmateriaal is essentieel voor de nauwkeurigheid van de transcriptoomanalyse. FACS is een krachtig hulpmiddel voor het voorbereiden van cellen van belang, maar deze procedure, met name de protoplastische stap, moet worden geoptimaliseerd voor plantaardige toepassingen. Laser capture microdissection (LCM) of handmatig ontleedde cellen kunnen ook worden gebr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben dit protocol opgezet in de eencellige multi-omics-faciliteit van de School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, en werden ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), het Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) en Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µm zeefSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent fragment analyzerAglientAglient 5200
Agilent high-sensitivity DNA kitAglientDNF-474-0500
Ampure XP beadsBECKMANA63881
BetaineyuanyeS18046-100g
BleekMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) bleek
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Japan)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Japan)9012-54-8
Centrifugebuis (1,5 mL)Eppendolf30121589
DNase, RNase, DNA en RNA Away oppervlakteontsmettingsmiddelenBeyotimeR0127
dNTPs (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 M)
invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Filtertip  (1000 µL)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filtertip  (200 µL)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filtertip (10 µL)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filtertip (100 µL)Thermo ScientificTF113-100-Q
Fluorescente microscoopNikonEclipse Ni-E
Vierdimensionale roterende mixerKylin -BellBE-1100
Hemicellulasesigma9025-56-3
IS PCR-primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)Roche 7958935001
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Japan)9032-75-1
Magnetische scheidingsstandaardinvitrogen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MicrocentrifugesEppendorfCentrifuge 5425
Micro-mini-centrifugeTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Library Preparation KitilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN-primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'
PCR-instrumentThermische cyclerA24811
PectolyaseYakult (Japan)9033-35-6
Plant marker linesNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 fluorometerinvitrogenQ32866
RNase-remmer Thermo ScientificEO0382
RNase-vrije waterinvitrogen10977023
Oplossing A400 mM mannitol, 0,05 % BSA, 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Oplossing B1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %  (w/v)hemicellulase, 0,5 %  (w/v)pectolyase en 1 %  (w/v) Macerozyme R10 in een verse aliquot van oplossing A
Steriele stamperBIOTREAT453463
Zeef (40 µm )Sorfa 251100
SuperScript IV reverse transcriptase (200 U/µL)invitrogen18090050
SuperScript IV buffer (5x)invitrogen18090050
Reagenbuiis (5 mL)BD Falcon352052
Dünnwandige PCR-Röhrchen mit Kappen (0,5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO-primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'
VortexTitanVM-T2
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
  4. Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
  5. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
  6. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
  7. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  8. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  9. Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
  10. Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
  11. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  12. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  13. Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
  14. De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
  15. Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
  16. Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
  17. Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).
  18. Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
  19. Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  21. Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
  22. Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
  23. Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
  24. Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
  25. Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  26. Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
  27. Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van plantencellensingle cell sequencingfluorescence activated cell sortingArabidopsis wortelcellensorteren van protoplastenRNA sequencingSmart seq2 protocolceltypeheterogeniteitmulti omics analyse

Gerelateerde artikelen