Method Article

Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven

DOI:

10.3791/64934

⸱

September 15th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) is naar voren gekomen als een waardevol modelsysteem op het gebied van neurowetenschappen. De toepassing van confocale microscopie in de Drosophila NMJ stelt onderzoekers in staat om synaptische informatie te verkrijgen, die zowel kwantitatieve gegevens over de overvloed aan synapsen als gedetailleerde inzichten in hun morfologie omvat. De diffuse verdeling en het beperkte visuele bereik van de TEM vormen echter een uitdaging voor de ultrastructurele analyse. Deze studie introduceert een innovatieve en efficiënte methode voor monstervoorbereiding die de conventionele aanpak overtreft. De procedure begint met het plaatsen van een metalen gaas op de bodem van een fles of reageerbuis met platte bodem, gevolgd door het plaatsen van vaste larvenmonsters op het gaas. Een extra gaas wordt over de monsters geplaatst en zorgt ervoor dat ze tussen de twee mazen worden geplaatst. De vaste monsters worden grondig gedehydrateerd en geïnfiltreerd voordat wordt overgegaan tot de inbeddingsprocedure. Vervolgens wordt het inbedden van de monsters in epoxyhars uitgevoerd op een vlakke plaat, waardoor de spieren kunnen worden voorbereid op positionering en secties. Door gebruik te maken van deze stappen kunnen alle spieren van Drosophila-larven worden gevisualiseerd met lichtmicroscopie, waardoor de daaropvolgende positionering en secties worden vergemakkelijkt. Overtollig hars wordt verwijderd na het lokaliseren van de6e en 7espieren van lichaamssegmenten A, 2 en A, 3. Seriële ultradunne secties van de 6eof 7espier worden uitgevoerd.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektronenmicroscopie is een van de meest ideale methoden voor het bestuderen van de ultrastructuur van biologische materialen die de interne structuur van cellen op nanoschaalniveau1 visueel en nauwkeurig kunnen aantonen. Vanwege de complexiteit van het monstervoorbereidingsproces en de hoge kosten is elektronenmicroscopie echter niet zo populair als lichtmicroscopie. Recente ontwikkelingen in elektronenmicroscopietechnieken hebben geleid tot aanzienlijke verbeteringen in de beeldkwaliteit, wat samenvalt met een opmerkelijke vermindering van de bijbehorende werklast. Elektronenmicroscopie heeft dan ook een belangrijke rol gespeeld bij het bevo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De methode voor de voorbereiding van het transmissie-elektronenmicroscopiemonster die in dit artikel wordt gebruikt, is eerder gerapporteerd16. Het is belangrijk op te merken dat de selectie van reagentia en de aanpassing van de dosering noodzakelijk zijn, afhankelijk van het monster. Er worden veel giftige chemische reagentia gebruikt in het monstervoorbereidingsproces, daarom moet de operator bepaalde beschermende maatregelen nemen, zoals het dragen van beschermende kleding en handschoenen en het werken in een zuurkast.

1. Procedure voor dissectie, fixatie en plaatsing

  1. Sectie

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De lichaamswand van de Drosophila-larve bestaat uit 30 identificeerbare spiervezels die in een regelmatig patroon zijn gerangschikt en ziet eruit als een dunne plak na dissectie en fixatie21 (Figuur 1A). Het monster blijft plat tijdens het uitdrogingsproces door de aanwezigheid van de metalen mazen (Figuur 1B, C). De lichaamsspier van de larve wordt begraven in een dunne plaat van epoxyhars (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monsters van Drosophila-larven hebben de neiging om op te krullen tijdens uitdroging, omdat de monsters dun zijn, waardoor het moeilijk is om de neuromusculaire overgang nauwkeurig te lokaliseren, waardoor de moeilijkheidsgraad en werklast voor de monstervoorbereiding toenemen. De traditionele verbetering is om de steekproef7 in te korten, maar de steekproeven waren nog steeds in verschillende mate gekruld.

In onze methode zijn er twee cruciale stappen: ten eer.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China Grant 32070811 en het Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. We danken het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie en het Centrum voor Morfologische Analyse, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, China.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-EpoxypropaneSHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015Penetrating Agent
Drosophila StocksBloomingtonnoneThe wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods
Flat-bottomed glass test tubesHaimen Chenxing Experimental equipment Company noneFlat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper)
K4M cross-linker Agar ScientificCat# 1924BThe embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula 
K4M resin (monomer B) Agar ScientificLot# 631557Resin Monomer
Polyvinyl filmHaimen Chenxing Experimental equipment Company noneTransparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AFDodecenyl Succinic Anhydride
SPI-Chem DMP-30 EpoxySPI02823-DAAccelerator
SPI-Chem NMASPISpI#02828-AFHardner for Epoxy
SPI-PON 812 EpoxySPISPI#0259-ABResin Monomer
Steel mesh Yuhuiyuan Gardening Store(online)noneCopper or stainless steel net
Transmission electron microscopyHitachi H-765011416692All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy.
Ultrathin microtomeLeica UC7 ultrathin microtome595915All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Neuromuscular JunctionTransmission Electron MicroscopySample PreparationUltra Thin SectioningEpoxy Resin EmbeddingConfocal MicroscopyMuscle PositioningMetal Mesh TechniqueLarval Body WallSynaptic Structure

Related Articles