Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Summary

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Abstract

Eiwit-RNA-interacties reguleren genexpressie en cellulaire functies op transcriptioneel en post-transcriptioneel niveau. Om deze reden blijft het identificeren van de bindende partners van een RNA van belang van groot belang om de mechanismen achter veel cellulaire processen te onthullen. RNA-moleculen kunnen echter tijdelijk en dynamisch interageren met sommige RNA-bindende eiwitten (RBP's), vooral met niet-canonieke eiwitten. Daarom zijn verbeterde methoden om dergelijke RBP's te isoleren en te identificeren hard nodig.

Om de eiwitpartners van een bekende RNA-sequentie efficiënt en kwantitatief te identificeren, ontwikkelden we een methode op basis van de pull-down en karakterisering van alle interagerende eiwitten, uitgaande van cellulair totaal eiwitextract. We optimaliseerden de eiwit pull-down met behulp van gebiotinyleerd RNA vooraf geladen op streptavidin-gecoate kralen. Als proof of concept gebruikten we een korte RNA-sequentie waarvan bekend is dat deze het neurodegeneratie-geassocieerde eiwit TDP-43 bindt en een negatieve controle van een andere nucleotidesamenstelling maar dezelfde lengte. Na het blokkeren van de kralen met gist-tRNA, laadden we de gebiotinyleerde RNA-sequenties op de streptavidin-kralen en incubeerden ze met het totale eiwitextract van HEK 293T-cellen. Na incubatie en verschillende wasstappen om niet-specifieke bindmiddelen te verwijderen, hebben we de interagerende eiwitten geëlueerd met een zoutrijke oplossing, compatibel met de meest gebruikte eiwitkwantificeringsreagentia en met monstervoorbereiding voor massaspectrometrie. We kwantificeerden de verrijking van TDP-43 in de pull-down uitgevoerd met het bekende RNA-bindmiddel in vergelijking met de negatieve controle door massaspectrometrie. We gebruikten dezelfde techniek om de selectieve interacties van andere eiwitten te verifiëren waarvan computationeel werd voorspeld dat ze unieke bindmiddelen zijn van ons RNA van belang of van de controle. Tot slot hebben we het protocol gevalideerd door western blot via de detectie van TDP-43 met een geschikt antilichaam.

Dit protocol zal de studie van de eiwitpartners van een RNA van belang in bijna-fysiologische omstandigheden mogelijk maken, waardoor unieke en onvoorspelbare eiwit-RNA-interacties worden ontdekt.

Introduction

RNA-bindende eiwitten (RBP's) zijn naar voren gekomen als cruciale spelers in transcriptionele en post-transcriptionele genregulatie, omdat ze betrokken zijn bij processen zoals mRNA-splicing, RNA-cellulaire lokalisatie, translatie, modificatie en afbraak ^1,2,3. Dergelijke interacties tussen de twee macromoleculen zijn sterk gecoördineerd, nauwkeurig uitgebalanceerd en essentieel voor de vorming van functionele en verwerkingshubs. Variaties of ontregeling binnen deze hubs hebben het potentieel om de fijn gereguleerde eiwit-RNA-netwerken te verstoren en worden in toenemende mate geassocieerd met een verscheidenheid aan menselijke ziekten, waaronder kanker^4,5 en neurodegeneratieve aandoeningen 6,7,8. De interacties tussen RNA-moleculen en hun eiwitbindende partners kunnen stabiel en gemakkelijk experimenteel te valideren zijn, of zeer dynamisch, van voorbijgaande aard en moeilijker te karakteriseren.

In de afgelopen jaren zijn er intensieve inspanningen geleverd om deze interacties te begrijpen. Onder de meest gevestigde methoden zijn eiwit pull-down assays (PD's) waarschijnlijk de meest gewaardeerde en meest gebruikte benaderingen om de belangrijkste spelers te ontrafelen die ribonucleoproteïne (RNP) -complexen en andere eiwit-RNA-interactienetwerken vormen ^3,9,10. PD's omvatten een brede paraplu van informatieve technieken, zoals de immunoprecipitatie van het RNA (RIP) 11,12 of het eiwit (CLIP) ^13,14 van belang. Sommige van deze RNA-PD-protocollen gebruiken een bekend RNA als lokaas voor eiwitten¹⁵, meestal door gebruik te maken van tags met een hoge affiniteit zoals biotine. In dit geval kunnen de interactiepartners van een gebiotinyleerd RNA worden gedetecteerd door het RNA te verankeren op streptavidin-gecoate kralen, waardoor een efficiënte isolatie van de RNP's mogelijk is. De belangrijkste beperkingen van deze benaderingen zijn meestal het ontwerp van de gebiotinyleerde sondes en het testen van hun vermogen om doeleiwitten te binden. Voor dit doel kan het nuttig zijn om te vertrouwen op gepubliceerde CLIP-gegevens van het eiwit van belang, indien beschikbaar, omdat ze met hoge precisie de korte RNA-regio's onthullen die overeenkomen met pieken van interacties met het doeleiwit^13,16. Deze zelfde regio's kunnen worden gebruikt om sondes voor PD's te ontwikkelen. Een alternatieve methode om dergelijke RNA-lokaas te ontwerpen zou de systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX)¹⁷ kunnen zijn, die het ontwerp van aptameren mogelijk maakt door middel van in vitro selectie, uitgaande van een uitgebreide gerandomiseerde bibliotheek en via een reeks PCR-gestuurde optimalisatiecycli. SELEX is echter complex en tijdrovend en de uiteindelijke resultaten zijn sterk afhankelijk van de initiële bibliotheek. Om het RNA-aas te selecteren dat in het hier gepresenteerde protocol moet worden gebruikt, werd nog een andere benadering gebruikt, bestaande uit het gebruik van een RNA-aas dat de novo is ontworpen door middel van de rekenkracht van het algoritme catRAPID, dat de preferentiële binding van een bepaald eiwit aan bepaalde RNA-sequenties voorspelt^18,19,20.

Het hier geïntroduceerde protocol is een versie van een RNA-PD die is geoptimaliseerd om specifieke eiwitpartners te elueren in bijna-fysiologische omstandigheden, zonder het gebruik van detergent, denatureringsmiddelen of hoge temperaturen. Het is gebaseerd op nano-superparamagnetische kralen covalent gecoat met sterk gezuiverd streptavidin en het gebruik van een specifiek in silico ontworpen gebiotinyleerd RNA als lokaas. Dit protocol biedt een snelle en efficiënte methode om de bindingspartners van gebiotinyleerde RNA-moleculen in inheemse omstandigheden te isoleren, en biedt het potentieel voor een breed scala aan downstream-toepassingen. Om dit protocol te testen, werd een 10-nucleotide enkelstrengs RNA-aptameersequentie gebruikt, eerder ontworpen om het eiwit TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) met hoge affiniteit en specificiteit te binden,²⁰. Uitgaande van HEK 293T-cellysaten werden de interactoren van het gebiotinyleerde RNA-aptameer geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie-analyse uitgevoerd op monsters die losstonden van het RNA-aas met behulp van een hypertone buffer. Deze analyse bevestigde de succesvolle identificatie en kwantificering van TDP-43 als voorkeursbindmiddel.

Dit protocol maakt de succesvolle identificatie van eiwitinteractoren mogelijk met behulp van slechts een kort, in vitro gesynthetiseerd RNA-oligonucleotide. Bovendien garandeert het gebruik van in silico ontworpen RNA-aptameren als PD-sondes^21,22 specificiteit voor de doelen tegen aanzienlijk lagere kosten.

Protocol

1. Algemene methoden en materiaal

1. Bereid het geschikte medium voor de gekozen celcultuur van zoogdieren en verwarm het voor gebruik gedurende 20 minuten op 37 °C.
2. Bereid het vereiste materiaal van tevoren voor, zoals beschreven in de materiaaltabel. Autoclaafglaswerk, plasticwerk en buffervoorraden.
3. Bereid de buffers voor zoals beschreven in tabel 1. Pas de pH van de stamoplossingen aan met geconcentreerde HCl of NaOH voordat u de componenten verdunt tot hun uiteindelijke volumes.

2. Cellijnpreparaat van zoogdieren

1. Kweek HEK 293T-cellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 100 μg / ml penicilline / streptomycine-oplossing. Incubeer ze bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. Splits de cellen routinematig.
2. Voordat u de cellen losmaakt, spoelt u de cellen met voldoende fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om het groeioppervlak te bedekken.
3. Verwijder de PBS en voeg een ultradunne laag trypsine-EDTA-oplossing toe.
4. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator voorzien van 5% CO₂ gedurende 5 minuten, of totdat de cellen zijn losgemaakt (ze moeten er gedispergeerd uitzien onder microscopische observatie).
5. Verdun de trypsine-EDTA-oplossing tienvoudig door volledige DMEM toe te voegen om deze te inactiveren en de cellen te tellen.
6. Plaat 1,5 x 10⁵ cellen/ml in 6-putplaten, rekening houdend met twee putjes/conditie om te testen.
7. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 48 uur in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
   OPMERKING: Controleer de instructies van de fabrikant voor het type medium en vul apt aan voor de cellijn. Ook de hoeveelheid en de incubatietijd van trypsine-EDTA zijn afhankelijk van de cellijn. Sommige celtypen groeien sneller/langzamer dan wat in dit protocol werd gemeld; De zaaiconcentratie moet dus vooraf worden getest.

3. Totale eiwitoogst

1. Verwijder medium uit de putjes waar cellen groeien.
2. Was elk putje van de 6-putplaten met 1 ml PBS.
3. Gooi de PBS weg.
4. Verplaats de platen op ijs en ga verder met stap 3.5 of vries de droge platen in bij -80 °C om lysis te vergemakkelijken.
5. Voeg 200 μL lysisbuffer toe aan elke put.
6. Gebruik een celschraper om de cellen los te maken en te breken.
7. Breng het celextract afkomstig van twee putjes over in dezelfde buis van 1,5 ml.
8. Leg het buisje met het eiwitextract gedurende 30 minuten op ijs.
9. Centrifugeer de cellysaten bij 17.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
10. Breng elk supernatant over in een voorgekoelde buis.
    OPMERKING: Een totaal van 10^{6-10 7} cellen voor elke PD-aandoening worden aanbevolen. Cellyse en eiwitoogst moeten worden uitgevoerd met ijskoude buffers. Proteaseremmers moeten aan de lysisbuffer worden toegevoegd om eiwitafbraak te voorkomen.

4. Bepaling van de eiwitconcentratie

1. Bereid Bradford-reagens, zoals aangegeven door de producent, door het vijfvoudig te verdunnen in dH₂O.
2. Verdeel 1 ml reagens in een cuvet van 1 cm, voeg 1 μL van het monster toe en meng door inversie.
3. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
4. Lees de absorptie af bij 595 nm.
5. Bereken het volume eiwitextract dat overeenkomt met 1,5 mg eiwitten en breng alle monsters naar een eindvolume van 600 μL met behulp van lysisbuffer.
6. Bewaar de monsters op ijs tot gebruik.
   OPMERKING: Elke andere methode voor de bepaling van de eiwitconcentratie kan worden gebruikt, volgens aanbevelingen voor buffercompatibiliteit. In ieder geval moet de lysisbuffer als blanco worden gebruikt. Veel reagentia zijn niet compatibel met dithiothreitol (DTT). Het wordt aanbevolen om DTT of andere reductiemiddelen pas toe te voegen na eiwitkwantificering (DTT tot een eindconcentratie van 1 mM).

5. Kralenvoorbereiding

1. Meng de kralen in hun opslagbuffer door met de buis te vegen.
2. Bereken 100 μL drijfmestmedium/monster en plaats het volume in een magnetisch rek.
3. Kralen wassen
   1. Verwijder de bewaaroplossing en was de kralen door 1 ml lysisbuffer/buis toe te voegen en deze handmatig om te keren.
   2. Verwijder de buffer met behulp van het magnetische rek.
   3. Herhaal de wasstap.
   4. Voeg een volume lysisbuffer toe dat gelijk is aan het oorspronkelijke volume slurrymedium, meng door de buis te vegen en doseer het medium gelijkmatig in zoveel buizen van 1,5 ml als er monsters zijn.
4. Kralen blokkeren
   1. Verwijder de buffer met behulp van het magnetische rek en voeg 600 μL van een 0,25 mg/ml oplossing van gist-RNA bereid in lysisbuffer toe.
   2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een roterend wiel.
   3. Verwijder de tRNA-oplossing met behulp van het magnetische rek.
   4. Voeg 600 μL lysisbuffer toe en was door handmatig te mengen.
   5. Herhaal de wasstap en gooi de buffer weg.

6. Kraal laden

1. Bereid 200 μg RNA-oligonucleotide in 600 μL lysisbuffer voor elke buis die het initiële 100 μL slurrymedium (nu geblokkeerde kralen) bevat.
2. Voeg de oligo toe aan de kralen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur terwijl je draait.
3. Verwijder de oplossing, voeg 600 μL lysisbuffer toe en was de kralen twee keer door de buisjes gedurende 5 minuten op kamertemperatuur te draaien.
4. Gooi de buffer weg.
   OPMERKING: Draai de kralen nooit vortex, maar veeg in plaats daarvan. Beperk het aantal pipetteerstappen, tenzij dat nodig is. Gebruik indien mogelijk gesneden, 1 ml tips. De hoeveelheid parelsuspensiemedium/monster is afhankelijk van het bindingsvermogen van de kralen en de starthoeveelheid van de totale eiwitten. Als wordt voorspeld dat de RNA-oligo een aanzienlijke hoeveelheid secundaire structuur heeft, raden we aan om het eerst gedurende 10 minuten bij 80 °C te denatureren en vervolgens langzaam af te koelen bij kamertemperatuur of het opnieuw te vouwen door het gedurende 1 uur bij 30 °C te incuberen. Er wordt voorgesteld om de RNA-oligo na het laden van de kraal te herstellen en de resterende concentratie te bepalen, om de hoeveelheid die nodig is voor het laden te optimaliseren en om de mogelijkheid van hergebruik van het RNA te evalueren.

7. Eiwitbinding op kralen

OPMERKING: Voer vanaf nu, indien mogelijk, de stappen uit bij 4 °C.

1. Neem een volume van 5% uit de 600 μL eiwitoplossing en bewaar het als INPUT (IN) voor verdere analyse (1,5 mg eiwitten worden opgelost in 600 μL, dus 5% komt overeen met 30 μL en 75 μg eiwitten).
2. Voeg het resterende eiwitmengsel toe aan elke tube geladen kralen en laat langzaam een nacht draaien bij 4 °C.

8. Wassen van niet-specifieke bindmiddelen

1. Verwijder de ongebonden fractie met behulp van het magnetische rek. Sla 5% van het volume op en label het als FLOWTHROUGH (FT) (het ongebonden volume is ca. 600 μL, dus houd opnieuw 30 μL voor verdere analyse).
2. Voeg 1 ml wasbuffer 1 toe aan de kralen en laat deze 5 minuten draaien bij 4 °C.
3. Gooi de buffer weg.
4. Herhaal stap 8.2 en 8.3.
5. Voeg 1 ml wasbuffer 2 toe aan de kralen en laat deze 5 minuten draaien bij 4 °C.
6. Gooi het supernatant weg.

9. Elutie van specifieke bindmiddelen

1. Voeg 100 μL elutiebuffer 1 of elutiebuffer 2 toe aan de kralen.
2. Meng handmatig door te vegen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Plaats de buizen in een thermomixer en schud krachtig gedurende 5 minuten bij 95 °C.
4. Plaats de buis in het magnetische rek en vang de geëlueerde fractie op in een schone buis.
5. Draai de kralen snel rond met een bankcentrifuge om het herstel van het eluaat te maximaliseren.
6. Bespaar 5% van het totale ELUATE (EL) volume voor verdere analyses (totaal volume is 100 μL, dus scheid 5 μL in een andere buis).
7. Indien nodig kan de eiwitconcentratie worden bepaald zoals in rubriek 4, door elutiebuffer als blanco te gebruiken.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om geen DTT aan de elutiebuffer toe te voegen totdat de eiwitconcentratie is bepaald. Als eiwitkwantificering niet vereist is, of als er reductiemiddelcompatibele eiwitkwantificeringskits beschikbaar zijn, kan vanaf het begin 1 mM DTT aan de elutiebuffer worden toegevoegd. In dit protocol werden zowel elutiebuffer 1 (met 1 M NaCl) als elutiebuffer 2 (met 2 M NaCl) getest. Er werd geen verschil in de elutie-efficiëntie van het doeleiwit waargenomen met verhoogde ionische sterkte, maar het wordt aanbevolen om beide omstandigheden te testen voordat de meest geschikte buffer wordt vastgesteld. Als een hoge aanwezigheid van zout in de elutiebuffer een beperking vormt voor verdere analyse, maakt de zeer lage hoeveelheid detergentia in de elutiebuffer bufferuitwisseling mogelijk. Als alternatief kan het eluaat worden verdund om de gewenste zoutconcentratie te bereiken.

10. Identificatie van eiwitbinders door massaspectrometrie

1. Aceton neerslag
   1. Concentreer de geëlueerde eiwitten door ze viervoudig te verdunnen in koude (-20 °C) aceton.
   2. Vortex en incubeer de buis bij -20 °C gedurende een nacht.
   3. Draai op 17.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
   4. Verwijder voorzichtig het supernatant en laat de aceton verdampen totdat de pellet volledig is opgedroogd.
2. In-solution eiwitvertering
   1. Los de eiwitkorrel op door 50 μL denaturatiebuffer toe te voegen.
   2. Voeg DTT toe aan een eindconcentratie van 5 mM, waardoor eiwitreductie gedurende 30 minuten bij 55 °C mogelijk is.
   3. Koel de monsters af bij kamertemperatuur en ga verder met de eiwitalkyleringsreactie, waarbij jodoacetamide (IAZ) wordt toegevoegd in een concentratie van 10 mM gedurende 15 minuten.
   4. Verwerk de eiwitten met behulp van een geschikt enzym (trypsine, LysC) en incuber de monsters een nacht bij 37 °C.
   5. Stop de spijsvertering door 1 μL 10% trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen.
   6. Ruim op en concentreer de peptiden op een aangepaste omgekeerde fase C18 microkolom, zoals eerder beschreven¹⁹.
   7. Elue peptiden uit de C18 tip met Buffer B.
   8. Verwijder de organische component met behulp van een vacuümcentrifuge en resuspendien de peptiden in 5 μL van 0,1% mierenzuur voor verdere analyse.
      OPMERKING: Als alternatief kan eiwitvertering "op kralen" worden uitgevoerd onmiddellijk na het wassen van niet-specifieke bindmiddelen (stappen 8.1-8.6), waardoor het protocol sneller wordt. Het is echter raadzaam om de efficiëntie te testen van het enzym dat "op kralen" geïmmobiliseerde eiwitten werkt in vergelijking met standaard in oplossingsvertering, om de optimale dekking van de experimentele eiwitsequentie te garanderen.
3. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)
   1. Sluit de analytische kolom aan (C18-stationaire fase) en houd deze gedurende de run op 45 °C.
   2. Sluit de kolom aan op de uitlaat van een zespoorts roterende klep van de LC-pomp via een capillaire vingerdichte fitting (20 μm x 550 mm) in een configuratie met één kolom.
   3. Pas de LC-instellingen als volgt aan:
      1. Laad de peptiden onder gecontroleerde druk (980 bar) in Buffer A.
      2. Pas een buffer B-gradiënt van 5% -20% toe bij 300 nL/min gedurende 59 minuten, gevolgd door een buffer B-gradiënt van 20% -30% over 15 minuten en een buffer B-gradiënt van 30% -65% over 5 minuten.
      3. Voeg een wasstap toe door de concentratie van buffer B te verhogen tot 95% gedurende 5 minuten plus een isocratische stap van 5 minuten bij 95% buffer B.
   4. Bedien de massaspectrometer in de DDA-modus (Data-Dependent Acquisition) om automatisch te schakelen tussen MS- en MSMS-gebeurtenissen.
   5. Definieer een lustelling gelijk aan 15 met behulp van een AGC-doelwaarde (Automatic Gain Control) van 3 x 10⁶ en 1 x 10⁵ voor respectievelijk de MS- en MSMS-gebeurtenissen.
   6. Stel de maximaal toegestane ionenaccumulatietijd in op 20 ms voor MS met een resolutie van 60 K en 100 ms voor MSMS met een resolutie van 15 K.
   7. Voer een high collision dissociation (HCD) fragmentatie-experiment uit met een genormaliseerde botsingsenergie van 28%, met een dynamische uitsluitingstijd van 20 s.
   8. Bedien de bronparameters als volgt:
      Sproeispanning: 1,7 kV
      Capillaire spanning: 275 °C
      Noch een mantel, noch hulpgas gebruikt
      OPMERKING: In dit protocol is ultra-high performance vloeistofchromatografie (UHPLC) massaspectrometrische (MS) analyse specifiek uitgevoerd met behulp van een LC single column setup, gekoppeld aan een hybride triple quadrupole orbitrap instrument (Table of Materials). Andere LCMS-systemen kunnen worden gebruikt, maar een aanpassing van de parameters wordt aanbevolen.
4. Data-analyse
   1. Gebruik de knop Laden om de RAW-bestanden te importeren.
   2. Definieer de experimentnamen door op de knop Experiment instellen te klikken.
   3. Voer de sectie groepsspecifieke parameters in om alle parameters met betrekking tot identificatie op te geven:
      Enzym gebruikt voor de spijsvertering: Trypsine/P
      Gemiste decolletés: maximaal drie
      Vaste modificatie: Carbamidomethylation
      Variabele modificatie: N-acetyl (Eiwit), Oxidatie (M)
   4. Upload een bijgewerkt FASTA-bestand, beschikbaar via openbare databases zoals UniprotKB.
   5. Geef de juiste parseregels op volgens de bron van de gekozen database.
   6. Definieer een afstammingswaarde voor false discovery rate (FDR) = 1 voor zowel eiwitten als peptiden.
   7. Voeg de optie labelvrije kwantificering (LFQ) toe op het tabblad Labelvrije kwantificering.
   8. Houd het aantal minimale LFQ-verhoudingen op twee.
      OPMERKING: Hier beschrijven we gegevensanalyse met behulp van MaxQuant²⁴ en Perseus-software²⁵ om respectievelijk eiwitkwantificering en daaropvolgende statistische analyse uit te voeren. Data-analyse kan echter worden uitgevoerd met elke andere commercieel beschikbare of gratis bio-informatica. FDR wordt geschat met behulp van een target-decoy database-gebaseerde benadering²⁶. Peptide en eiwit FDR gelijk aan 0,01 betekent dat peptiden en eiwitten geïdentificeerd naar verwachting 1% van de valse positieven bevatten.
5. Statistische analyse
   1. Laad het bestand .txt de eiwitgroepen om statistische analyses op eiwitniveau uit te voeren.
   2. Definieer de LFQ-waarden als hoofdkolommen.
   3. Verwijder "omgekeerd" en "verontreinigingen" door rijen te filteren op basis van de categorische kolom.
   4. Gebruik de categorische annotatierijen om de verschillende experimentele omstandigheden te groeperen.
   5. Verklein de gegevensmatrix en selecteer het aantal geldige waarden in elk van de eerder gedefinieerde groepen.
   6. Selecteer de statistische test die beter past bij de experimentele omstandigheden (d.w.z. t-test, meervoudige steekproeftest ANOVA).
   7. Bepaal een cut-off voor significante hints met een op FDR gebaseerde berekening. Doorgaans worden zowel 0,01 als 0,05 geaccepteerd als drempelwaarden voor de aangepaste p-waarde .
   8. Visualiseer de resultaten van differentiële analyses op basis van t-teststatistieken met behulp van een vulkaanplotweergave.
   9. Exporteer de uiteindelijke matrix in .txt indeling voor verdere bewerking van de tabel met eindresultaten.
      OPMERKING: De configuratiemap bevat een FASTA-bestand met eiwitten zoals keratines die worden beschouwd als veelvoorkomende verontreinigingen in wereldwijde proteomische experimenten, die worden gemarkeerd met een + in de uitvoertabel. In de huidige studie, met twee steekproefcondities, wordt een t-test gebruikt voor de statistische analyse.

11. Validatie van de resultaten door western blot

1. Monstervoorbereiding
   1. Voeg het juiste volume van 4x de monsterlaadbuffer toe aan elk aliquot van IN, FT en EL.
   2. Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95°C.
   3. Fast-spin om verdampt monster van de bovenkant van de buizen te herstellen.
2. SDS-PAGE en gel transfer
   1. Laad monsters op een 4% -12% denaturerende polyacrylamide gel.
   2. Voer de gel met MES SDS-loopbuffer gedurende 1,5 uur uit op 120 V.
   3. Breng de gel over op een nitrocellulosemembraan met een semi-droge transfercassette, volgens de instructies van de fabrikant. We raden een transfer van 10 minuten aan bij 15 V.
3. Immunodetectie
   1. Blokkeer het membraan met 10% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur terwijl u zachtjes roert.
   2. Voeg het primaire antilichaam bereid in 5% BSA in TBST toe, volgens de instructies van de fabrikant. Laat een nacht staan bij 4 °C of gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht roeren.
   3. Was het membraan drie keer met TBST, telkens gedurende 5 minuten.
   4. Voeg het secundaire antilichaam bereid in TBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder roeren toe.
   5. Was het membraan drie keer met TBST, telkens gedurende 5 minuten.
   6. Visualiseer de resultaten met behulp van een blot imager.
      OPMERKING: Voor het detecteren van TDP-43, een bekend bindmiddel van ons RNA, werd recombinant konijn monoklonaal antilichaam gebruikt en 's nachts bij 4 °C met het membraan achtergelaten. Als secundair antilichaam werd het anti-konijn IgG mierikswortelperoxidase (HRP) gebruikt, maar een fluorescerend secundair antilichaam zou ook werken. Om de antilichamen op het membraan te visualiseren, werd het membraan gedurende 1 minuut geïncubeerd met het Clarity Western ECL-substraat, voordat het beeldvorming met het ChemiDoc-beeldvormingssysteem werd uitgevoerd.

Results

Om de geldigheid van het voorgestelde protocol te verifiëren, werden de hier gepresenteerde PD-experimenten uitgevoerd met een gebiotinyleerd RNA-aptameer ontworpen in silico om specifiek TDP-43^{20 te binden}. Dit RNA bindt zijn eiwitdoel met hoge bindingsaffiniteit (K_d = 90 nM)²⁰. Hier wordt dit RNA, van sequentie 5'-CGGUGUUGCU-3', aangeduid met de naam "+RNA". Als negatieve controle werd de omgekeerde complementaire sequentie van +RNA, die hier "-RNA" wordt genoemd, gebruikt. De volgorde is 5'-AGCAACACCG-3'. -RNA vertoont een significant lagere bindingsaffiniteit ten opzichte van TDP-43 (K_d = 1,5 μM)¹⁹. Voor het doel van het hier beschreven protocol zijn deze RNA-oligonucleotiden gekocht geconjugeerd aan een biotinemolecuul, om binding aan de streptavidin-kralen mogelijk te maken. +RNA werd gekocht met een biotine-TEG aan het 3'-uiteinde, dat een 15-atoomtriethyleenglycol-spacer bevat tussen het biotine en de fosfaatgroep van het nucleïnezuur; -RNA had in plaats daarvan een biotine aan het 5'-uiteinde, geconjugeerd aan het nucleïnezuur via een amino-C6-linker. Als het ontwerp van het RNA-aas echter robuust is en zolang er geen structurele of chemische interferentie is tussen de linker en het RNA, kunnen andere posities voor de biotineconjugatie en andere linkerlengtes worden gebruikt.

Het kennen van de identiteit van het belangrijkste eiwit dat na de PD aan de +RNA-sonde gebonden was, maakte de validatie van het protocol mogelijk door identificatie van TDP-43 in het eluaat, met behulp van zowel massaspectrometrie (MS) als western blot (WB) (figuur 1).

MS-analyse werd uitgevoerd op vier PD-replicaties uitgevoerd met behulp van +RNA of -RNA (figuur 2). De identificatie van de interactomen van +RNA en -RNA valt buiten het bereik van dit protocol, maar sommige resultaten die de nauwkeurigheid van het protocol valideren, worden gerapporteerd. Van belang is dat het plotten van de significant verrijkte eiwitten in een vulkaanplot onthulde dat het totale eiwitgehalte en de verrijkte eiwitten geëlueerd uit + RNA significant hoger was dan wat werd teruggewonnen uit -RNA (figuur 2). Dit betekent dat, ondanks het feit dat +RNA dezelfde lengte en structurele inhoud (lineair) heeft, een groter aantal specifieke interacties kan vaststellen, die worden behouden tot aan de elutiestap met een hoog zoutgehalte. Het is waarschijnlijk dat -RNA in plaats daarvan een groter aantal niet-specifieke contacten tot stand brengt die tijdens de wasstappen worden verstoord. Zoals verwacht werd TDP-43 geïdentificeerd als een unieke interactor van +RNA²⁰; de gemiddelde labelvrije kwantificering (LFQ) voor de vier PD-replicaten uitgevoerd met +RNA is 31,96 ± 0,56, terwijl het eiwit niet wordt geïdentificeerd onder de interactoren van -RNA. Bovendien bleek TDP-43 van alle unieke interactoren van +RNA het meest overvloedig verrijkte eiwit te zijn.

Om het protocol verder te valideren, werd het interne algoritme catRAPID^18,19 gebruikt om computationeel te voorspellen welke andere eiwitten specifiek +RNA of -RNA zouden binden. In het bijzonder werden interactiescores voor +RNA en -RNA met de eiwitten waaruit het menselijk proteoom bestaat berekend met behulp van de catRAPID 'interactieneiging'-functie, zoals gedefinieerd in ons eerdere werk²⁷. Van de eiwitten die met hoge betrouwbaarheid werden gescoord, werd voorspeld dat HNRNPH3 selectief +RNA (+RNA-interactiescore = 1,01; -RNA-interactiescore = 0,21) en PCBP2 bindt om specifiek te interageren met -RNA (+RNA-interactiescore = -0,5; -RNA-interactiescore = 0,31) (figuur 3A). Bovendien werd voorspeld dat het eiwit RBM41 promiscue was voor beide RNA-oligonucleotiden (+RNA-interactiescore = 0,4; -RNA-interactiescore = 0,39) (figuur 3A). De MS-analyse bevestigde inderdaad de aanwezigheid van HNRNPH3 en PCBP2 in de PD van respectievelijk +RNA en -RNA, terwijl RBM41 interageert met beide (figuur 3B).

WB werd gebruikt om de aanwezigheid van TDP-43 te detecteren om de resultaten verder te bevestigen en tijdens protocoloptimalisatie (figuur 4). In de hier beschreven procedure werden verschillende monsters verzameld in verschillende stadia. Het inputmonster (IN) bestond uit de totale eiwitten verdund in lysisbuffer. De doorstroming (FT) werd verkregen na een nachtelijke incubatie van de totale eiwitten met de streptavidineparels vooraf gecoat met het gebiotinyleerde RNA, dat de fractie van eiwitten vertegenwoordigt die het RNA niet binden. Ten slotte bevatte het eluaat (EL) alle eiwitten die specifiek het onderzochte RNA herkenden, omdat tussen de FT- en de EL-stappen drie wasstappen met 150 mM zout en 0,1% triton-X de zwakste interacties hadden moeten verwijderen.

Voor elke replicatie werd dezelfde hoeveelheid (5% v/v) IN, FT en EL parallel uitgevoerd op een SDS-PAGE en gekleurd met een anti-TDP-43-antilichaam (figuur 4). In het geval van +RNA werd de band van TDP-43 waargenomen in IN en in EL, wat aangeeft dat het eiwit, dat vanaf het begin aanwezig is in het totale eiwitextract, tijdens de wasstappen door +RNA wordt vastgehouden en pas aan het einde wordt geëlueerd met een hoge zoutbuffer. TDP-43 was ook aanwezig in IN voor -RNA, maar de band die overeenkomt met het eiwit is ook zichtbaar in FT, wat aangeeft dat dit RNA TDP-43 niet bindt. De afwezigheid van de TDP-43 band in EL bevestigt dit resultaat.

Tijdens de optimalisatie van het protocol werd de elutie van de eiwitten die specifiek gebonden zijn aan de RNA-sequenties onderzocht, zowel met een elutiebuffer met 1 M NaCl (EB1) als met een elutiebuffer compleet met 2 M NaCl (EB2) (figuur 4). Eluaten verkregen met een van beide EB werden vergeleken op een SDS-PAGE en gewist met het anti-TDP-43 antilichaam. De verkregen beelden werden vervolgens geanalyseerd met ImageJ²⁸ om elk verschil in TDP-43-hoeveelheid geëlueerd met de twee buffers te kwantificeren. Over het algemeen werd geen significant verschil waargenomen en we concludeerden dat, binnen deze testen, 1 M zout voldoende is om zelfs de sterkste eiwit-RNA-interacties te verstoren.

Over het algemeen tonen de hier gerapporteerde resultaten voor MS en WBs aan dat dit protocol efficiënt is in het op een specifieke manier vastleggen van de eiwitinteractoren van een bepaald RNA en dat het de elutie in buffers mogelijk maakt die compatibel zijn met downstream-analyse.

Figuur 1: Schets van de experimentele pijplijn die in het voorgestelde protocol wordt gebruikt . (A) Het gebiotinyleerde RNA-oligonucleotide wordt bereid in lysisbuffer bij de juiste concentratie. (B) Magnetische streptavidin-kralen worden gewassen, geblokkeerd met gist-tRNA en geladen met het gebiotinyleerde RNA. (C) Totaal eiwitextract afkomstig van gekweekte zoogdiercellijnen wordt toegevoegd aan het kralen-RNA-mengsel. (D) Meerdere wasbeurten worden uitgevoerd om niet-specifieke interacties te verwijderen. (E) De specifieke eiwitinteractoren worden met een hypertone oplossing losgemaakt van het RNA. (F) De identiteit van de interactoren wordt onthuld door massaspectrometrie en specifieke gevallen worden gevalideerd door western blot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Analytische strategie voor labelvrije MS-gebaseerde eiwitkwantificering . (A) Geëlueerde eiwitten worden 's nachts neergeslagen in koude aceton. Eiwitten worden vervolgens gedenatureerd en een in-oplossing vertering wordt uitgevoerd. Proteolytische peptiden worden geconcentreerd en ontzout. (B) Peptiden worden geanalyseerd via LC-MS/MS met behulp van een "shotgun approach". (C) Verwerking en analyse van ruwe gegevens worden uitgevoerd met behulp van respectievelijk MaxQuant- en Perseus-software. (D) Statistisch significante verrijkte eiwitten worden weergegeven in een vulkaanplot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Correlatie tussen voorspelde interactieneigingen en experimenteel bepaalde interacties van +RNA en -RNA. (A) catRAPID-interactiescores ten opzichte van HNRNPH3, PCBP2 en RBM41, wat wijst op preferentiële binding van HNRNPH3 voor +RNA en van PCBP2 voor -RNA, terwijl RBM41 naar verwachting beide RNA-sequenties zonder onderscheid bindt. (B) Labelvrije kwantificeringsgemiddelden bepaald door massaspectrometrie-analyse van de pull-downs uitgevoerd met +RNA en -RNA. De analyse bevestigt dat HNRNPH3 alleen +RNA bindt, PCBP2 alleen -RNA bindt en RBM41 beide in gelijke mate bindt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Western blot validatie van de aan-/afwezigheid van TDP-43 bij de interactoren van gekozen RNA-sequenties. Het WB-membraan is behandeld met anti-TDP-43-antilichaam. IN = invoer; FT = doorstroming; EL (EB1) = elutie met elutiebuffer 1; EL (EB2) = elutie met elutiebuffer 2; het teken "+" geeft monsters aan die zijn afgeleid van de pull-down uitgevoerd met +RNA; het teken "-" geeft monsters aan die zijn afgeleid van de pull-down uitgevoerd met -RNA; Baan 1 bevat een eiwitladder. TDP-43 wordt aangegeven met een pijl. De WB geeft aan dat TDP-43 wordt gevonden onder +RNA-interactoren, maar niet onder -RNA-interactoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Buffernaam			Compositie
10x Tranfer buffer			250 mM tris, 1,92 M glycine, 1% SDS, 20% methanol. Verdun 10 vouwen voor gebruik			PD
20X MES SDS lopende buffer			1 M MES, 1 M tris, 2% SDS, 20 mM EDTA. Stel de pH in op 7,3. Verdun 20 vouwen voor gebruik
4x Voorbeeld laadbuffer			0,25 M Tris-base, 0,28 M SDS, 40% glycerol, 20% 2-mercapto-ethanol, 4 mg/ml bromphenol blauw
Elutiebuffer 1			20 mM fosfaat pH 7,5, 1 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (toe te voegen na kwantificering)
Elutiebuffer 2			20 mM fosfaat pH 7,5, 2 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT (toe te voegen na kwantificering)
Lysis buffer			10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT en proteaseremmers
Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20			1 M Tris-HCl pH 7,4, 3 M NaCl, 2,0% Tween-20
Wasbuffer 1			10 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton TM X-100, 1 mM DTT en proteaseremmers
Wasbuffer 2			25 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 1 mM DTT en proteaseremmers
Buffer A			0,1% mierenzuur			MEVROUW
Buffer B			60% acetonitril, 0,1% mierenzuur
Denaturatiebuffer			8M ureum, 50 mM Tris-HCl

Tabel 1: PD- en MS-buffers. Namen en samenstelling van de buffers die worden gebruikt voor de pull-down experimenten (PD) of voor de massaspectrometrie-analyse (MS).

Discussion

Dit werk rapporteert de optimalisatie van een PD-protocol uitgevoerd met gebiotinyleerde RNA-oligonucleotiden om hun eiwitinteractoren te vangen. Het hier beschreven protocol is eenvoudig uit te voeren, vereist weinig materiaal en produceert zeer betrouwbare resultaten. Belangrijk is dat de meest nieuwe aspecten van dit protocol bestaan uit het gebruik van een RNA-aas dat volledig in silico is ontworpen en specifiek is voor het eiwitdoelwit, en de elutie van alle eiwitten die aan het RNA-aas zijn gebonden door hun interacties met een zoutrijke oplossing direct te verstoren, in plaats van door het streptavidin van het biotine te scheiden met reinigingsmiddel en behandeling bij hoge temperaturen.

Dit protocol maakt gebruik van de sterkte van de binding tussen biotine en streptavidin ^29,30. Volgens de gekozen streptavidin-kralen moet het laden van het gebiotinyleerde RNA worden getest en gekwantificeerd voordat verder wordt gegaan. Ook kan de driedimensionale vouw van RNA de laadefficiëntie op de kralen beïnvloeden, omdat het de blootstelling van het biotine aan het streptavidine kan beperken. Het blokkeren van de kralen met niet-gebiotinyleerd tRNA verbetert de reinheid van de resultaten door niet-specifieke interacties met de kralen te beperken. De belastingsbuffer en de elutiebuffer moeten worden gekozen afhankelijk van de downstream-toepassingen. Hier werden zeer milde omstandigheden voorgesteld, geschikt voor de meeste toepassingen en ontwikkeld om potentiële eiwitcomplexen te behouden. Deze methode is echter zeer aanpasbaar; de gebruiker kan elke cellijn en elke RNA-grootte kiezen en kan besluiten het protocol te herhalen na het vouwen / ontvouwen van het RNA om het effect van de structuur op de bindingseigenschappen te bepalen.

Een ander origineel aspect van dit protocol is het gebruik van in silico voorspellingstools om de juistheid van de resultaten^{te garanderen 20}. Vooraf weten welke eiwitten moeten worden geïdentificeerd als interactoren van het RNA van belang geeft het ongekende voordeel van het valideren van de technische aspecten van het protocol. Met behulp van een eenvoudige WB-analyse is het bijvoorbeeld mogelijk om de aanwezigheid van een bekend eiwitdoel in de monsters afgeleid van de verschillende stappen van het protocol te verifiëren voordat u doorgaat met de MS-analyse, die gespecialiseerde instrumentatie vereist en duurder is. Daarnaast werd onlangs een methode gerapporteerd om catRAPID²⁰, een intern eiwit-RNA-voorspellingsalgoritme, te gebruiken om de novo RNA specifiek voor een doeleiwit te ontwerpen. Tot voor kort was de enige beschikbare pijplijn om DNA/RNA-aptameren voor een doeleiwit te ontwerpen de SELEX-benadering (systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking)³¹. De in silico-methode maakt een veel sneller en kosteneffectief ontwerp van RNA-aptameren mogelijk.

De belangrijkste beperkingen van deze methode houden verband met de noodzaak om in nucleasevrije buffers en hulpmiddelen te werken. Bovendien, als het nodig wordt geacht om in vitro de binding tussen een de novo ontworpen RNA en een doeleiwit voorafgaand PD te bevestigen, moet het eiwit worden geproduceerd en gezuiverd en moet de binding worden bepaald met biofysische benaderingen. Dit is een beperking die wordt gedeeld met de productie van monoklonale antilichamen.

Ondanks deze kleine problemen kunnen betrouwbare methoden om RNA-eiwitinteracties in kaart te brengen, zoals hier gepresenteerd, wetenschappers dichter bij het onthullen van macromoleculaire netwerken en complexe hoofdactoren van vele fysiologische en pathologische mechanismen, zoals die betrokken zijn bij kanker, cardiomyopathieën, diabetes, microbiële infecties en genetische en neurodegeneratieve aandoeningen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	VWR	10861-554	CELLS
Cell scrapers	BIOSIGMA	10153	CELLS
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium  (DMEM)	Thermo Fisher Scientfic	11995065	CELLS
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil	Thermo Fisher Scientfic	10500064	CELLS
Phosphate Buffer Saline (PBS, Waltham, MA)	Thermo Fisher Scientfic	14190169	CELLS
Trypsin (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientfic	15050065	CELLS
Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase (HRP)	Cellsignal	7070	PD
Biotinylated RNA	Eurofins	Custom RNA oligonucleotides	PD
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418	PD
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml	Biorad	1705061	PD
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Merck - Sigma Aldrich	5056489001	PD
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	PD
Recombinant anti-TDP43 antibody	Abcam	ab109535	PD
Ribonucleic acid, transfer from baker's yeast (S. cerevisiae)	Merck - Sigma Aldrich	R5636-1ML	PD
Streptavidin Mag Sepharose	Merck - Sigma Aldrich	GE28-9857-99	PD
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF Transfer Kit	Biorad	1704272	PD
Acetone	Thermo Fisher Scientfic	022928.K2	MS
C18 cartridge	Thermo Fisher Scientfic	13-110-018	MS
Dithiothreitol  (DTT)	Thermo Fisher Scientfic	20290	MS
EASY-Spray HPLC Columns	Thermo Scientific	ES902	MS
iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich S.r.l.	I6125	MS
Lys-C/Trypsin	Promega	V5073	MS
Trifluoroacetic acid (TFA)	Thermo Fisher Scientfic	28904	MS
Urea	Thermo Fisher Scientfic	J75826.A7	MS
Equipment
ChemiDoc imaging system	Bio-Rad		CELLS
Dyna Mag -2 , Magnetic rack	Invitrogen		CELLS
Forma Series 3 water jacketed C02 incubator	Thermo Scientific		PD
PROTEAN II xi cell , power supply for PAGE applications	Bio-Rad		PD
Rotating wheel, rotator SB3	Stuart		PD
Water bath set at 37 °C	VWR		PD
XCell SureLock Mini-Cell electrophoresis system	ThermoFisher Scientific		MS
Easy-nLC 1200 UHPLC	Thermo Scientific		MS
Q exactive Mass Spectrometer	Thermo Scientific		MS
Software	Version
MaxQuant	2.0.3.0		MS
Perseus	1.6.14.0		MS