Het huidige protocol beschrijft een methode om menselijke en niet-menselijke van primaten urine-afgeleide cellen te isoleren, uit te breiden en te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), evenals instructies voor feedervrij onderhoud van de nieuw gegenereerde iPSC's.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cross-species benaderingen die primaat pluripotente stamcellen en hun derivaten bestuderen, zijn cruciaal om de moleculaire en cellulaire mechanismen van ziekte, ontwikkeling en evolutie beter te begrijpen. Om primaat geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) toegankelijker te maken, presenteert dit artikel een niet-invasieve methode om menselijke en niet-menselijke primaat iPSC's te genereren uit urine-afgeleide cellen, en hun onderhoud met behulp van een feeder-vrije kweekmethode.
De urine kan worden bemonsterd vanuit een niet-steriele omgeving (bijvoorbeeld de kooi van het dier) en worden behandeld met een breedspectrum antibioticacocktail tijdens de primaire celkweek om besmetting efficiënt te verminderen. Na voortplanting van de van urine afgeleide cellen worden iPSC's gegenereerd door een aangepaste transductiemethode van een in de handel verkrijgbaar Sendai-virusvectorsysteem. Eerste iPSC-kolonies kunnen al na 5 dagen zichtbaar zijn en kunnen op zijn vroegst na 10 dagen worden geplukt. Routinematige klomppassage met enzymvrije dissociatiebuffer ondersteunt de pluripotentie van de gegenereerde iPSC's gedurende meer dan 50 passages.
Inleiding
Genomische vergelijkingen van menselijke en niet-menselijke primaten (NHP's) zijn cruciaal om onze evolutionaire geschiedenis en de evolutie van mensspecifieke eigenschappente begrijpen 1. Bovendien maken deze vergelijkingen de gevolgtrekking van functie mogelijk door geconserveerde DNA-sequenties2 te identificeren, bijvoorbeeld om prioriteit te geven aan ziektegerelateerde varianten3. Vergelijkingen van moleculaire fenotypes zoals genexpressieniveaus zijn cruciaal om genomische vergelijkingen beter te interpreteren en om bijvoorbeeld cellulaire fenotypische verschillen te ontdekken. Bovendien heb....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze experimentele procedure werd goedgekeurd door de verantwoordelijke ethische commissie voor menselijke experimenten (20-122, Ethikkommission LMU München). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.
OPMERKING: Goedkeuring moet worden verkregen van de juiste ethische commissie voordat wordt begonnen met experimenten met menselijke en NHP-monsters. Alle experimentele procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Elk van de volgende stappen moet worden uitgevoerd met behulp van steriele techniek in een biologische veiligheidskast. Alle buffer- en media....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bij het isoleren van cellen uit menselijke en NHP-urine kunnen verschillende soorten cellen direct na isolatie worden geïdentificeerd. Plaveiselcellen, evenals verschillende kleinere ronde cellen, worden uitgescheiden met de urine; vrouwelijke urine bevat veel meer plaveiselcellen dan mannelijke urine (figuur 1B - dag 0; Aanvullende figuur S1). Na 5 dagen kweek in primair urinemedium zijn de eerste aanhangende prolifererende cellen te zien (figuur 1A,B
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
iPSC's zijn waardevolle celtypen omdat ze het mogelijk maken om anders ontoegankelijke celtypen in vitro te genereren. Omdat de uitgangsmaterialen voor herprogrammering, bijvoorbeeld fibroblasten, niet gemakkelijk beschikbaar zijn van alle primatensoorten, presenteert dit artikel een protocol voor het genereren van iPSC's uit van urine afgeleide cellen. Deze cellen kunnen op een niet-invasieve manier worden verkregen, zelfs uit niet-steriele urinemonsters van primaten, door het kweekmedium aan te vullen met bree.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door DFG EN 1093/5-1 (projectnummer 458247426). M.O. werd ondersteund door JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. Flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van de Core Facility Flow Cytometry in het Biomedical Center München. We willen Makoto Shida en Tomoyo Muto van ASHBi, Kyoto University, bedanken voor hun steun aan videografie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Accumax™ cel loslating oplossing (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Oplossing | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Muis Antilichaam | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-geconjugeerd Antilichaam | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Celvriesmedium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Rundserum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Celcultuur multiwell plaat, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II geautomatiseerde celteller | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes met 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Er kunnen verschillende soorten Cryotubes worden gebruikt om te bevriezen. De 2D barcode buizen hebben het voordeel dat de monsterinformatie kan worden opgeslagen in een database met unieke buisinformatie. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencie Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogrammeringskit (Sendai virus reprogrammeringskit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM Hoge Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 met L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Ezel anti-Muis IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Ezel anti-Konijn IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS zonder Calcium zonder Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyklonaal Konijn Antilichaam (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL kegelbodem | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL kegelbodem | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Foetaal Rundserum, gekwalificeerd, hitte geïnactiveerd, Brazilië (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatine uit varkenshuid | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Gekwalificeerd, Gereduceerd Groeifactor Basement Membraan Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe veiligheidskabinet | Kendro | 51017905 | |
| Menselijk EGF, premiumkwaliteit | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Versie 2.9.0 | |
| MEM Niet-Essentiële Aminozuren Oplossing (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugeerbuis PP, 1,5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscoop Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Muis anti-alpha-Fetoproteïne antilichaam | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Muis anti-alpha-Gladde Spier Actine antilichaam | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Muis anti-beta-III Tubuline antilichaam | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Konijn mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobieel Reagens) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Konijn Antilichaam | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicilline-Streptomycine mix bevat 100 U/mL Penicilline en 100 µg/mL Streptomycine. |
| Recombinant Menselijke FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Menselijke PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Gekoelde tafelcentrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Nierapicale Cel Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Nierapicale Cel Groei Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Muis mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Muis mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon |
Referenties
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
