Methodenartikel

Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine

DOI:

10.3791/64922

⸱

28 juli 2023

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een methode om menselijke en niet-menselijke van primaten urine-afgeleide cellen te isoleren, uit te breiden en te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), evenals instructies voor feedervrij onderhoud van de nieuw gegenereerde iPSC's.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cross-species benaderingen die primaat pluripotente stamcellen en hun derivaten bestuderen, zijn cruciaal om de moleculaire en cellulaire mechanismen van ziekte, ontwikkeling en evolutie beter te begrijpen. Om primaat geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) toegankelijker te maken, presenteert dit artikel een niet-invasieve methode om menselijke en niet-menselijke primaat iPSC's te genereren uit urine-afgeleide cellen, en hun onderhoud met behulp van een feeder-vrije kweekmethode.

De urine kan worden bemonsterd vanuit een niet-steriele omgeving (bijvoorbeeld de kooi van het dier) en worden behandeld met een breedspectrum antibioticacocktail tijdens de primaire celkweek om besmetting efficiënt te verminderen. Na voortplanting van de van urine afgeleide cellen worden iPSC's gegenereerd door een aangepaste transductiemethode van een in de handel verkrijgbaar Sendai-virusvectorsysteem. Eerste iPSC-kolonies kunnen al na 5 dagen zichtbaar zijn en kunnen op zijn vroegst na 10 dagen worden geplukt. Routinematige klomppassage met enzymvrije dissociatiebuffer ondersteunt de pluripotentie van de gegenereerde iPSC's gedurende meer dan 50 passages.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomische vergelijkingen van menselijke en niet-menselijke primaten (NHP's) zijn cruciaal om onze evolutionaire geschiedenis en de evolutie van mensspecifieke eigenschappente begrijpen 1. Bovendien maken deze vergelijkingen de gevolgtrekking van functie mogelijk door geconserveerde DNA-sequenties2 te identificeren, bijvoorbeeld om prioriteit te geven aan ziektegerelateerde varianten3. Vergelijkingen van moleculaire fenotypes zoals genexpressieniveaus zijn cruciaal om genomische vergelijkingen beter te interpreteren en om bijvoorbeeld cellulaire fenotypische verschillen te ontdekken. Bovendien hebben ze - vergelijkbaar met vergelijkingen op DNA-niveau - het potentieel om functionele relevantie af te leiden, en dus om medisch relevante variatie binnen mensen beter te interpreteren4. De opname van uitgebreide moleculaire fenotypische gegevens in deze vergelijkende studies vereist geschikte biologische middelen (d.w.z. orthologe cellen tussen soorten). Ethische en praktische redenen maken het echter moeilijk of onmogelijk om toegang te krijgen tot dergelijke vergelijkbare cellen, vooral tijdens de ontwikkeling. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) maken het mogelijk om dergelijke ontoegankelijke celtypen in vitro5,6 te genereren, zijn experimenteel toegankelijk en zijn gebruikt voor primatenvergelijkingen 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Om iPSC's te genereren, moet men de primaire cellen verwerven die opnieuw moeten worden geprogrammeerd. Cellen geïsoleerd uit urine hebben het voordeel dat ze niet-invasief kunnen worden bemonsterd van primaten en dat ze gemakkelijk kunnen worden geherprogrammeerd, waarschijnlijk vanwege hun stamcelachtige moleculaire profielen15. De kweekomstandigheden om iPSC's van primaten in stand te houden zijn net zo belangrijk als herprogrammering; klassiek vereiste de kweek van menselijke pluripotente stamcellen een niet-gedefinieerd, op serum gebaseerd medium en co-cultuur van embryonale fibroblasten van muizen - zogenaamde feedercellen - die essentiële voedingsstoffen en een steiger voor embryonale stamcellen (SER's) leveren16. Sinds de ontwikkeling van chemisch gedefinieerde en feedervrije kweeksystemen17,18, zijn er nu verschillende opties van commercieel verkrijgbare iPSC-kweekmedia en -matrices. De meeste van deze kweekomstandigheden zijn echter geoptimaliseerd voor menselijke SER's en iPSC's en werken daarom mogelijk minder goed in de NHP iPSC-cultuur. In dit videoprotocol geven we instructies voor het genereren en onderhouden van menselijke en NHP iPSC's afgeleid van urinecelkweek.

Sinds het eerste rapport van iPSC-generatie door de geforceerde expressie van gedefinieerde factoren in fibroblasten in 2006, is deze methode toegepast op veel verschillende celtypen van verschillende oorsprong 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Onder hen kunnen alleen van urine afgeleide cellen op een volledig niet-invasieve manier worden verkregen. Op basis van het eerder beschreven protocol van Zhou et al.33 kan men cellen isoleren en uitbreiden uit de urine van primaten, zelfs uit niet-steriele monsters, door breedspectrumantibiotica aan te vullen15. Met name urine-afgeleide cellen bemonsterd door dit protocol vertonen een hoog potentieel om iPSC's te produceren, binnen een kortere periode (kolonies worden zichtbaar in 5-15 dagen) dan de conventionele herprogrammering van fibroblasten (20-30 dagen, in onze ervaring), en met een voldoende hoog slagingspercentage. Deze van urine afgeleide cellen werden geclassificeerd als de gemengde populatie van mesenchymale stamcelachtige cellen en blaasepitheelcellen, waardoor de hoge herprogrammeringsefficiëntie werd veroorzaakt15.

Naast de variatie in primaire cellen, variëren de herprogrammeringsmethoden om iPSC's te genereren ook afhankelijk van het doel van het gebruik. Conventionele herprogrammeringsprocedures voor menselijke somatische cellen werden uitgevoerd door de overexpressie van herprogrammeringsfactoren met retrovirus- of lentivirusvectoren, waardoor de integratie van exogene DNA in het genoom 5,34,35 mogelijk werd. Om de gegenereerde iPSC's genomisch intact te houden, hebben onderzoekers een breed scala aan niet-integratiesystemen ontwikkeld - excisable PiggyBac-vector36,37, episomale vector38,39, niet-integrerende virusvectoren zoals Sendai-virus40 en adenovirus 41, mRNA-transfectie 42, eiwittransfectie 43,44 en behandeling met chemische verbindingen 45. Vanwege de efficiëntie en het gemak in de hantering, worden de Sendai-virusgebaseerde herprogrammeringsvectoren gebruikt in dit protocol. Infectie van primaire cellen wordt uitgevoerd in een 1 h suspensiecultuur van cellen en virussen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5 voorafgaand aan plating. Deze aangepaste stap zou de kans op contact tussen celoppervlakken en virussen kunnen vergroten, vergeleken met de conventionele methode waarbij de virussen rechtstreeks aan de aanhangende celcultuur worden toegevoegd en dus meer iPSC-kolonies opleveren15.

Passaging van menselijke en NHP pluripotente stamcellen kan worden gedaan door klonterpassing en eencellige passaging. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) is een kostenefficiënte chelaatvormer die calcium- en magnesiumionen bindt en zo de hechtende activiteit van cadherine en integrine voorkomt. EDTA wordt ook gebruikt als een mild, selectief dissociatiereagens, omdat ongedifferentieerde cellen zich losmaken voor gedifferentieerde cellen vanwege hun verschillende adhesiemoleculen. Volledige dissociatie induceert massale celdood van iPSC's van primaten via de Rho / Rho-geassocieerde coiled coil met eiwitkinase (Rho / Rock) -gemedieerde myosinehyperactivatie. Daarom is het aanvullen van het kweekmedium met een Rho/Rock-remmer essentieel voor experimenten waarbij enkele cellen in suspensie nodig zijn46,47. In dit protocol raden we clump passaging aan als de routinematige passaging-methode en bevelen we single-cell passaging alleen aan wanneer dit nodig is, bijvoorbeeld wanneer seeding van gedefinieerde celnummers vereist is, of tijdens sub-cloning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze experimentele procedure werd goedgekeurd door de verantwoordelijke ethische commissie voor menselijke experimenten (20-122, Ethikkommission LMU München). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.
OPMERKING: Goedkeuring moet worden verkregen van de juiste ethische commissie voordat wordt begonnen met experimenten met menselijke en NHP-monsters. Alle experimentele procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Elk van de volgende stappen moet worden uitgevoerd met behulp van steriele techniek in een biologische veiligheidskast. Alle buffer- en mediasamenstellingen zijn te vinden in aanvullende tabel S1. Zorg ervoor dat alle media worden opgewarmd tot kamertemperatuur (22 °C) voordat ze aan de cellen worden toegevoegd. Elke centrifugatiestap moet bij kamertemperatuur worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld.

1. Isolatie van cellen uit urinemonsters

LET OP: Zorg ervoor dat menselijke donoren vrij zijn van humaan immunodeficiëntievirus (HIV), hepatitis B-virus (HBV) en hepatitis C-virus (HCV). Voor NHP's, zorg ervoor dat de mogelijke donoren / cellen vrij zijn van specifieke pathogenen-B-virus (BV), Simian Immunodeficiency Virus (SIV), Simian Betaretrovirus (SRV) en Simian T Cell Lymphotropic Virus (STLV).

  1. Bereid een met gelatine gecoate 12-wells plaat door 500 μL 0,2% gelatine per put toe te voegen en verdeel de vloeistof door de plaat te verplaatsen. Plaats bij 37 °C gedurende ten minste 30 minuten voordat dit nodig is.
  2. Verzamel menselijke urinemonsters in conische buisjes van 50 ml. Voor primaten, verzamel urine van de vloer van de dierenfaciliteit met een spuit.
    OPMERKING: Een volume van 5 ml urine bleek voldoende te zijn voor het isoleren van ten minste één kolonie in 42% van de pogingen. Het gebruik van een hoger volume van ~ 50 ml urine wordt echter aanbevolen om de kans op het isoleren van kolonies te vergroten. NHP-urine moet zo vers mogelijk worden bemonsterd, bij voorkeur onmiddellijk na het plassen. De opslag van urinemonsters bij 4 °C gedurende 4 uur had geen negatief effect op het slagingspercentage van het protocol, maar langere bewaartijden werden niet getest.
  3. Centrifugeer de urinehoudende buis gedurende 10 minuten op 400 × g en zuig het supernatant voorzichtig op, waarbij ongeveer 1 ml in de buis achterblijft.
  4. Resuspendeerde de pellet in de resterende 1 ml vloeistof. Bundel de suspensies in één buis als meerdere buisjes urine zijn verzameld.
  5. Was de cellen door 10 ml urinewasbuffer (zie aanvullende tabel S1) met 2,5 μg/ml amfotericine aan de buis toe te voegen en meng de suspensie voorzichtig met een serologische pipet.
  6. Centrifugeer de buis gedurende 10 minuten op 200 × g en zuig het supernatant voorzichtig op, waarbij ongeveer <0,2 ml in de buis achterblijft.
  7. Resuspendie van de celkorrel in 1 ml primair urinemedium (zie aanvullende tabel S1) met 0,5 μg/ml amfotericine per 50 ml initieel verwerkte urine (resuspendien in 1 ml, zelfs als minder dan 50 ml urine werd verwerkt).
  8. Zuig gelatine uit de putjes (bereid in stap 1.1) en plaat 1 ml van de suspensie uit stap 1.7 in één put van een plaat met 12 putten. Herhaal dit voor zoveel putjes als gewenst, of voor zoveel mililiter suspensie beschikbaar.
    Optioneel: Om besmetting als gevolg van onhygiënische monsterverzameling te voorkomen, voegt u vanaf hier, tot de eerste passage, 100 μg / ml antimicrobieel reagens toe aan de cellen.
  9. Plaats de plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
  10. Voeg dagelijks 1 ml primair urinemedium per put toe tot dag 5, zonder het bestaande medium te verwijderen.
  11. Op dag 5 zuigt u 4 ml medium uit de plaat, waardoor ongeveer 1 ml medium overblijft. Voeg 1 ml REMC-medium (zie aanvullende tabel S1) per put toe om een mengsel van 1:1 met het nieuwe kweekmedium te krijgen.
  12. Vervang elke dag de helft van het medium door REMC-medium totdat de eerste kolonies verschijnen (figuur 1A, B). Verwijder daarom 1 ml oud medium en voeg 1 ml vers REMC-medium per put toe.

2. Uitbreiding van urinecellen

OPMERKING: Urinaire celdoorgifte moet worden uitgevoerd voordat de cultuur 90% confluentie bereikt.

  1. Bereid de gewenste hoeveelheid met gelatine gecoate 12-putplaten voor, zoals vermeld in stap 1.1.
  2. Zuig het oude medium op en was de cellen door 1 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) toe te voegen.
  3. Zuig de DPBS aan en voeg 300 μL 0,5x dissociatie-enzym verdund met DPBS toe. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  4. Voeg 700 μL REMC-medium toe om de enzymatische reactie te stoppen. Pipetteer de suspensie voorzichtig met een P1000-pipet totdat de cellen zijn gedissocieerd in afzonderlijke cellen.
  5. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g .
  6. Zuig het supernatant voorzichtig op en resuspensie van de pellet in 1 ml REMC-medium.
  7. Tel de cellen met behulp van een celteller (een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller).
  8. Voor uitbreiding van de urinecellen, plaat 1,5 × 10 4 tot 3 × 104 cellen in 1 ml REMC-medium in één 12-well plaat bedekt met 0,2% gelatine.
  9. Voer om de dag volgende mediumveranderingen uit totdat de cultuur 80% -90% samenvloeiing bereikt. Zuig daarom het oude medium aan en voeg 1 ml vers REMC-medium toe.

3. Generatie van iPSC's door Sendai virus vector infectie

OPMERKING: Voor de workflow van de herprogrammeringsprocedure, zie Figuur 2A. Urinecellen die worden gebruikt voor herprogrammering moeten zo jong mogelijk zijn, maar een opmerkelijk verlies van herprogrammeringsefficiëntie wordt niet waargenomen vóór passage 4. De Sendai Virus Reprogramming Kit moet worden gebruikt in een BL-2-faciliteit. Behandel virussen onder een biologische veiligheidskast met laminaire stroming en gebruik altijd de juiste veiligheidsuitrusting om blootstelling aan slijmvliezen te voorkomen.

  1. Bereid een keldermembraanmatrix gecoate 12-well plaat voor door 500 μL keldermembraanmatrix per put toe te voegen en verdeel de vloeistof door de plaat te verplaatsen. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur en vervang de keldermembraanmatrix door 900 μL REMC-medium. Bewaar de plaat bij 37 °C tot gebruik.
  2. Ontdooi de componenten van de Sendai Reprogramming Kit snel in een waterbad van 37 °C. Meng de Sendai-virussen (polycistronic KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC en KLF4) met een MOI van 5 en voeg REMC-medium toe tot 100 μL. Gebruik vergelijking (1):
    figure-protocol-1
    OPMERKING: Aangezien virustiters per partij verschillen, moet u altijd de titer controleren in het analysecertificaat dat door de fabrikant wordt verstrekt.
    Optioneel: Gebruik groen fluorescerend eiwit (GFP) Sendai-virus daarnaast als een positieve controle voor de transductie-efficiëntie. Bereid hiervoor een extra 3,5 × 104 cellen voor in een aparte buis tijdens stap 3.3.
  3. Voor dissociatie van de urinecellen volgt u de stappen 2.2-2.4. Tel de cellen met behulp van de celteller en breng 7 × 104 urinecellen over naar een buis van 1,5 ml.
  4. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g en verwijder het supernatant voorzichtig zonder de celkorrel te verstoren. Suspendeerde de pellet in 100 μL van het in stap 3.2 bereide SeV-mengsel. Incubeer de buis gedurende 1 uur bij 37 °C voor suspensie-infectie.
  5. Plaat de ophanging op de keldermembraan matrix-gecoate 12-well platen die werden voorbereid in stap 3.1. Routinematig worden plaat 1 × 10 4 en 2,5 × 104 cellen per put in duplicaten geplaatst.
  6. Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium door 1 ml vers REMC-medium 24 uur na transductie en op dag 3.
  7. Verander op dag 5 na transductie het medium in PSC-generatiemedium (zie aanvullende tabel S1), met daaropvolgende mediumwisselingen om de andere dag. Verwijder daarom het oude medium en voeg 1 ml PSC-generatiemedium per put toe.
    OPMERKING: Het kan tot 15 dagen duren voordat de eerste kolonies verschijnen.
  8. Kies individuele iPSC-kolonies wanneer de grootte van de kolonie groter is dan 1 mm. Om dit te doen, schraap en verzamel voorzichtig een enkele kolonie met een p10-pipet onder een microscoop. Breng de kolonie over in een nieuwe put van een 12-putplaat bedekt met een keldermembraanmatrix met 750 μL PSC-kweekmedium.
    Optioneel: Het spoelen van de plaat met DPBS en het behandelen gedurende 1 minuut met 0,5 mM EDTA voorafgaand aan het plukken kan de robuuste cultuur van verdere stappen ondersteunen. Als de cellen langer moeten worden gekweekt om te wachten op later opkomende kolonies, voer deze EDTA-behandelingsstap dan niet uit.
  9. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 met daaropvolgende mediumwisselingen om de andere dag, zoals vermeld in sectie 4 van het protocol. Wanneer de geplukte kolonie een diameter van 2 mm bereikt, gaat u verder met de routinematige iPSC-passaging, zoals uitgelegd in sectie 5 van het protocol.

4. Gemiddelde verandering

OPMERKING: Het kweekmedium moet om de dag worden vervangen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren.

  1. Zuig het oude medium aan en voeg 750 μL van het verse medium per 12-well plaat toe. Om over te schakelen naar een ander type medium, vervangt u het medium ten minste 1 dag na het passeren.

5. Passaging

OPMERKING: De cellen moeten worden gepasseerd wanneer de iPSC-kolonies groot genoeg worden (diameter > 2 mm), of wanneer de kolonies op het punt staan elkaar te raken. Routinematig kunnen iPSC's ongeveer elke 5 dagen worden gesplitst. Gebruik clump-passaging (stap 5.1) voor routineonderhoud en single-cell passaging (stap 5.2) voor experimenten waarbij een bepaald aantal cellen nodig is. In het geval dat de iPSC's veel differentiëren, kan kolonieplukken (stap 5.3) helpen de zuiverheid van de culturen te verbeteren.

  1. Clump-passaging
    1. Bereid een keldermembraanmatrix gecoate 12-well plaat voor door 500 μL keldermembraanmatrix per put toe te voegen en verdeel de vloeistof door de plaat te verplaatsen. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ten minste 1 uur. Vervang de keldermembraanmatrix door 500 μL PSC-kweekmedium en bewaar de plaat bij 37 °C tot gebruik.
    2. Zuig het medium uit de gekweekte cellen en was de cellen door voorzichtig 500 μL DPBS toe te voegen. Verwijder de DPBS en voeg 500 μL 0,5 mM EDTA toe aan de put.
    3. Incubeer de plaat op RT gedurende 2-5 minuten, totdat de kolonies beginnen los te komen. Observeer de cellen zorgvuldig onder de microscoop.
    4. Wanneer de randen van de kolonies beginnen af te pellen en openingen tussen de cellen zichtbaar worden (figuur 3A), verwijdert u de EDTA en voegt u voorzichtig 500 μL DPBS toe.
      OPMERKING: Pipet altijd tegen de zijwand van de put en nooit rechtstreeks op de cellen, om de cellen niet los te maken van de plaat.
    5. Zuig de DPBS aan en spoel de put met 500 μL PSC-kweekmedium met behulp van een p1000-pipet. Pipetteer 1x-5x op en neer om de kolonies te verspreiden in klonten van de juiste grootte (figuur 3A). Pipet niet te veel.
      OPMERKING: Als de iPSC's per ongeluk te veel worden gepipetteerd, voeg dan 10 μM Rock-remmer Y-27632 toe aan het medium. Dit kan de overleving verbeteren, omdat iPSC's niet in staat zijn om te overleven als afzonderlijke cellen.
    6. Breng 1/10-1/50 van de celklompsuspensie over naar de nieuwe putten. De verhouding hangt af van de samenvloeiing van de put vóór het splitsen, de gewenste dichtheid van de gezaaide cellen en iPSC-klonale voorkeur.
    7. Verdeel de klonten gelijkmatig in de put door de plaat meerdere keren voorzichtig heen en weer te bewegen. Incubeer de plaat gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C om de klonten te laten hechten.
    8. Vervang het medium door 750 μL PSC-kweekmedium als er veel zwevende dode cellen worden waargenomen; voeg anders 250 μL PSC-kweekmedium toe. Plaats de plaat bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
      OPMERKING: Mediumvervanging na 30 minuten is van cruciaal belang, vooral voor onstabiele cellijnen (bijv. NHP's).
    9. Verander het medium om de 2-3 dagen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren. Voor gemiddelde verandering volgt u stap 4 van het protocol.
  2. Eencellige passaging
    1. Bereid de met een keldermembraan matrix gecoate kweekplaat voor, zoals vermeld in stap 5.1.1, met toevoeging van 10 μM Y-27632 aan het PSC-kweekmedium.
      Optioneel: Voeg 10 μM Y-27632 toe aan de cellen 1-3 uur voorafgaand aan het passeren om de overleving van gevoelige cellijnen te verbeteren.
    2. Zuig het medium aan en was de cellen door 500 μL DPBS toe te voegen. Verwijder de DPBS en voeg 300 μL loskoppelingsoplossing toe aan de putjes.
    3. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 5-10 min. Wanneer voldoende loslating van de cellen onder de microscoop wordt waargenomen, voegt u 700 μL PSC-kweekmedium of DPBS toe.
    4. Pipetteer 5-10x op en neer met behulp van een p1000-pipet totdat de cellen zijn gedissocieerd in afzonderlijke cellen. Pipet niet te veel, om celbeschadiging te voorkomen.
    5. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 ml met ten minste 2 ml DPBS om de loslatingsoplossing te verdunnen.
    6. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g en zuig de oplossing volledig op, zonder de celkorrel te verstoren.
    7. Resuspendie van de pellet in 500 μL PSC kweekmedium aangevuld met 10 μM Y-27632.
    8. Tel de cellen en zaai 5.000-7.000 cellen per keldermembraan matrix-gecoate 12-well plaat, voorbereid in stap 5.2.1.
      OPMERKING: Als een ander celnummer nodig is, verander dan dienovereenkomstig naar een grotere of kleinere put.
    9. Incubeer de plaat gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 om de cellen te laten hechten.
    10. Vervang het medium door 750 μL PSC-kweekmedium + 10 μM Y-27632 als er veel dode cellen worden waargenomen; voeg anders 250 μL + 10 μM Y-27632 toe.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, vooral voor de onstabiele cellijnen (bijv. NHP's).
    11. Plaats de plaat bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
    12. Verander het medium 1 tot 2 dagen na het splitsen in PSC-kweekmedium zonder Y-27632, zodat de cellen de klassieke koloniemorfologie weer kunnen vertonen (figuur 3B).
    13. Verander het medium om de 2 dagen totdat de kolonies groot genoeg worden. Voor gemiddelde verandering, volg sectie 4 van het protocol.
  3. Doorgeven van iPSC's door kolonieplukken
    1. Bereid keldermembraan matrix-gecoate 12-putten voor zoals vermeld in stap 5.1.1.
    2. Zuig het medium aan en was de cellen door voorzichtig 500 μL DPBS toe te voegen. Verwijder de DPBS en voeg 500 μL 0,5 mM EDTA toe aan de put.
    3. Incubeer de plaat bij RT gedurende 1-3 minuten en observeer de cellen onder de microscoop, totdat loslating van de kolonie zichtbaar is aan de randen.
    4. Verwijder de EDTA en voeg voorzichtig 500 μL DPBS toe. Zuig de vloeistof op voordat u langzaam 500 μL PSC-kweekmedium aan de put toevoegt, zonder de cellen los te maken.
    5. Gebruik een p200-pipet om de gewenste kolonie onder de microscoop te kiezen, zonder de gedifferentieerde cellen te verzamelen. Om dit te doen, krab je voorzichtig over de kolonie terwijl je het medium met cellen opneemt.
    6. Breng elke geplukte kolonie over in één keldermembraanmatrix-gecoate put, zoals voorbereid in stap 5.3.1. Dissocieer de cellen in kleine klontjes met behulp van een p1000-pipet, door de cellen 2-5x te pipetteren.
    7. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2, zodat de klonten kunnen hechten.
    8. Vervang het medium door 750 μL PSC-kweekmedium als er veel zwevende dode cellen worden waargenomen; voeg anders 250 μL PSC-kweekmedium toe.
      OPMERKING: Mediumvervanging na 30 minuten is van cruciaal belang, vooral voor de onstabiele cellijnen (bijv. NHP's).
    9. Plaats de plaat bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
    10. Verander het medium om de 2-3 dagen totdat de kolonies groot genoeg worden om te passeren. Volg hiervoor sectie 4 van het protocol.

6. Invriezen van urinecellen en iPSC's voor langdurige opslag

OPMERKING: Routinematig worden iPSC's ingevroren als klonten in celvriesmedium zonder te tellen. Pipetteren moet minimaal zijn, om dissociatie in afzonderlijke cellen te voorkomen. Voor urinecellen worden routinematig 1,5 × 10 4 tot 3 × 104 cellen per buis bevroren, waardoor de gebruiker één buis direct in één put van een 12-putplaat kan ontdooien zonder dat een andere telstap nodig is.

  1. Bereid 5 ml DPBS in een buis van 15 ml.
  2. Voor het bevriezen van urinecellen volgt u de stappen 2.2-2.4 van het protocol. Voor het bevriezen van iPSC's volgt u de stappen 5.1.2-5.1.5 van het clump passaging-protocol.
  3. Breng de suspensie over in de buis van 15 ml die is voorbereid in stap 6.1. Tel voor het bevriezen van urinecellen 10 μL van de celsuspensie met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 × g en zuig het supernatant volledig op.
  4. Resuspendeer de celkorrel in 400 μL celvriesmedium per buis en verdeel de cellen over de gewenste hoeveelheid cryobuizen.
  5. Breng de cryobuizen onmiddellijk over tot -80 °C. Breng de bevroren buizen 1 dag na het invriezen bij -80 °C over naar een vriezer van -150 °C of vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

7. Ontdooien van urinecellen en iPSC's

  1. Bereid voor het ontdooien van urinecellen de gewenste hoeveelheid met gelatine gecoate 12-putjes voor, zoals vermeld in stap 1.1 van het protocol. Voor iPSC's bereidt u de 12-putplaten met matrixcoating van het keldermembraan voor, zoals vermeld in stap 5.1.1. Wissel in beide gevallen de matrix niet uit met medium.
  2. Bereid een buis van 15 ml met 4 ml DPBS en bewaar deze bij 37 °C.
  3. Plaats een bevroren injectieflacon met cellen snel in een waterbad van 37 °C om te ontdooien, totdat een stuk drijvend ijs zichtbaar wordt.
    OPMERKING: Veeg de cryobuis af met ethanol voor en na de incubatie in het waterbad om verontreinigingen te voorkomen.
  4. Voeg 500 μl REMC-medium voor urinecellen of 500 μl PSC-kweekmedium voor iPSC's toe aan de ijshoudende suspensie en breng de suspensie onmiddellijk over naar de voorverwarmde buis van 15 ml die is voorbereid in stap 7.2.
  5. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 200 × g en gooi het supernatant volledig weg.
  6. Voor urinecellen, resuspendeerde de pellet in 1 ml REMC-medium. Voor iPSC's, resuspendeerde de pellet voorzichtig in 750 μL PSC-kweekmedium. Vermijd te veel pipetteren, om de klonten intact te houden.
    Optioneel: Aanvulling van het medium met 10 μM Y-27632 kan de overleving van iPSC's na ontdooien ondersteunen.
  7. Zuig de matrix op van de 12-putplaten die in stap 7.1 zijn voorbereid en breng de celsuspensie voorzichtig over naar de put.
  8. Plaats de plaat een nacht bij 37 °C en 5% CO2 in een incubator.
  9. Vervang het medium de volgende dag door PSC-kweekmedium, zonder Y-27632 voor iPSC's en door REMC voor urinecellen.
  10. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 in een couveuse.
  11. Verander het medium elke 2-3 dagen totdat de cellen groot genoeg worden om te passeren. Voor gemiddelde verandering, volg sectie 4 van het protocol.

8. Immunocytochemie

OPMERKING: Immunostaining met antilichamen gericht op pluripotentie-gerelateerde markers zoals NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 en EpCAM is een van de meest gebruikte validaties van nieuw gegenereerde iPSC's. Meer informatie over de antilichamen en verdunningen is te vinden in de Materiaaltabel.

  1. Plaat iPSC's 1-3 dagen voor gebruik in een geschikt aantal 12-well platen. Zuig het medium op, was de cellen door 500 μL DPBS toe te voegen en verwijder de DPBS. Voeg 400 μL 4% paraformaldehyde (PFA) per put toe en fixeer de cellen gedurende 15 minuten bij RT.
  2. Verwijder de 4% PFA en was de cellen 3x met DPBS. Voeg 400 μL blokkeringsbuffer per put toe en incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT.
  3. Zuig de blokkeringsbuffer aan en voeg de antilichamen verdund in 400 μL antilichaamverdunningsbuffer (ADB) toe aan elk putje. Incubeer de plaat een nacht bij 4 °C.
  4. Verwijder de ADB die de primaire antilichamen bevat en was cellen 3x met DPBS.
  5. Zuig de DPBS op en voeg 400 μL secundaire antilichamen verdund in ADB per put toe. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij RT in het donker.
  6. Verwijder de ADB en was cellen 3x met DPBS. Voeg 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in DPBS per put toe en incubeer gedurende 3 minuten bij RT.
  7. Zuig de DAPI-oplossing aan en was de cel 3x met DPBS. Voeg 500 μL DPBS toe voor beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij het isoleren van cellen uit menselijke en NHP-urine kunnen verschillende soorten cellen direct na isolatie worden geïdentificeerd. Plaveiselcellen, evenals verschillende kleinere ronde cellen, worden uitgescheiden met de urine; vrouwelijke urine bevat veel meer plaveiselcellen dan mannelijke urine (figuur 1B - dag 0; Aanvullende figuur S1). Na 5 dagen kweek in primair urinemedium zijn de eerste aanhangende prolifererende cellen te zien (figuur 1A,B

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC's zijn waardevolle celtypen omdat ze het mogelijk maken om anders ontoegankelijke celtypen in vitro te genereren. Omdat de uitgangsmaterialen voor herprogrammering, bijvoorbeeld fibroblasten, niet gemakkelijk beschikbaar zijn van alle primatensoorten, presenteert dit artikel een protocol voor het genereren van iPSC's uit van urine afgeleide cellen. Deze cellen kunnen op een niet-invasieve manier worden verkregen, zelfs uit niet-steriele urinemonsters van primaten, door het kweekmedium aan te vullen met bree...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door DFG EN 1093/5-1 (projectnummer 458247426). M.O. werd ondersteund door JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. Flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van de Core Facility Flow Cytometry in het Biomedical Center München. We willen Makoto Shida en Tomoyo Muto van ASHBi, Kyoto University, bedanken voor hun steun aan videografie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accumax™ cel loslating oplossing (Detachment solution)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-OplossingMerckA2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Muis Antilichaam Stem Cell Technologies60064Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-geconjugeerd Antilichaam Miltenyi Biotec130-122-965Dilution: 1/50
Bambanker™ (Celvriesmedium)Nippon GeneticsBB01
Rundserum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Celcultuur multiwell plaat, 12-well CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II geautomatiseerde celtellerThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes met 2D Barcode (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Er kunnen verschillende soorten Cryotubes worden gebruikt om te bevriezen. De 2D barcode buizen hebben het voordeel dat de monsterinformatie kan worden opgeslagen in een database met unieke buisinformatie.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencie Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogrammeringskit (Sendai virus reprogrammeringskit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-fenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM Hoge GlucoseTH.GeyerL0102
DMEM/F12 met L-glutamineFisher Scientific15373541
Ezel anti-Muis IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Dilution: 1/500
Ezel anti-Konijn IgG (H+L) Sterk Geadsorbeerd Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Dilution: 1/500
DPBS zonder Calcium zonder MagnesiumTH.GeyerL0615-500
EpCAM Recombinant Polyklonaal Konijn Antilichaam (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Dilution: 1/500
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL kegelbodemGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL kegelbodemGreiner BIO-ONE227261
Foetaal Rundserum, gekwalificeerd, hitte geïnactiveerd, Brazilië (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 663441
Gelatine uit varkenshuidSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Gekwalificeerd, Gereduceerd Groeifactor Basement Membraan MatrixThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2 incubatorFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe veiligheidskabinetKendro51017905
Menselijk EGF, premiumkwaliteitMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersie 2.9.0
MEM Niet-Essentiële Aminozuren Oplossing (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Microcentrifugeerbuis PP, 1,5 mLNerbe Plus04-212-1000
Microscoop Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Muis anti-alpha-Fetoproteïne antilichaamR&D SystemsMAB1368Dilution: 1/100
Muis anti-alpha-Gladde Spier Actine antilichaamR&D SystemsMAB1420Dilution: 1/100
Muis anti-beta-III Tubuline antilichaamR&D SystemsMAB1195Dilution: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Konijn mAb Cell Signaling Technology4903SDilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobieel Reagens)Invivogenant-noc
Oct-4 Konijn Antilichaam Cell Signaling Technology2750SDilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicilline-Streptomycine (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122Penicilline-Streptomycine mix bevat 100 U/mL Penicilline en 100 µg/mL Streptomycine.
Recombinant Menselijke FGF-basicPeproTech100-18B
Recombinant Menselijke PDGF-ABPeproTech100-00AB
Gekoelde tafelcentrifugeSIGMA 4-16KS
Nierapicale Cel Basal MediumATCCPCS-400-030
Nierapicale Cel Groei KitATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Muis mAb #4900Cell Signaling Technology4900SDilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Muis mAbNEB4755SDilution: 1/500
StemFit® Basic02Nippon

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214(2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103(2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312(2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361(2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516(2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432(2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Primate IPSC suit urine afgeleide cellenfeeder vrije kweekSendai virus reprogrammeringclump passagingpluripotentiemarkersflowcytometrieimmunocytochemiekiemblad differentiatie

Gerelateerde artikelen