$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deze studie werd goedgekeurd door de Pennsylvania State University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Weefselvoorbereiding
- Oogst voor dit protocol de achillespezen van 2-4 maanden oude mannelijke C57BL / 6-muizen.
OPMERKING: Verschillende pezen of ligamenten van muizen of andere kleine dieren kunnen ook worden gebruikt.- Maak een incisie in de huid oppervlakkig naar de achillespees om de plantarispees en het omliggende bindweefsel bloot te leggen. Verwijder ze vervolgens met een chirurgisch mes.
- Scheid de blootgestelde soleus- en gastrocnemiusspieren van de achterpoot en schraap ze voorzichtig van de achillespees met het chirurgische mes
- Scheid de calcaneus van de rest van de voet met een snijwielbevestiging op een roterend gereedschap.
- Kleur het weefsel in 1,5 ml van een 5 μg/ml oplossing van 5-(4,6-dichloortriazinyl) aminofluoresceïne (DTAF) en 0,1 M natriumbicarbonaatbuffer gedurende 20 minuten op een roterende mixer bij kamertemperatuur. Deze oplossing kleurt eiwitten (bijv. Extracellulaire matrix) in het weefsel.
OPMERKING: Tijdens deze periode van 20 minuten moet stap 1.3 worden voltooid.
- Bereid een 1:1.000 oplossing van DRAQ5 in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om de kernen te kleuren. Gebruik een vortexmixer om de oplossing te homogeniseren.
- Breng na de incubatietijd van 20 minuten in stap 1.2 het weefsel over van de DTAF-oplossing naar de DRAQ5-oplossing en incubeer gedurende 10 minuten in een donkere ruimte bij kamertemperatuur.
2. Peesbelasting en beeldacquisitie
OPMERKING: Dit protocol vereist een trekapparaat dat bovenop een confocale microscoop kan worden gemonteerd. Voor deze studie werd het microtensile apparaat beschreven door Peterson en Szczesny13 gebruikt.
- Plaats de pees in de grepen van de trekbelasting. Voordat u de handgrepen in de laadinrichting monteert, gebruikt u digitale remklauwen om de afstand tussen het calcaneus-hulpstuk en de tegenovergestelde greep te meten. Deze afstand is de lengte van de peesmeter.
- U kunt ook de grepen in de laadinrichting monteren voordat u de pees inbrengt en in contact duwen om de positie van de motor zonder verplaatsing te bepalen. De verplaatsing van de motoren na het inbrengen van de pees zou een potentieel nauwkeurigere grip-to-grip meterlengte kunnen bieden.
- Monteer de grepen in het laadapparaat, dat PBS bevat om de weefselhydratatie te behouden. Lijn de pees zo goed mogelijk uit met de x-as of y-as van de microscoopbeelden, zodat de x-rek- en y-rekuitgangen van het algoritme overeenkomen met de peesassen.
OPMERKING: In deze studie werden de pezen uitgelijnd met de x-as. Als het niet mogelijk is om de pees perfect uit te lijnen met de beeldassen, dan kunnen de x-strain en y-strain outputs van het algoritme worden getransformeerd om uit te lijnen met de longitudinale / loodrechte assen van de pees met behulp van standaard spanningstransformatievergelijkingen14.
- Laad de pees voor met 1 g spanning en pas, indien gewenst, cyclische belasting toe om het monster voor te bereiden. In dit protocol werd geen voorconditionering gebruikt, omdat het doel van de studie was om de gemeten lokale weefselstammen te valideren in plaats van de eigenschappen van het weefselmateriaal te meten. Als er interesse is in het meten van de materiaaleigenschappen op macroschaal, die afhankelijk zijn van de laadgeschiedenis, dan is voorconditionering aan te bevelen. Na het conditioneren en herstellen, opnieuw aanbrengen van een voorspanning van 1 g.
- Indien gewenst, fotobleekt een set van vier lijnen met een onderlinge afstand van 80 μm in het middengebied van het weefsel (zie Peterson en Szczesny13 voor meer details).
OPMERKING: De gefotobleekte lijnen werden gebruikt om de metingen van het ALDIC-algoritme te valideren en zijn niet nodig voor het uitvoeren van de ALDIC zelf. Het aantal en de afstand van de lijnen kunnen worden aangepast en de locatie van de lijnen moet worden gekozen om artefacten in de steekproef te voorkomen die de helderheid van de lijn zouden verminderen.
- Herhaal de fotobleekprocedure aan de linker- en rechteruiteinden van het weefsel in de buurt van de grepen.
- Verkrijg met behulp van de confocale microscoop volumetrische beelden (x,y: 1,25 μm/pixel, z: 2,5 μm/pixel) van de DTAF- en DRAQ5-fluorescentie bij 1 g voorspanning.
- Voer een rekhelling uit met een spanning van 0,5% /s tot 2%. Merk op dat de reksnelheid en de incrementele spanningsgrootte kunnen worden aangepast.
- Laat het weefsel 10 minuten stressen.
OPMERKING: De duur van de ontspanning van de spanning moet zodanig worden gekozen dat het monster tijdens de beeldacquisitie onder een ongeveer quasistatische belasting staat. Om te bepalen of de duur van de stressontspanning acceptabel is, bepaalt u de helling van de kracht-tijdcurve tijdens de laatste minuut van de stressontspanning (aanvullende figuur 1) en vermenigvuldigt u deze helling met de totale beeldduur. In deze studie veranderde de kracht die werd uitgeoefend bij de grootste rektoename nooit met meer dan 5%.
- Neem nog een volumetrisch beeld van het weefsel na vervorming.
- Herhaal stap 2.7-2.9 totdat de gewenste laatste stam is bereikt. In dit artikel is gekozen voor een uiteindelijke rekwaarde van 12%.
3. Beeldverwerking
- Gebruik ImageJ of Fiji om maximale z-projecties te maken van elk volumetrische beeld van het DRAQ5 (nucleaire) kanaal. Dit zal dienen als de 2D-gespikkelde beelden voor de ALDIC.
- Sla de z-projecties met maximale intensiteit op als .tiff bestanden en geef ze een naam volgens de volgende naamgevingsconventie.
- Gebruik een getal als eerste teken van de afbeeldingsnaam.
- Laat het nummer overeenkomen met de volgorde waarin de beelden tijdens de stamanalyse worden bekeken. De eerste afbeelding moet bijvoorbeeld met één beginnen en de tweede afbeelding moet met twee beginnen. Er kunnen verschillende getallen worden gekozen, maar ze moeten sequentieel toenemen. Een voorbeeld van een naamgevingsconventie is als volgt: "0_Experiment1_MaxZProjection".
- Sla alle hernoemde max-intensity z-projecties op in een map.
4. Fotogebleekte lijnanalysecode installatie en toepassing
OPMERKING: Deze stappen zijn alleen nodig als het gewenst is om de nauwkeurigheid van het ALDIC-algoritme te bevestigen met behulp van gebleekte lijnen. De code berekent de lokale weefselstam als de gemiddelde genormaliseerde verandering in afstand tussen elke gefotobleekte lijn binnen de gefotobleekte lijnset. In deze studie werden de gemiddelde lokale waarden vervolgens gemiddeld over alle gefotobleekte lijnsets (d.w.z. in het midden en de linker / rechteruiteinden) om een enkele gemiddelde lokale weefselstamwaarde voor elk monster te bepalen. Deze waarde werd vervolgens gebruikt om de nauwkeurigheid van het ALDIC-algoritme te schatten.
- Download de map "PGO-code" van GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) en verplaats alle inhoud naar de werkmap in MATLAB.
- Open het MATLAB-script "Micro_Mech_Template.m".
- Druk op Uitvoeren en selecteer een van de afbeeldingsbestanden met de volumetrische afbeeldingen. De volumetrische afbeeldingen kunnen een van de volgende bestandstypen zijn: .lsm, .tiff, .nd2.
- De software laadt automatisch alle afbeeldingen in de map en geeft een geprojecteerd beeld van de referentievolumetrische afbeelding weer. Wanneer u hierom wordt gevraagd, klikt u met de linkermuisknop om meerpuntslijnen te maken die de linker- en rechterkant van het voorbeeld volgen. Klik met de rechtermuisknop om een regel te beëindigen. Zodra de invoer is verwerkt en de randen correct zijn, drukt u op OK om het resultaat te accepteren.
- Teken een willekeurige diagonale lijn over het voorbeeld als referentielijn wanneer daarom wordt gevraagd.
- Voer het aantal gemaakte gefotobleekte lijnen in en volg de gebleekte lijnen met meerpuntslijnen.
- Als het resultaat acceptabel is, accepteer het dan. Als het resultaat onjuist is, pas het dan aan en verwerk het opnieuw.
- Herhaal stap 4.2 voor alle afbeeldingen en verplaats alle afbeeldingen van getraceerde lijnen naar één map.
- Open het script "Micro_Mech_Strain.m".
- Druk op Uitvoeren om de code uit te voeren en selecteer een van de opgeslagen afbeeldingen waar de gefotobleekte lijnen worden overgetrokken.
- Controleer of de geselecteerde begeleidende afbeeldingen correct zijn zodra de afbeelding is geselecteerd door op OK te drukken.
5. Digitaal getransformeerde afbeeldingen maken
OPMERKING: Deze stappen zijn alleen nodig als het gewenst is om de nauwkeurigheid van het ALDIC-algoritme te bevestigen met behulp van digitaal getransformeerde afbeeldingen. Deze beelden simuleren homogene 2D-spanningsvelden van een bekende omvang door het referentiebeeld kunstmatig te transformeren.
- Download de code "Digital_strain.m" van GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc).
- Open de code en voer deze uit.
- Wanneer u hierom wordt gevraagd, voegt u de gewenste waarden in voor de maximaal toegepaste stam, de toegepaste stamtoename en de verhouding van Poisson. Druk op OK.
OPMERKING: Voor dit experiment was de maximaal toegepaste stam 0,1 (10%), de toegepaste stamtoename was 0,02 (2%) en een Poisson-verhouding van 1 werd gebruikt, wat consistent is met experimentele gegevens van peestrektesten15,16. De code maakt gebruik van de ingesloten MATLAB-functie imwarp en de invoerwaarden (bijv. rekstappen, Poisson's ratio) om de digitaal getransformeerde afbeeldingen te maken.
- Selecteer desgevraagd de niet-gevormde referentieafbeelding.
- Voor elke stamtoename wordt een overlay van de referentieafbeelding en de getransformeerde afbeelding weergegeven. De getransformeerde afbeelding wordt opgeslagen in de map onder de titel "DigitallyTransformedX%Strain", waarbij X de stamtoename is.
6. Rekberekening en validatiecode installatie en toepassing
- Download de map "Strain Calculation and Validation Code" van GitHub (https://github.com/Szczesnytendon/TendonStrainCalc) en verplaats alle inhoud naar de MATLAB-werkmap
- Installeer een mex C/C++ compiler volgens Yang en Bhattacharya12. De stappen worden hieronder samengevat.
- Controleer MATLAB om te zien of er een mex C/C++ compiler is geïnstalleerd door "mex -setup" te typen in het MATLAB Command Window en op Enter te drukken.
- Als er een fout verschijnt die aangeeft dat een compiler niet wordt ondersteund of aanwezig is, gaat u verder met stap 6.3 en stap 6.4.
- Als er geen fout aanwezig is, gaat u verder met stap 6.5
- Om een mex C/C++ compiler te downloaden, ga naar "https:/tdm-gcc.tdragon.net/", en kies de TDM-gcc compiler.
- Installeer de gedownloade compiler op een bekende locatie.
- Ga terug naar het MATLAB-opdrachtvenster en typ: "setenv("MW_MINGW64_LOC","[Typ hier uw installatiepad]")". Dit kan bijvoorbeeld "setenv("MW_MINGW64_LOC","C:\TDM-GCC-64")" zijn. Als deze opdracht met succes wordt uitgevoerd, is de mex-compiler correct geïnstalleerd.
- Voer het functiescript "main_aldic.m" in en wijzig regel 22 zodat deze overeenkomt met de opdracht die in stap 6.5 is uitgevoerd.
- Open het script "Strain_calc_and_validate.m".
- Druk op Uitvoeren om de afbeeldingsanalyse te starten.
- Wijzig desgevraagd de waarden voor de ALDIC-parameters naar wens.
OPMERKING: De venstergrootte moet 0,25 tot 1 keer de grootte van de subset zijn. Voor meer informatie over de parameterkeuzes raadpleegt u de online gebruikershandleiding: (https://www.researchgate.net/publication/344796296_Augmented_Lagrangian_Digital
_Image_Correlation_AL-DIC_Code_Manual).- In dit onderzoek zijn de volgende waarden gebruikt:
Subset Grootte (pixels): 20
Venstergrootte (pixels): 10
Methode om ALDIC op te lossen: eindig verschil (1)
Parallel computing werd niet gebruikt (1)
Methode om de eerste schatting te berekenen: Multigrid-zoekopdracht op basis van afbeeldingspiramide (0)
- Schakel desgevraagd het selectievakje "Ja" in om het algoritme automatisch de gemiddelde waarde, standaarddeviatie en 2D-toewijzingen te laten opslaan voor de gewenste verzameling variabelen (bijvoorbeeld x-stam, y-stam, afschuifspanning, slechte regio's, enz.). Selecteer welke variabelen moeten worden opgeslagen en druk op OK.
- Wanneer u hierom wordt gevraagd, wijzigt u de parameters naar wens.
- In dit experiment werden de volgende waarden gebruikt:
Omringende punten om spanning te berekenen (numP): 12
Correlatiecoëfficiënt voor identificatie van slechte regio's (corr_threshold): 0,5
Subregiogrootte (pixels) voor slechte regioanalyse (subgrootte): 32
- Wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u de map met de hernoemde max-intensity z-projecties. Merk op dat de software automatisch incrementele ALDIC uitvoert om de spanningsvelden van de vervormde afbeeldingen te bepalen. Dat wil zeggen, elke vervormde afbeelding dient als de nieuwe "referentie" -afbeelding voor de volgende vervormde afbeelding. Dit verbetert de nauwkeurigheid van de resultaten (aanvullende figuur 2) in vergelijking met het uitvoeren van cumulatieve ALDIC, waarbij elk vervormd beeld wordt vergeleken met het oorspronkelijke (0% stam) referentiebeeld. Als u een cumulatieve analyse wilt uitvoeren, laadt u de afbeeldingen, maar selecteert u alleen de oorspronkelijke referentieafbeelding en de vervormde afbeelding van belang.
OPMERKING: De normale stam wordt berekend als λ - 1, waarbij λ de weefselrek is. De weefselrek wordt berekend volgens
, waarbij N = [1 0]T of [0 1]T voor respectievelijk de x-richting en de y-richting, en C = F T F, waarbij F de vervormingsgradiënt is die wordt berekend met behulp van "numP" -punten rond elke gegevenspuntuitvoer door het ALDIC-algoritme. De schuifspanning wordt berekend als
, waarbij
.
- Wanneer u hierom wordt gevraagd, klikt u met de linkermuisknop om een vierpuntsveelhoek te maken om het gebied te definiëren dat van belang is voor het meten van de stammen. Begin met het punt in de linkerbovenhoek en wijs de volgende punten met de klok mee toe.
OPMERKING: De variabele "Storage" die is opgeslagen in de MATLAB-werkruimte bevat alle waarden voor de gemiddelde x-strain, x-strain standaarddeviatie, gemiddelde y-strain, y-strain standaarddeviatie, gemiddelde shear strain, shear strain standard deviation en percentage bad regions. De slechte regio's worden gedefinieerd volgens de correlatiecoëfficiëntanalyse binnen de regio van belang die is geselecteerd in stap 6.13. De map "NuclearTrackingResults" (die kan worden hernoemd door de regels 555 en 556 aan te passen) slaat alle plots op die zijn opgegeven in stap 6.10. Deze map bevat ook een spreadsheetbestand met de naam "Resultaten", waarin alle gemiddelden en standaardafwijkingen worden opgeslagen die in stap 6.10 zijn gespecificeerd.