Methodenartikel

Ontwikkeling van Leishmania-soortenstammen met constitutieve expressie van eGFP

DOI:

10.3791/64939

⸱

21 april 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis - en L. donovani-stammen die het gen voor eGFP tot expressie brengen als een stabiel geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. Getransfecteerde parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit in beide soorten werden geselecteerd voor verder gebruik in medicijnscreeningtests.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania veroorzaken leishmaniasis , een ziekte met variabele klinische manifestaties die miljoenen mensen wereldwijd treft. Infectie met L. donovani kan leiden tot fatale viscerale ziekte. In Panama, Colombia en Costa Rica is L. panamensis verantwoordelijk voor de meeste gemelde gevallen van cutane en mucocutane leishmaniasis. Het bestuderen van een groot aantal kandidaat-geneesmiddelen met de tot nu toe beschikbare methodologieën is vrij moeilijk, aangezien ze zeer bewerkelijk zijn voor het evalueren van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire vormen van de parasiet of voor het uitvoeren van in vivo assays. In dit werk beschrijven we de generatie van L. panamensis en L. donovani stammen met constitutieve expressie van het gen dat codeert voor een verbeterd groen fluorescerend eiwit (eGFP) geïntegreerd in de locus die codeert voor 18S rRNA (ssu). Het gen dat codeert voor eGFP werd verkregen uit een commerciële vector en versterkt door polymerasekettingreactie (PCR) om het te verrijken en restrictieplaatsen toe te voegen voor de BglII- en KpnI-enzymen. Het eGFP-amplicon werd geïsoleerd door agarosegelzuivering, verteerd met de enzymen BglII en KpnI en geligeerd in de Leishmania-expressievector pLEXSY-sat2.1 die eerder met dezelfde set enzymen werd verteerd. De expressievector met het gekloonde gen werd gepropageerd in E. coli, gezuiverd, en de aanwezigheid van de insert werd geverifieerd door kolonie-PCR. Het gezuiverde plasmide werd gelineariseerd en gebruikt om L. donovani en L. panamensis parasieten te transfecteren. De integratie van het gen werd geverifieerd door PCR. De expressie van het eGFP-gen werd geëvalueerd door flowcytometrie. Fluorescerende parasieten werden gekloond door verdunning te beperken en klonen met de hoogste fluorescentie-intensiteit werden geselecteerd met behulp van flowcytometrie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protozoaire parasieten van het geslacht Leishmania veroorzaken leishmaniasis, een ziekte met een breed scala aan klinische manifestaties. Deze ziekte komt voor in 98 landen en de jaarlijkse incidentie wordt geschat op 0,9 tot 1,6 miljoen gevallen1. Leishmania-soorten die pathogeen zijn voor de mens zijn verdeeld in twee subgenera, namelijk L. (Leishmania) en L. (Viannia). Infectie met sommige soorten die tot de L behoren. (Leishmania) subgenus, zoals L. donovani en L. infantum, kan leiden tot viscerale leishmaniasis (VL), die fataal is als het onbehandeld blijft2. Soorten die behoren tot de L. (Viannia) subgenus zijn geassocieerd met de meeste gevallen van cutane leishmaniasis (CL) en mucocutane leishmaniasis (MCL) in Midden- en Zuid-Amerika, met name in Panama, Colombia en Costa Rica, waarbij L. panamensis de belangrijkste etiologische verwekker is van deze klinische presentaties 3,4.

Bestaande anti-leishmania chemotherapie die geneesmiddelen zoals pentavalente antimonialen, miltefosine en amfotericine B omvat, is zeer giftig en duur. Bovendien is de toegenomen resistentie tegen geneesmiddelen in de afgelopen decennia toegevoegd aan de factoren die de effectieve behandeling van patiënten wereldwijd verstoren5. Er zijn aanzienlijke verschillen aangetoond tussen soorten van het geslacht Leishmania met betrekking tot de gevoeligheid voor geneesmiddelen, met name tussen nieuwe en oude wereldsoorten 6,7. Om deze redenen is het noodzakelijk om de inspanningen te richten op de identificatie en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen tegen leishmania, met speciale aandacht voor soortspecifieke benaderingen. Het bestuderen van grote bibliotheken van kandidaat-geneesmiddelen met traditionele methodologieën is vrij moeilijk, aangezien deze methodologieën zeer arbeidsintensief zijn voor het evalueren van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire amastigoten of voor het uitvoeren van in vivo experimenten8; Daarom was het noodzakelijk om nieuwe technieken te ontwikkelen die deze nadelen verminderen, waaronder de implementatie van reportergenen en de ontwikkeling van fenotypische screeningstests met een hoog gehalte9.

Het gebruik van reportergenen heeft het potentieel aangetoond om de efficiëntie van het screeningproces van geneesmiddelen te verhogen, omdat het de ontwikkeling van high-throughput en in vivo assays vergemakkelijkt. Recombinante Leishmania-parasieten die verschillende reportergenen tot expressie brengen, zijn gegenereerd door verschillende onderzoeksgroepen. Reportergenen, zoals β-galactosidase, β-lactamase en luciferase, zijn geïntroduceerd in verschillende Leishmania-soorten met behulp van episomale vectoren, wat een beperkt nut aantoont voor geneesmiddelenscreening in extra- en intracellulaire vormen van de parasiet 10,11,12,13,14,15. Deze benaderingen hebben de beperking van het vereisen van een sterke selectieve druk in cultuur om de eliminatie van het episomale construct te voorkomen, evenals het gebruik van extra reagentia om de activiteit van het reportergen te onthullen. Omgekeerd zijn het groene fluorescerende eiwit (GFP) en zijn variant, het verbeterde groene fluorescerende eiwit (eGFP), gebruikt bij het genereren van een groot aantal transgene Leishmania-stammen voor in vitro screeningtests voor geneesmiddelen vanwege hun flexibiliteit en gevoeligheid, evenals de mogelijkheid om het screeningsproces te automatiseren met behulp van flowcytometrie of fluorometrie15, 16,17,18,19. Ondanks veelbelovende resultaten waren culturen van deze transgene stammen zeer heterogeen in hun fluorescentieniveaus, omdat het aantal kopieën van het GFP-gen niet bij alle parasieten hetzelfde was. Bovendien vereiste het handhaven van fluorescentie een constante selectieve druk op de parasieten in cultuur, omdat het GFP-gen werd geïntroduceerd in een episomale constructie.

Om de eerder genoemde redenen zijn veel inspanningen gericht op het ontwikkelen van nieuwe methoden voor het produceren van stabiele recombinante stammen. Deze inspanningen zijn meestal gebaseerd op de integratie van reportergenen in ribosomale loci, waarbij gebruik werd gemaakt van de hogere transcriptiesnelheden van ribosomale genen20. Stammen van L. infantum en L. amazonensis zijn gegenereerd met de integratie van de genen die coderen voor β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP 22 en tdTomato 23, en ze zijn geëvalueerd op hun bruikbaarheid in medicijnscreeningtests. Verschillende groepen hebben L. donovani-stammen ontwikkeld die GFP constitutief tot expressie brengen door het coderende gen te integreren in de 18S ribosomale RNA-locus (ssu locus) door homologe recombinatie24,25; ze vertoonden stabiele en homogene GFP-expressie in de getransfecteerde populatie, waaronder intracellulaire amastigoten 24,25, en ze werden met succes geïmplementeerd in medicijnscreeningstests24,25,26. Bolhassani et al.27 ontwikkelden stammen van L. major en L. infantum die GFP tot expressie brachten als een geïntegreerd transgen. Ze gebruikten de integratievector pLEXSY, oorspronkelijk ontworpen voor de transgene expressie van eiwitten in een systeem met L. tarentolae als gastheer28. De pLEXSY-GFP-vector is zeer efficiënt gebleken voor het genereren van verschillende Leishmania-stammen die constitutief GFP 24,25,27,29,30 tot expressie brengen. Bij deze parasieten is fluorescentie homogeen en wordt het gehandhaafd in de intracellulaire vormen, waardoor het kan worden gedetecteerd in voetzoollaesies van geïnfecteerde muizen27.

In dit werk beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor het genereren van L. panamensis - en L. donovani-stammen die het gen dat codeert voor eGFP tot expressie brengen als een geïntegreerd transgen met behulp van het pLEXSY-systeem. De stammen die door dit proces worden gegenereerd, worden in ons laboratorium gebruikt voor het uitvoeren van medicijnscreeningstests die de potentiële anti-leishmania-activiteit van moleculen van natuurlijke en synthetische oorsprong evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de monsters steriel te houden, moeten alle stappen met betrekking tot parasietkweek worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) kap of volgens de lokale gezondheids- en veiligheidsvoorschriften. Een grafische samenvatting van dit protocol is te vinden in figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Samenvattend schema van het protocol voor het genereren van eGFP-expressing L. panamensis en L. donovani parasieten met behulp van de pLEXSY-2.1 vectorfamilie. Alle zes de belangrijkste secties die in het artikel worden beschreven, worden hier weergegeven. 1) Amplificatie en insertie van het eGFP-gen in de pLEXSY-2.1-vector: het doelgen wordt versterkt, waarbij de herkenningsplaatsen voor de enzymen KpnI en BglII worden toegevoegd, en zowel het eGFP-amplicon als het pLEXSY-plasmide worden sequentieel verteerd met beide enzymen voor daaropvolgende ligatie met T4-ligase. 2) Linearisatie van het pLEXSY-expressieplasmide: het pLEXSY + eGFP-construct wordt verteerd met SwaI voor linearisatie en zuivering van de 7-8 kbp-expressiecassette. 3) Transfectie en 4) polyklonale selectie: Leishmania promastigoten worden getransfecteerd met de expressiecassette door elektroporatie en teruggezet in cultuur voor antibioticaselectie van recombinante parasieten. Fluorescentie van parasieten wordt bevestigd door flowcytometrie. 5) Bevestiging van genomische integratie en 6) klonen door verdunning te beperken: integratie van de pLEXSY-eGFP-expressiecassette wordt bevestigd door diagnostische PCR, met behulp van een voorwaartse primer die hybridiseert naar de expressiecassette en een omgekeerde primer die hybridiseert naar een chromosomale sequentie die afwezig is in de expressiecassette. Getransfecteerde culturen kunnen worden verrijkt voor fluorescerende parasieten door klonen door verdunning te beperken, en klonen met de hoogste gemiddelde fluorescerende intensiteiten kunnen worden geselecteerd voor verdere toepassingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Amplificatie en insertie van het eGFP-gen in de pLEXSY-2.1 vector

  1. Amplificatie van het eGFP-gen
    OPMERKING: Aangezien dit protocol de pLEXSY-2.1-vectorfamilie (zie materiaaltabel) gebruikt voor de constitutieve expressie van doeleiwitten na de integratie van de expressiecassette in de chromosomale 18S-rRNA-locus (ssu) van Leishmania-soorten , is de eerste stap het introduceren in het eGFP-gen van de sequenties die de restrictieplaatsen bevatten die het inbrengen in pLEXSY-2.1-vectoren mogelijk maken. In dit geval, omdat eGFP alleen cytosolisch tot expressie hoeft te worden gebracht, werden de restrictieplaatsen voor de enzymen BglII en KpnI toegevoegd in respectievelijk de 5'- en 3'-uiteinden van het eGFP-gen. Klonen met KpnI resulteert in de fusie van het doeleiwit tot een C-terminale polyhistidine-tag van zes residuen, gevolgd door een stopcodon gecodeerd in het pLEXSY-2.1-plasmide voor verdere zuivering van het eiwit van belang. Om deze reden bevat de omgekeerde primervolgorde geen stopcodon.
    1. Afhankelijk van de plasmidebron voor eGFP, analyseert u de doelsequentie met behulp van een restrictieanalysetool zoals NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 om ervoor te zorgen dat deze geen interne locaties bevat voor de restrictie-enzymen die worden gebruikt voor klonen (BglII en KpnI) of voor SwaI, het enzym dat wordt gebruikt voor vectorlinearisatie voorafgaand aan transfectie.
    2. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers voor eGFP-versterking met de BglII- en KpnI-restrictiesequenties. Als voorbeeld, de eGFP-bron voor dit protocol was de pEGFP-N1-1X plasmide32, en de primersequenties waren die gerapporteerd door Bolhassani et al.27:
      Forward primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII restrictieplaats vetgedrukt).
      Omgekeerde primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI restrictieplaats vetgedrukt).
    3. Amplificeer het doelgen met behulp van een high-fidelity polymerase om het behoud van de coderende sequentie te garanderen. Voer bijvoorbeeld voor de primers EGFP1 en EGFP2 het PCR-fietsprotocol uit zoals gerapporteerd door Bolhassani et al.27. Voer een initiële denaturatie uit van 2 minuten bij 94 °C, gevolgd door 30 cycli van 30 s bij 94 °C, 30 s bij 57 °C en 1 min bij 72 °C. Voer een laatste verlengstap van 10 minuten uit bij 72 °C. Voeg de primers toe in een eindconcentratie van 0,2 μM.
    4. Zuiver het fragment met behulp van een conventionele PCR-productzuiveringskit of standaard natriumacetaat- en ethanolprecipitatie, zoals elders beschreven33.
  2. Invoeging van de eGFP in de pLEXSY-2.1 expressievector
    1. Snijd de uiteinden van het eGFP-PCR-product bij met BglII en KpnI, volgens de instructies van de fabrikant.
      1. Stel eerst de reactie in voor het enzym dat de laagste zoutconcentratie vereist (in dit geval KpnI), volgens de instructies van de fabrikant, en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
      2. Voeg vervolgens 100 mM NaCl en 10 eenheden BglII toe en incubeer gedurende 15 minuten. Zuiver de reactie, zoals beschreven in stap 1.1.4.
    2. Verwerk de pLEXSY-expressievector met BglII en KpnI, volgens het sequentiële verteringsprotocol dat wordt beschreven in stap 1.2.1.
    3. Ligate de pLEXSY-vector en het eGFP-gen met T4-ligase met behulp van een molaire verhouding van 1:3 (vector:insert). Voeg kort 100 ng verteerd pLEXSY en 28 ng verteerd eGFP-product toe aan een reactie van 20 μL die ligasebuffer bevat in een eindconcentratie van 1x en 3 eenheden T4 DNA-ligase. Incubeer een nacht bij 4 °C.
    4. Transformeer competente E. coli-cellen , zoals XL-10, DH5α of DH10B, met het ligatieproduct verkregen in stap 1.2.3 met behulp van standaardtransformatieprotocollen33. Plaats de getransformeerde cellen in Luira-Bertani (LB)-ampicilline-agar en incubeer gedurende 24 uur bij 30 °C om recombinante klonen te selecteren (pLEXSY-plasmiden zijn stabieler in E. coli bij 30 °C dan bij 37 °C).
    5. Screen op de aanwezigheid van de insert in de plasmiden door kolonie PCR.
      1. Kies individuele kolonies, resuspensie in 20 μL nucleasevrij water, verwarm gedurende 15 minuten bij 95 °C en neem 1 μL van het lysaat als DNA-sjabloon voor kolonie-PCR. Gebruik de voorwaartse primer voor eGFP-amplificatie, beschreven in stap 1.1.2 (in dit voorbeeld EGFP1), en de primer A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') als omgekeerde primer29.
      2. De primer A264 is ontworpen om 80 bp na het stopcodon van de insert in pLEXSY-2.1-expressievectoren te gloeien. Gebruik bijvoorbeeld voor het primerpaar EGFP1 + A264 een PCR-cyclusprotocol bestaande uit een initiële denaturatie van 2 minuten bij 94 °C, gevolgd door 30 cycli van 30 s bij 94 °C, 30 s bij 50 °C en 1 min bij 72 °C. Voer een laatste verlengstap van 10 minuten uit bij 72 °C. De primers worden toegevoegd in een eindconcentratie van 0,2 μM.
        OPMERKING: Het verwachte product met deze primerset is 859 bp lang. De gloeiplaatsen voor de primers EGFP1 en A264 zijn weergegeven in figuur 2.
    6. Bereid het gezuiverde plasmide-DNA van een positieve kloon voor op latere transfectie met behulp van een commerciële plasmide-isolatiekit of standaard alkalische precipitatie33. Gebruik 50 ml van een nachtcultuur bij 30 °C voor isolatie van minimaal 10 μg plasmide/positieve kloon.

2. Linearisatie van de pLEXSY expressie plasmide

  1. Gebruik ten minste 10 μg van het gezuiverde pLEXSY-eGFP plasmide voor vertering met SwaI (herkenningsplaats: 5'-ATTTAAAT-3'). Vergist gedurende 3-4 uur bij 25 °C en warmte-inactiveer bij 65 °C gedurende 20 minuten.
  2. Voer het verteringsproduct uit in agarosegel-elektroforese om de resulterende fragmenten te scheiden. Deze vertering zal twee fragmenten genereren, een 2,9 kbp-fragment dat de elementen vertegenwoordigt die nodig zijn voor replicatie en selectie in E. coli, en een 7-8 kbp-fragment dat de gelineariseerde expressiecassette vertegenwoordigt.
  3. Zuiver de expressiecassette met behulp van een commerciële agarosegelextractiekit.

3. Transfectie van L. panamensis en L. donovani door elektroporatie

OPMERKING: Leishmania-cultuur wordt uitgevoerd zoals elders beschreven34. In dit voorbeeld werden L. panamensis en L. donovani promastigoten gekweekt in schneider's insectenmedium, aangevuld met 20% (v/v) foetaal runderserum (FBS) en 50 μg/ml gentamicine, en geïncubeerd bij 26 °C.

  1. Laat de parasietculturen groeien totdat er voldoende log-fase of vroege stationaire-fase promastigoten zijn om ongeveer 4 x 107 parasieten per transfectie te gebruiken. De maximale celdichtheid per kweekkolf voordat de stationaire fase wordt bereikt, kan variëren afhankelijk van de Leishmania-soort en hoe goed de stammen zijn aangepast aan de laboratoriumomstandigheden. Bundel indien nodig de inhoud van meerdere kweekkolven.
  2. Centrifugeer de parasietcultuur op 2.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  3. Resuspendeer de pellet in elektroporatiebuffer bij 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4 en 6 mM glucose; pH 7,5)27 om een concentratie van 1 x 108 parasieten/ml te verkrijgen. Zet 10 min op ijs.
    OPMERKING: De elektroporatiebuffer moet vóór gebruik worden gesteriliseerd door filtering.
  4. Tegelijkertijd worden voorkoelbuizen met 2-10 μg gelineariseerde pLEXSY-eGFP geconstrueerd in een maximaal volume van 50 μL water of 10 mM trisbuffer (pH 8,0) en elektroporatiecuvetten van d = 2 mm.
  5. Voeg 350 μL voorgekoelde parasieten toe aan de buis met het gelineariseerde plasmide en breng de volledige 400 μL over in de elektroporatiecuvette op ijs. Tegelijkertijd elektroporeert u de parasietcellen zonder plasmide-DNA als een negatieve controle.
  6. Elektroporaat met behulp van een van deze twee protocollen:
    Exponentieel verval: 450 V, 450 μF, één puls.
    Tijdconstante: 450 V, T = 3,5 ms, één puls.
    OPMERKING: Deze protocollen werden uitgevoerd met behulp van een commerciële genpulser (Table of Materials) met PC- en CE-modules.
  7. Leg de cuvette gedurende 10 minuten terug op ijs en breng de geëlektropoeerde parasieten over op 5 ml van het juiste kweekmedium. In dit voorbeeld werd het insectenmedium van Schneider gebruikt, aangevuld met 20% (v/v) FBS. Incubeer bij 26 °C gedurende 20 uur.

4. Polyklonale selectie in cultuur

  1. Ongeveer 20 uur na elektroporatie, observeer de culturen onder een microscoop. Ten minste de helft van de parasietpopulatie moet visueel een goede morfologie en beweeglijkheid vertonen (druppelachtige promastigoten met oscillerend flagellum dat door de media beweegt en/of actieve parasietaggregaten vormt). Voeg het juiste selectieve antibioticum toe, afhankelijk van het gebruikte pLEXSY-plasmide. In dit voorbeeld wordt pLEXSY-sat2.1 gebruikt, dat streptothricineacetyltransferase als selectiemarker bevat. Gebruik daarom nourseothricine als een selectief antibioticum in een concentratie van 0,1 mg / ml.
  2. Volg de culturen microscopisch totdat een duidelijk verschil tussen de parasieten geëlektropoeerd met en zonder plasmide-DNA wordt gezien.
  3. Controleer de fluorescentie van de parasiet door middel van flowcytometrie.
    1. Centrifugeer 1 ml van de stationaire-fasecultuur op 2.000 x g gedurende 3 minuten bij RT. Was tweemaal in PBS en resuspensie de laatste pellet in 1 ml PBS.
      OPMERKING: De fluorescentie van eGFP kan worden gedetecteerd in het FL1-kanaal van de meeste commerciële cytometers. Versterkingsinstellingen voor voorwaartse en zijwaartse verstrooiing en het FL1-kanaal kan variëren tussen cytometers. Voor dit voorbeeld is een CyFlow space (Sysmex) cytometer gebruikt.
    2. Voer de monsters uit, verzamel 20.000 gebeurtenissen met een snelheid van 0,5 μL/s en stel de versterkingswaarden voor de kanalen forward scatter (FSC), side scatter (SSC) en fluorescence 1 (FL-1) in op respectievelijk 225,0, 200,0 en 520,0. Voer een controlemonster uit met niet-fluorescerende parasieten om de parasietpopulatie in een FSC versus SSC dot-plot te bepalen.
    3. Maak een poort (G1) met de parasietpopulatie en filter het FL-1-kanaal door die poort voor het bepalen van de autofluorescentie van promastigoten en het instellen van een bereikpoort (G2) voor het FL-1-kanaal.
    4. Voer de getransfecteerde parasieten uit om te controleren of er fluorescentie is. Noteer het percentage parasieten in G1 dat fluorescerend is en het gemiddelde van de fluorescentie-intensiteit in G2.

5. Bevestiging van genomische integratie

OPMERKING: De integratie van de pLEXSY-eGFP-expressiecassette kan worden bevestigd door diagnostische PCR, met behulp van een voorwaartse primerhybridisatie naar de expressiecassette (varieert afhankelijk van de gebruikte pLEXSY-2.1-vector) en de omgekeerde primer F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') hybridiserend tot een chromosomale ssu-flankerende sequentie die afwezig is in de expressiecassette. In dit voorbeeld wordt de F2999 forward primer (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') gebruikt omdat deze hybridiseert in de pLEXSY-sat2.1 expressiecassette. Een schematische weergave van de geïntegreerde expressiecassette en primergloeiplaatsen voor diagnostische PCR is weergegeven in figuur 2.

  1. Zuiver het genomische DNA van 2-5 ml van een stationaire fase parasietcultuur door conventionele fenol / chloroform extractie35 of met een commerciële kit.
  2. Voer de diagnostische PCR voor pLEXSY-sat2.1 uit met behulp van een cyclusprotocol dat bestaat uit een initiële denaturatie van 2 minuten bij 94 °C, gevolgd door 30 cycli van 30 s bij 94 °C, 30 s bij 53 °C en 1 min bij 72 °C. Voer een laatste verlengstap van 10 minuten uit bij 72 °C. De primers worden toegevoegd in een eindconcentratie van 0,2 μM.

figure-protocol-2
Figuur 2: Schematische weergave van de geïntegreerde expressiecassette. Vakken gelabeld als Chr-S (grijs) vertegenwoordigen de aangrenzende chromosomale sequenties van de 18S rRNA-locus (ssu) waarin de expressiecassette is geïntegreerd. De geïntegreerde expressiecassette bestaat uit 5' en 3' sequenties (blauw) voor homologe recombinatie in de ssu locus, een extra Leishmania ribosomale promotor (rood) voor verbeterde eiwitproductie, het eGFP-gen (groen), een selectiemarkergen (geel) en drie onvertaalde regio's (lichtgrijs), namelijk utr1, 2 en 3, die de splicingsignalen leveren voor post-transcriptionele mRNA-verwerking voor geoptimaliseerde expressie van eGFP en de selectiemarker in Leishmania-parasieten . Gloeiplaatsen voor voorwaartse en omgekeerde primers die worden gebruikt voor de verificatie van de aanwezigheid van de wisselplaat door kolonie-PCR (stap 1.2.5) worden gemarkeerd door de zwarte pijlen met het label cpcr-fwd (EGFP1-primer) en cpcr-rev (A264-primer), die een product van 859 bp afbakenen. De gloeiplaatsen voor voorwaartse en omgekeerde primers die worden gebruikt voor de verificatie van genomische integratie door diagnostische PCR (stap 5) worden gemarkeerd door de zwarte pijlen met het label sat-fwd (F2999 primer) en ssu-rev (F3002 primer), respectievelijk, die een product van 2.271 bp afbakenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Klonen door verdunning te beperken (optioneel)

  1. Bereid na bevestiging van fluorescentie door middel van flowcytometrie een verdunning van recombinante parasieten in een concentratie van vijf promastigoten/ml36.
  2. Voeg 100 μL van deze verdunning toe aan elk putje van een plaat met 96 putten. Op deze manier worden de platen gezaaid met een gemiddelde dichtheid van 0,5 promastigoten / put, wat ervoor zorgt dat sommige putten een enkele parasiet ontvangen terwijl de kans op meer dan één parasiet per put wordt geminimaliseerd36.
  3. Laat de plaat minstens 12 uur ongestoord. Volg de plaat microscopisch met een minimale vergroting van 100x totdat putjes met parasietgroei worden gedetecteerd.
  4. Wanneer een plaatput vol parasieten zit, gebruik dan de inhoud om een cultuur van 5 ml te enten. Dit duurt 1-2 weken.
  5. Wanneer kloonzaadculturen de stationaire fase bereiken, controleert u de fluorescentie met behulp van flowcytometrie, zoals beschreven in stap 4.3. Selecteer de klonen die moeten worden gebruikt voor verdere in vitro en in vivo assays op basis van het percentage fluorescerende parasieten en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit gemeten in het FL-1-kanaal. Streef naar klonen met 98% -99% fluorescerende parasieten en selecteer die met de hoogste gemiddelde fluorescentie-intensiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na het bouwen van het pLEXSY-eGFP-construct en het transformeren van competente E. coli-cellen, zullen kolonies die het construct met de eGFP-insert bevatten, een product van ongeveer 859 bp genereren na het uitvoeren van de kolonie-PCR zoals beschreven in paragraaf 1.2 (figuur 3A). Totale vertering van het gezuiverde plasmide uit positieve kolonies met behulp van SwaI moet twee karakteristieke fragmenten in gel-elektroforese geven, een 2,9 kbp-fragment dat het deel van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De voor- en nadelen van verschillende reportergenen zijn bestudeerd in verschillende protozoaire parasieten. Onder hen zijn GFP en eGFP intrinsiek fluorescerend en maken eenvoudige kwantificering en beeldvorming mogelijk. De fluorescerende activiteit van deze eiwitten kan worden gedetecteerd met minimale manipulatie met behulp van fluorescentiemicroscopie, fluorimetrie of flowcytometrie. Er zijn weinig studies uitgevoerd voor het genereren van GFP-expressing L. (Viannia) stammen, ondanks de aangetoonde ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, subsidienummer NI-177-2016, en Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, subsidienummers SNI-169-2018, SNI-008-2022 en SNI-060-2022.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 Well MicroplatesCorningCLS3340Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid
AgaroseSigma-AldrichA4718
Ampicillin sodium saltSigma-AldrichA8351BioXtra, geschikt voor celkweek
BglII restrictie-enzymNew England BioLabsR0144S2.000 eenheden. 10.000 eenheden/mL
Cell Culture FlasksCorningCLS430168Oppervlakte 25 cm2, gekantelde hals, dop (stopseal)
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad17001401
CyFlow SpaceSysmexNiet beschikbaar
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7021poeder, BioReagent, geschikt voor celkweek, geschikt voor insectencelcultuur, geschikt voor plantencelcultuur, ≥99,5%
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF7524
Gel Loading BufferSigma-AldrichG2526 De migratiesnelheid varieert met gelsamenstelling. Verdun 1:3 tot 1:6 met monster voor het laden.
Gene Pulser Xcell Electroporation SystemBio-Rad1652660Het systeem bestaat uit een hoofdeenheid, twee accessoire modules, de capaciteitsverlenging (CE-module) en de pulscontroller (PC-module) en een ShockPod cuvetkamer.
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation CuvettesBio-Rad1652086Pkg van 50, 0,2 cm–spleet steriele elektroporatie cuvet, voor gebruik met de Gene Pulser en MicroPulser Systemen, voor zoogdieren en andere eukaryotische cellen
Gentamicine oplossingSigma-AldrichG139750 mg/mL in gedeïoniseerd water, vloeistof, 0,1 μm gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek
GoTaq Long PCR Master MixPromegaM4021
HEPES oplossingSigma-AldrichH08871 M, pH 7,0-7,6, sterieel gefilterd, BioReagent, geschikt voor celkweek
Inverted microscopeOlympusIXplore Standard
KpnI-HF restrictie-enzymNew England BioLabsR3142S4.000 eenheden. 20.000 eenheden/mL
LB Broth met agarSigma-AldrichL3147Hoogwaardig gerefereerd voedingsrijk microbiologisch groeimedium met agar, geschikt voor reguliere E.coli cultuur.
LB Broth Sigma-AldrichL2542Vloeibaar microbiologisch groeimedium
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad1640300Mini horizontaal elektroforese systeem, inclusief 8- en 15-wels kam, 7 cm x 10 cm UV-transparante lade
pEGFP-N1-1xAddgene172281Expressie van eGFP mRNA gefuseerd met 1 tandemherhaling van een 50-basesequentie
pLEXSYcon2.1 expressiekitJena BioscienceEGE-1310satBevat integratieve constitutieve expressievector pLEXSY-sat2.1. Antibiotische selectie van transfectanten met Nourseothricin (NTC, clonNAT). Bevat alle primers voor diagnostische PCR's en sequencing.
KaliumchlorideMillipore529552Moleculair Biologie Kwaliteit - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmid Miniprep SystemPromegaA1222Tot 15 μg van Transfectie-Klaar Plasmid uit 3 mL culturen.
Schneider′s Insect MediumSigma-AldrichS0146Medium dat in ons laboratorium wordt gebruikt voor het kweken van Leishmania.
SOC MediumSigma-AldrichS1797
NatriumchlorideSigma-AldrichS3014voor moleculaire biologie, DNase, RNase en protease, niets gedetecteerd, ≥99% (titratie)
DinatriumfosfaatSigma-AldrichRDD038BioReagent, geschikt voor celkweek, geschikt voor insectencelcultuur, ≥99,0%, vrij stromend, Redi-Dri
SwaI restrictie-enzymNew England BioLabsR0604S2.000 eenheden. 10.000 eenheden/mL
SpuitfiltersCorningCLS431212geregenereerd cellulosemembraan, diam. 4 mm, poriëngrootte 0,2 μm
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096Thermische cycler systeem, inclusief 96-wels thermische cycler, stroomkabel, buisondersteuningsring
T4 DNA LigasePromegaM1801Verbindt twee DNA-strengen met samenhangende of stompe uiteinden
Tris-Borate-EDTA bufferSigma-AldrichT4415BioReagent, geschikt voor elektroforese, 10× concentraat
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1120
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up SystemPromegaA9285
XL10-Gold Ultracompetent CellsAgilent200317XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0,1 mL. Bevat het kanamycine-resistentiegen op de F' episome, voor extreem veeleisende klonering in chlooramfenicol-resistente vectoren. Efficiëntie: > 5 x 10 9 transformanten/µg pUC18 DNA.
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243(2020).
  3. Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
  4. Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266(2016).
  5. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052(2017).
  6. Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
  7. Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
  8. Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
  9. Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
  10. Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
  11. Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
  12. Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
  13. Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
  14. Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
  15. Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
  16. Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
  17. Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
  18. Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
  19. Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
  20. Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
  21. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732(2019).
  22. Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666(2015).
  23. García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746(2021).
  24. Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
  25. De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  26. Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771(2015).
  27. Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
  28. Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
  29. Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
  30. Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
  31. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
  32. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).
  33. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  34. Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
  35. Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
  36. Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16(2021).
  37. Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
  38. Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Leishmania stammeneGFP expressieflowcytometrietransfectie van parasietenrecombinante parasietenpolymerasekettingreactieplasmidelisatiedrugscreening assaysklonering van promastigotenagarosegelzuivering

Gerelateerde artikelen