Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) is naar voren gekomen als een waardevol modelsysteem op het gebied van neurowetenschappen. De toepassing van confocale microscopie in de Drosophila NMJ stelt onderzoekers in staat om synaptische informatie te verkrijgen, die zowel kwantitatieve gegevens over de overvloed aan synapsen als gedetailleerde inzichten in hun morfologie omvat. De diffuse verdeling en het beperkte visuele bereik van de TEM vormen echter een uitdaging voor de ultrastructurele analyse. Deze studie introduceert een innovatieve en efficiënte methode voor monstervoorbereiding die de conventionele aanpak overtreft. De procedure begint met het plaatsen van een metalen gaas op de bodem van een fles of reageerbuis met platte bodem, gevolgd door het plaatsen van vaste larvenmonsters op het gaas. Een extra gaas wordt over de monsters geplaatst en zorgt ervoor dat ze tussen de twee mazen worden geplaatst. De vaste monsters worden grondig gedehydrateerd en geïnfiltreerd voordat wordt overgegaan tot de inbeddingsprocedure. Vervolgens wordt het inbedden van de monsters in epoxyhars uitgevoerd op een vlakke plaat, waardoor de spieren kunnen worden voorbereid op positionering en secties. Door gebruik te maken van deze stappen kunnen alle spieren van Drosophila-larven worden gevisualiseerd met lichtmicroscopie, waardoor de daaropvolgende positionering en secties worden vergemakkelijkt. Overtollig hars wordt verwijderd na het lokaliseren van de6e en 7espieren van lichaamssegmenten A, 2 en A, 3. Seriële ultradunne secties van de 6eof 7espier worden uitgevoerd.
Inleiding
Elektronenmicroscopie is een van de meest ideale methoden voor het bestuderen van de ultrastructuur van biologische materialen die de interne structuur van cellen op nanoschaalniveau1 visueel en nauwkeurig kunnen aantonen. Vanwege de complexiteit van het monstervoorbereidingsproces en de hoge kosten is elektronenmicroscopie echter niet zo populair als lichtmicroscopie. Recente ontwikkelingen in elektronenmicroscopietechnieken hebben geleid tot aanzienlijke verbeteringen in de beeldkwaliteit, wat samenvalt met een opmerkelijke vermindering van de bijbehorende werklast. Elektronenmicroscopie heeft dan ook een belangrijke rol gespeeld bij het bevorderen van wetenschappelijke kennis op diverse gebieden2.
Drosophila is een uitstekend diermodel voor het uitvoeren van genetische manipulaties om de ruimtelijke en temporele expressie van doelgenen nauwkeurig te regelen3. Bovendien heeft Drosophila de voordelen van een korte groeiperiode en gemakkelijke opfok in vergelijking met zoogdiermodellen; daarom wordt Drosophila veel gebruikt in morfologieonderzoek 4,5.
Bij Drosophila-larven zijn neuromusculaire junctie (NMJ) boutons wijd verspreid in de spieren 6,7, en immunokleuring van NMJ kan gemakkelijk informatie geven over de hoeveelheid synaps en morfologie 8,9 . De NMJ-boutons die zich in de 6e/7espieren van deA2- en A3-segmenten bevinden, zijn zeer geschikt voor kwantitatief en morfologisch onderzoek met behulp van lichtmicroscopie. Dit komt door hun grootte en overvloed10,11. Daarom worden Drosophila-larven NMJ's beschouwd als een nuttig model voor neurowetenschappelijk onderzoek12.
Het is echter een uitdaging om de NMJ bouton-ultrastructuur door de TEM waar te nemen. Omdat het scanvenster van transmissie-elektronenmicroscopie smal is, is het moeilijk om de wijdverspreide NMJ-boutons13 te positioneren. De andere reden is dat de lichaamswand van Drosophila gevoelig is voor krullen tijdens de alcoholuitdrogingsstap van het monstervoorbereidingsprotocol7.
Traditionele studies hebben meestal boutons tussen de 6een 7espieren van de A, 2 en A3 segmenten gekozen als monstermateriaal vanwege hun overvloed en grootte14,15. De 6een 7espieren van deA2- enA3-segmenten zijn groter dan de andere spieren en bevatten meer boutons. Wanneer monsters echter werden voorbereid voor elektronenmicroscopie, hadden vaste monsters de neiging dun te worden en vatbaar voor krullen, wat leidde tot een onjuiste positionering van de 6een 7espieren van de A2 en A3 segmenten.
Hierbij rapporteren we een nieuwe verwerkingsprocedure die effectiever is in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode van monstervoorbereiding 7,16, door de monsters plat te laten blijven tijdens de daaropvolgende uitdroging, waardoor een betere positionering van de neuromusculaire knooppunten van de Drosophila-larven wordt vergemakkelijkt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: De methode voor de voorbereiding van het transmissie-elektronenmicroscopiemonster die in dit artikel wordt gebruikt, is eerder gerapporteerd16. Het is belangrijk op te merken dat de selectie van reagentia en de aanpassing van de dosering noodzakelijk zijn, afhankelijk van het monster. Er worden veel giftige chemische reagentia gebruikt in het monstervoorbereidingsproces, daarom moet de operator bepaalde beschermende maatregelen nemen, zoals het dragen van beschermende kleding en handschoenen en het werken in een zuurkast.
1. Procedure voor dissectie, fixatie en plaatsing
- Sectie
- Ontleed de zwervende larven van de late 3e instar in Jan-oplossing en verkrijg de volledige lichaamswand op basis van de standaardprocedures17. Bereid de oplossing van Jan als volgt voor: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35mM sucrose, 5mM HEPES, pH 7,4
OPMERKING: De lichaamswand van Drosophila-larven verwijst naar de buitenste laag of omhulsel van het larvale stadium van de fruitvlieg Drosophila. Dit omvat de cuticula, epidermale cellen en onderliggende weefsels die het larvale exoskelet vormen. De lichaamswand biedt structurele ondersteuning en bescherming en dient als barrière tussen het larvale lichaam en de externe omgeving17.
- Ontleed de zwervende larven van de late 3e instar in Jan-oplossing en verkrijg de volledige lichaamswand op basis van de standaardprocedures17. Bereid de oplossing van Jan als volgt voor: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35mM sucrose, 5mM HEPES, pH 7,4
- Fixatie
- Fixeer de wand van het larvale lichaam in de snijkamer bij 4 °C 's nachts met het fixeermiddel. Meng voor de bereiding van het fixeermiddel 2% glutaaraldehyde en 2% formaldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7,4)
- Spoel de monsters meerdere keren af met natriumcacodylaatbuffer.
- Bereid 1% OsO4 in kakodylaatbuffer. Fixeer de monsters in 1% OsO4 gedurende 2 uur, gevolgd door verschillende spoelingen in gedestilleerd water.
OPMERKING: Dubbele fixatie met aldehyden en OsO4 zorgt voor een betere bescherming van de cellulaire ultrastructuur. Bovendien kan OsO4 vlekken maken in het monsterweefsel, waardoor het contrast tussen het licht en het monster duidelijker is18. - Kleur de Drosophila neuromusculaire junctiemonsters met 2% verzadigd uranylacetaat gedurende 2 uur, gevolgd door verschillende spoelingen met gedeïoniseerd water (Figuur 1A).
- Plaatsing van monsters
- Knip met een schaar twee ronde stukken metalen gaas van vergelijkbare grootte (poriegrootte 270 μm).
- Plaats vooraf een metalen gaas (270 μm) op de bodem van een fles met platte bodem.
- Plaats de vaste larvemonsters op het gaas en plaats er vervolgens een ander gaas op zodat de monsters tussen de twee mazen worden geplaatst.
2. Uitdroging
OPMERKING In dit artikel is de ethanolgradiënt-dehydratatiemethode gebruikt.
- Dehydrateer de monsters achtereenvolgens in een toenemende concentratiegradiënt van ethanol (50%, 70%, 85%, 95% elk eenmaal, 100% tweemaal), elk gedurende 20 minuten bij 4 °C.
- Spoel de monsters tweemaal af met propyleenoxide bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten per keer (Figuur 1C).
3. Infiltratie
OPMERKING: Infiltratie is een van de noodzakelijke stappen voor de voorbereiding van het TEM-monster. Infiltratie maakt de geleidelijke vervanging van het dehydratatiemedium door het inbeddingsmedium in het monster mogelijk om het vullen van de cel met het inbeddingsmedium mogelijk te maken19.
- Plaats de monsters in de gemengde oplossing van propyleenoxide en epoxyhars in een verhouding van 1:1 en 1:2 gedurende elk 1 uur, gevolgd door pure epoxyhars gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
4. Inbedding
- Maak een polyethyleenfilm en snijd deze in een groot vierkant (ongeveer 5 × 5 cm) en een kleine holle rechthoekige steun (ongeveer 2 × 2 cm). Lijm het kleine vierkant met het grote vierkant.
- Plaats voldoende epoxyhars in het midden van het grote vierkant.
- Plaats de monsters in de voorgepositioneerde epoxyhars met de spierkant naar boven. Gebruik een stereoscoop.
- Voeg enkele druppels hars toe aan de monsters en bedek ze vervolgens met PE-folie (iets groter dan de afstandhouder) (Figuur 1D-E).
- Polymeriseer de monsters bij respectievelijk 37 °C, 42 °C en 60 °C gedurende 24 uur (figuur 1F).
5. Procedure voor de opdeling
- Verwijder de overtollige delen van de larvale lichaamswand met een scherp mes en behoud een trapezium, inclusief het A2/A3 segment.
OPMERKING: De bovenste lijn moet zich in de buurt van de13e spier bevinden en de basislijn moet weg zijn van het monster naar de epoxyhars. De hoogte tussen de bovenlijn en de basislijn is ongeveer 5-8 mm. - Verwijder het trapezium van de rest van het monster en plak het met de A/B-lijm op de met hars gevulde capsule.
- Bevestig de positie van de 6een 7espier van de segmenten A, 2 en A, 3 onder de lichtmicroscopie (Figuur 1G) en houd het raakvlak evenwijdig aan de 6espier.
- Snijd een vijfde van het monster weg langs de twee zijden van hetA3-segment .
OPMERKING: Verwijder het grootste deel van de6e spier en behoud 1/3 van de breedte van de 7espier. - Bereid met behulp van een ultradunne microtoom een ultradun deel van het monster voor, te beginnen met de6e spier.
OPMERKING: Elke plak is ongeveer 90 nm dik. - Bevestig zoveel mogelijk plakjes aan elk koperen gaas.
- Voer transmissie-elektronenmicroscopie uit zoals eerder beschreven16.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De lichaamswand van de Drosophila-larve bestaat uit 30 identificeerbare spiervezels die in een regelmatig patroon zijn gerangschikt en ziet eruit als een dunne plak na dissectie en fixatie21 (Figuur 1A). Het monster blijft plat tijdens het uitdrogingsproces door de aanwezigheid van de metalen mazen (Figuur 1B, C). De lichaamsspier van de larve wordt begraven in een dunne plaat van epoxyhars (...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Monsters van Drosophila-larven hebben de neiging om op te krullen tijdens uitdroging, omdat de monsters dun zijn, waardoor het moeilijk is om de neuromusculaire overgang nauwkeurig te lokaliseren, waardoor de moeilijkheidsgraad en werklast voor de monstervoorbereiding toenemen. De traditionele verbetering is om de steekproef7 in te korten, maar de steekproeven waren nog steeds in verschillende mate gekruld.
In onze methode zijn er twee cruciale stappen: ten eer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China Grant 32070811 en het Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. We danken het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie en het Centrum voor Morfologische Analyse, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, China.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,2-Epoxypropaan | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetratiemiddel |
| Drosophila-stammen | Bloomington | geen | De wild-type controle Drosophila-stammen die in dit onderzoek werden gebruikt, waren allemaal W1118, en werden gekweekt volgens standaardkweekmethoden |
| Glazen testbuizen met platte bodem | Haimen Chenxing Experimental Equipment Company | geen | Glazen testbuizen met platte bodem (flesje) met sponsprop (of flesdop) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | De inbeddingsharsen zijn gebaseerd op een sterk verknoopte acrylaat- en methacrylaatformule |
| K4M-hars (monomeer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Hars Monomeer |
| Polyvinylfolie | Haimen Chenxing Experimental Equipment Company | geen | Transparante polyethyleenfolie is het beste, dikte van ongeveer 0,2 mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Barnsteenzuuranhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Versneller |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Verharder voor epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Hars Monomeer |
| Staalgaas | Yuhuiyuan Tuinwinkel (online) | geen | Koperen of roestvrij stalen net |
| Transmissie-elektronenmicroscopie | Hitachi H-7650 | 11416692 | Alle roosters (waarop monsters werden verzameld) werden gekleurd met loodcitrat en onder een transmissie-elektronenmicroscoop waargenomen. |
| Ultradunne microtoom | Leica UC7 ultradunne microtoom | 595915 | Alle snijbewerkingen worden uitgevoerd op een Leica UC7 ultradunne microtoom met behulp van een diamantmes |
Referenties
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
- Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753(2021).
- Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
- Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19(2020).
- Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
- Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
- Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
- Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107(2009).
- Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
- Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
- Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
- Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
- Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
- Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan
