Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) is naar voren gekomen als een waardevol modelsysteem op het gebied van neurowetenschappen. De toepassing van confocale microscopie in de Drosophila NMJ stelt onderzoekers in staat om synaptische informatie te verkrijgen, die zowel kwantitatieve gegevens over de overvloed aan synapsen als gedetailleerde inzichten in hun morfologie omvat. De diffuse verdeling en het beperkte visuele bereik van de TEM vormen echter een uitdaging voor de ultrastructurele analyse. Deze studie introduceert een innovatieve en efficiënte methode voor monstervoorbereiding die de conventionele aanpak overtreft. De procedure begint met het plaatsen van een metalen gaas op de bodem van een fles of reageerbuis met platte bodem, gevolgd door het plaatsen van vaste larvenmonsters op het gaas. Een extra gaas wordt over de monsters geplaatst en zorgt ervoor dat ze tussen de twee mazen worden geplaatst. De vaste monsters worden grondig gedehydrateerd en geïnfiltreerd voordat wordt overgegaan tot de inbeddingsprocedure. Vervolgens wordt het inbedden van de monsters in epoxyhars uitgevoerd op een vlakke plaat, waardoor de spieren kunnen worden voorbereid op positionering en secties. Door gebruik te maken van deze stappen kunnen alle spieren van Drosophila-larven worden gevisualiseerd met lichtmicroscopie, waardoor de daaropvolgende positionering en secties worden vergemakkelijkt. Overtollig hars wordt verwijderd na het lokaliseren van de6e en 7espieren van lichaamssegmenten A, 2 en A, 3. Seriële ultradunne secties van de 6eof 7espier worden uitgevoerd.
Inleiding
Elektronenmicroscopie is een van de meest ideale methoden voor het bestuderen van de ultrastructuur van biologische materialen die de interne structuur van cellen op nanoschaalniveau1 visueel en nauwkeurig kunnen aantonen. Vanwege de complexiteit van het monstervoorbereidingsproces en de hoge kosten is elektronenmicroscopie echter niet zo populair als lichtmicroscopie. Recente ontwikkelingen in elektronenmicroscopietechnieken hebben geleid tot aanzienlijke verbeteringen in de beeldkwaliteit, wat samenvalt met een opmerkelijke vermindering van de bijbehorende werklast. Elektronenmicroscopie heeft dan ook een belangrijke rol gespeeld bij het bevo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: De methode voor de voorbereiding van het transmissie-elektronenmicroscopiemonster die in dit artikel wordt gebruikt, is eerder gerapporteerd16. Het is belangrijk op te merken dat de selectie van reagentia en de aanpassing van de dosering noodzakelijk zijn, afhankelijk van het monster. Er worden veel giftige chemische reagentia gebruikt in het monstervoorbereidingsproces, daarom moet de operator bepaalde beschermende maatregelen nemen, zoals het dragen van beschermende kleding en handschoenen en het werken in een zuurkast.
1. Procedure voor dissectie, fixatie en plaatsing
- Sectie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De lichaamswand van de Drosophila-larve bestaat uit 30 identificeerbare spiervezels die in een regelmatig patroon zijn gerangschikt en ziet eruit als een dunne plak na dissectie en fixatie21 (Figuur 1A). Het monster blijft plat tijdens het uitdrogingsproces door de aanwezigheid van de metalen mazen (Figuur 1B, C). De lichaamsspier van de larve wordt begraven in een dunne plaat van epoxyhars (.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Monsters van Drosophila-larven hebben de neiging om op te krullen tijdens uitdroging, omdat de monsters dun zijn, waardoor het moeilijk is om de neuromusculaire overgang nauwkeurig te lokaliseren, waardoor de moeilijkheidsgraad en werklast voor de monstervoorbereiding toenemen. De traditionele verbetering is om de steekproef7 in te korten, maar de steekproeven waren nog steeds in verschillende mate gekruld.
In onze methode zijn er twee cruciale stappen: ten eer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China Grant 32070811 en het Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. We danken het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie en het Centrum voor Morfologische Analyse, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, China.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,2-Epoxypropaan | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetratiemiddel |
| Drosophila-stammen | Bloomington | geen | De wild-type controle Drosophila-stammen die in dit onderzoek werden gebruikt, waren allemaal W1118, en werden gekweekt volgens standaardkweekmethoden |
| Glazen testbuizen met platte bodem | Haimen Chenxing Experimental Equipment Company | geen | Glazen testbuizen met platte bodem (flesje) met sponsprop (of flesdop) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | De inbeddingsharsen zijn gebaseerd op een sterk verknoopte acrylaat- en methacrylaatformule |
| K4M-hars (monomeer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Hars Monomeer |
| Polyvinylfolie | Haimen Chenxing Experimental Equipment Company | geen | Transparante polyethyleenfolie is het beste, dikte van ongeveer 0,2 mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Barnsteenzuuranhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Versneller |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Verharder voor epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Hars Monomeer |
| Staalgaas | Yuhuiyuan Tuinwinkel (online) | geen | Koperen of roestvrij stalen net |
| Transmissie-elektronenmicroscopie | Hitachi H-7650 | 11416692 | Alle roosters (waarop monsters werden verzameld) werden gekleurd met loodcitrat en onder een transmissie-elektronenmicroscoop waargenomen. |
| Ultradunne microtoom | Leica UC7 ultradunne microtoom | 595915 | Alle snijbewerkingen worden uitgevoerd op een Leica UC7 ultradunne microtoom met behulp van een diamantmes |
Referenties
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan
