Methodenartikel

Een innovatieve toolkit om de complexe mechanismen van hartritmestoornissen te onderzoeken

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64932

⸱

10 februari 2023

1Department of Medicine I, University Hospital Munich (LMU), Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Institute of Surgical Research at the Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, University Hospital, LMU Munich, 3DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU), LMU Munich

In dit artikel

Samenvatting

BESPREKTE ARTIKELEN:

Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Isolatie van hoge kwaliteit muis atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transients en L-Type calcium stroom. Journal of Visualized Experiments. (165), 10.3791/61964 (2020).

Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-Cell optische actiepotentiaal meting in menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten. Journal of Visualized Experiments. (166), 10.3791/61890 (2020).

Xia, R. et al. Isolatie en cultivering van residente hartmacrofagen uit de muis sinoatrial en atrioventriculaire knoop. Journal of Visualized Experiments. (171), 10.3791/62236 (2021).

Xia, R. et al. Whole-Mount immunofluorescence kleuring, confocale beeldvorming en 3D reconstructie van de sinoatrial en atrioventriculaire knoop bij de muis. Journal of Visualized Experiments. (166), 10.3791/62058 (2020).

Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Micro-elektrode array opname van de sinoatrial knoop vuurfrequentie om intrinsieke cardiale pacemaking defecten bij muizen te identificeren. Journal of Visualized Experiments. (173), 10.3791/62735 (2021).

Scherschel, K. et al. Locatie, dissectie en analyse van het muis stellate ganglion. Journal of Visualized Experiments. (166), 10.3791/62026 (2020).

Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Verwijdering van een interne translationele startplaats uit mRNA terwijl de expressie van het volledige eiwit wordt behouden. Journal of Visualized Experiments. (181), 10.3791/63405 (2022).

Rotzer, R. D. et al. Implantatie van gecombineerde telemetrische ECG en bloeddrukzenders om spontane baroreflex gevoeligheid bij bewuste muizen te bepalen. Journal of Visualized Experiments. (168), 10.3791/62101 (2021).

Tomsits, P. et al. Analyse van langdurige elektrocardiografie opnames om aritmieën bij muizen te detecteren. Journal of Visualized Experiments. (171), 10.3791/62386 (2021).

Grab, M. et al. Ontwikkeling en evaluatie van 3D-geprinte cardiovasculaire fantomen voor interventionele planning en training. Journal of Visualized Experiments. (167), 10.3791/62063 (2021).

Redactioneel

Hartritmestoornissen zijn zeer gebruikelijk en klinisch zeer relevant; de huidige behandeling is echter grotendeels onvoldoende omdat de meeste therapeutische strategieën zich alleen op symptomen richten in plaats van op de oorzakelijke mechanismen van hartritmestoornissen. Daarom is een beter begrip van de complexe ziektemechanismen dringend noodzakelijk om nieuwe, innovatieve en causale behandelingen te ontwikkelen.

Het doel van de huidige JoVE-methodencollectie is om een onbevooroordeelde en diverse reeks protocollen te bieden die het mogelijk maken om verschillende aspecten van aritmogeneze grondig te onderzoeken.

Een veranderde calciumhomeostase is een van de kenmerken van aritmogeneze, maar is nog steeds uitdagend om te onderzoeken, omdat er meerdere aspecten in overweging moeten worden genomen, die elk specifieke technieken vereisen om te bestuderen1,2. In deze methodencollectie bieden Tomsits et al. een protocol dat het mogelijk maakt om atriale en ventriculaire cardiomyocyten uit dezelfde muis te isoleren en tegelijkertijd zowel de L-type calciumstroom als calciumtransienten te bestuderen3. Dit protocol stelt onderzoekers dus in staat om calciumstoornissen globaler te onderzoeken en tegelijkertijd het aantal dieren te verminderen, wat een significante wetenschappelijke en ethische verbetering vertegenwoordigt.

Het patchen van geïsoleerde cellen blijft echter complex, arbeidsintensief en experimenten met lage doorvoer4. Om dit aan te pakken, bieden Seibertz et al. een protocol dat een spanningsgevoelige kleurstof gebruikt om actiepotentialen te meten in door geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten5. Aangezien de techniek geen uitgebreide training vereist (zoals nodig is voor patch clamping) en kan worden toegepast met behulp van een relatief goedkope experimentele setup, heeft dit protocol brede toepassingen.

Naast cardiomyocyten spelen ook andere celtypen (bijv. fibroblasten of macrofagen) een belangrijke rol in de elektrofysiologie6,7,8. Om celtype-specifieke effecten in het geleidingssysteem te onderzoeken, bieden Xia et al. een stapsgewijze handleiding om de sinusknoop (SAN) en de atrioventriculaire knoop (AVN) in muizen te identificeren9,10, gevolgd door microdissectie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) om macrofagen te isoleren en te bestuderen9 of door volledige immunofluorescence-beeldvorming. Dit maakt de identificatie van verschillende celtypen mogelijk, de evaluatie van de driedimensionale structuur en de studie van celtype-specifieke eiwitexpressie binnen de SAN/AVN10.

Bovendien kunnen multi-elektrode array (MEA) opnames worden uitgevoerd op dergelijke volledige preparaten zoals gepresenteerd door Kumar et al.11. Deze methode is een uitstekende aanvulling op de momenteel gebruikte technieken omdat deze relatief snel en eenvoudig is en ook een superieure ruimtelijke resolutie biedt. Het maakt farmacologische interventies mogelijk en kan gemakkelijk worden toegepast op andere specifieke regio's van het hart (bijv. de AVN).

Het autonome zenuwstelsel speelt een essentiële rol in de elektrofysiologie12,13,14 en er bestaan behandelingsstrategieën, zoals sympathectomie15,16,17,18 of ablatie van cardiale ganglia19. Desondanks is de mechanistische basis nog grotendeels onbekend, vooral omdat anatomische structuren van het autonome zenuwstelsel niet gemakkelijk toegankelijk zijn bij muizen. In deze uitgave bieden Scherschel et al. een protocol dat de identificatie en dissectie van de stellaatganglia bij muizen mogelijk maakt om gen- en eiwitexpressie in verschillende celtypen te bestuderen20. Dit zal de studie van nieuwe aspecten van autonoom hermodellering mogelijk maken.

Het bestuderen van elektrofysiologie op cellulair niveau is cruciaal om de fundamentele mechanismen te bestuderen. Echter, in vivo studies in diermodellen zijn nog steeds nodig om cellulaire bevindingen te valideren en de (patho-)fysiologische relevantie van geïdentificeerde doelstructuren te bevestigen21. Muizen worden het meest gebruikt, maar vooral het genereren van transgene muizen is complex. In deze uitgave presenteren Shimura et al. een protocol dat CRISPR-Cas9 gen-editing gebruikt om specifiek de complexe regulerende rollen van geamputeerde eiwitten en hun effecten in vivo te bestuderen. Hiervoor hebben ze een transgenisch muismodel gegenereerd met een enkele puntmutatie in het GJA1-gen dat connexine-43 codeert. Dit resulteert in een reguliere expressie van de volledige Cx43, maar een verminderde expressie van een geamputeerde Cx4322.

Een van de belangrijkste beperkingen van in vivo studies is de noodzaak om dieren tijdens experimenten te anesthetiseren, wat verschillende elektrofysiologische parameters kan beïnvloeden en dus mogelijk niet de ‘echte’ situatie vertegenwoordigt23,24. Telemetrische apparaten daarentegen maken de studie van wakkere en vrij bewegende muizen mogelijk over lange periodes van enkele weken tot maanden25,26. Rötzer et al. beschrijven hoe telemetrische apparaten kunnen worden geïmplanteerd om de hartslag en bloeddruk gelijktijdig bij muizen te registreren, wat specifiek onderzoek naar het autonome zenuwstelsel en de baroreflexgevoeligheid mogelijk maakt

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteur werd ondersteund door het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek (DZHK; 81X2600255, 81X2600270, 81X2600266), de Corona Foundation (S199/10079/2019), het ERA-NET voor Cardiovasculaire Ziekten (ERA-CVD; 01KL1910) en de Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung. De financiers hadden geen rol in de voorbereiding van het manuscript.

Referenties

  1. Denham, N. C., et al. Calcium in the pathophysiology of atrial fibrillation and heart failure. Frontiers in Physiology. 9, 1380(2018).
  2. Grandi, E., et al. Human atrial action potential and Ca2+ model: sinus rhythm and chronic atrial fibrillation. Circulation Research. 109 (9), 1055-1066 (2011).
  3. Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and L-Type calcium current. Journal of Visualized Experiments. (165), e61964(2020).
  4. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).
  5. Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-Cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (166), e61890(2020).
  6. Grune, J., et al. Neutrophils incite and macrophages avert electrical storm after myocardial infarction. Nature Cardiovascular Research. 1 (7), 649-664 (2022).
  7. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  8. Xia, R., et al. Cardiac macrophages and their effects on arrhythmogenesis. Frontiers in Physiology. 13, 900094(2022).
  9. Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), e62236(2021).
  10. Xia, R., et al. Whole-Mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058(2020).
  11. Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice. Journal of Visualized Experiments. (173), e62735(2021).
  12. Chen, P. S., Choi, E. K., Zhou, S., Lin, S. F., Chen, L. S. Cardiac neural remodeling and its role in arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 7 (10), 1512-1513 (2010).
  13. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  14. Gardner, R. T., Ripplinger, C. M., Myles, R. C., Habecker, B. A. Molecular mechanisms of sympathetic remodeling and arrhythmias. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (2), 001359(2016).
  15. Dusi, V., De Ferrari, G. M., Pugliese, L., Schwartz, P. J. Cardiac sympathetic denervation in channelopathies. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 27(2019).
  16. Dusi, V., et al. Left cardiac sympathetic denervation for long QT syndrome: 50 years' experience provides guidance for management. JACC Clinical Electrophysiology. 8 (3), 281-294 (2022).
  17. De Ferrari, G. M., et al. Clinical management of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia: The role of left cardiac sympathetic denervation. Circulation. 131 (25), 2185-2193 (2015).
  18. Schwartz, P. J., Ackerman, M. J. Cardiac sympathetic denervation in the prevention of genetically mediated life-threatening ventricular arrhythmias. European Heart Journal. 43 (22), 2096-2102 (2022).
  19. Qin, M., Zeng, C., Liu, X. The cardiac autonomic nervous system: A target for modulation of atrial fibrillation. Clinical Cardiology. 42 (6), 644-652 (2019).
  20. Scherschel, K., et al. dissection, and analysis of the murine stellate ganglion. Journal of Visualized Experiments. (166), e62026(2020).
  21. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nat Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  22. Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Removal of an internal translational start site from mRNA while retaining expression of the full-length protein. Journal of Visualized Experiments. (181), e63405(2022).
  23. Bennett, K., Lewis, K. Sedation and anesthesia in rodents. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 25 (1), 211-255 (2022).
  24. Poon, Y. Y., et al. Disproportional cardiovascular depressive effects of isoflurane: Serendipitous findings from a comprehensive re-visit in mice. Lab Animal (NY). 50 (1), 26-31 (2021).
  25. Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260(2011).
  26. McCauley, M. D., Wehrens, X. H. Ambulatory ECG recording in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), 10(2010).
  27. Rotzer, R. D., et al. Implantation of combined telemetric ECG and blood pressure transmitters to determine spontaneous baroreflex sensitivity in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (168), e62101(2021).
  28. Tomsits, P., et al. Analyzing long-term electrocardiography recordings to detect arrhythmias in mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e62386(2021).
  29. Hytonen, J. P., Yla-Herttuala, S. Preclinical evaluation of coronary artery stents. Journal of Visualized Experiments. (186), e64038(2022).
  30. Gruzdeva, O. V., et al. Comparative analysis of the hemostasiological profile in sheep and patients with cardiovascular pathology as the basis for predicting thrombotic risks during preclinical tests of vascular prostheses. Sovremennye Tekhnologii v Meditsine. 13 (1), 52-56 (2021).
  31. Weisskopf, M., Kron, M., Giering, T., Walker, T., Cesarovic, N. The sheep as a pre-clinical model for testing intra-aortic percutaneous mechanical circulatory support devices. The International Journal of Artificial Organs. 44 (10), 703-710 (2021).
  32. Grab, M., et al. Development and evaluation of 3D-printed cardiovascular phantoms for interventional planning and training. Journal of Visualized Experiments. (167), e62063(2021).

Herprints en machtigingen

Tags

Cardiac MyocytesElectrocardiographyPacemaking DefectsCalcium CurrentOptical Action PotentialCardiac MacrophagesImmunofluorescence StainingMicroelectrode ArrayBaroreflex Sensitivity3D-printed Cardiovascular PhantomsSinoatrial NodeAtrioventricular Node
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.