Methodenartikel

Inzicht in de impact van gematigde bacteriofagen op hun lysogenen door middel van transcriptomics

3.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64945

⸱

5 januari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol maakt het mogelijk om de impact van profagen op hun gastheren te onthullen. Bacterieculturen worden gesynchroniseerd met behulp van omstandigheden die de lysogene toestand het beste ondersteunen, waardoor spontane inductie wordt beperkt. RT-qPCR maakt ondubbelzinnig onderscheid tussen profaagbeperkte genen en genen die zijn losgekoppeld van faagcontrole en genen die tot expressie worden gebracht tijdens de lytische replicatiecyclus.

Samenvatting

Gematigde fagen worden als profagen geïntegreerd aangetroffen in de meeste bacteriële genomen. Sommige profagen zijn cryptisch en gefixeerd in het bacteriële chromosoom, maar andere zijn actief en kunnen spontaan of door blootstelling aan inducerende factoren in een replicatieve vorm worden geactiveerd. Profagen worden vaak geassocieerd met het vermogen om toxineproductie of andere virulentie-geassocieerde eigenschappen aan hun gastheercel te verlenen. Recentere studies hebben aangetoond dat ze een veel grotere rol kunnen spelen bij het veranderen van de fysiologie van hun gastheren. De hier beschreven techniek heeft ons in staat gesteld om te onderzoeken hoe profagen de genexpressie beïnvloeden in de opportunistische bacterie Pseudomonas aeruginosa.

In dit werk werd de groei van de wild-type P. aeruginosa stam PAO1 vergeleken met die van isogene lysogenen die verschillende combinaties van profagen van de Liverpool Epidemic Strain (LES) LESB58 dragen. In een lysogeenkweek zal een deel van de bacteriële cellen de lytische bacteriofaagreplicatie (spontane inductie) ondersteunen met een hoog niveau van expressie per cel van late faaggenen, zoals die geassocieerd zijn met de assemblage van faagdeeltjes, waardoor de genexpressie op laag niveau wordt gemaskeerd die geassocieerd is met lysogeenbeperkte genexpressie. De impact van spontane inductie kan dus de genexpressie van profaagen in een lysogene populatie verdoezelen.

Groeiprofileringsexperimenten werden gebruikt om spontane inductie te identificeren, die minimaal was tijdens de vroege exponentiële groeifase. Deze studie rapporteert hoe monsterculturen kunnen worden bereid tijdens de vroege exponentiële groeifase en hoe adequate controles kunnen worden opgezet ondanks lage celaantallen. Deze protocollen zorgen voor een betrouwbare en reproduceerbare vergelijking van wildtype en lysogene bacteriën onder verschillende omstandigheden, waardoor de transcriptomische profilering van profaggenomen wordt verbeterd en wordt geholpen bij de identificatie van voorheen niet-herkende profagefuncties.

Inleiding

Onlangs hebben faagtherapie voor de aanpak van antimicrobiële resistentie1 en CRISPR-Cas-gebaseerde genbewerking2 hernieuwde belangstelling gewekt voor bacteriofaagonderzoek. Nogmaals, de vooruitgang in de biotechnologie heeft het mogelijk gemaakt om dieper onderzoek te doen naar de interacties tussen bacteriën en fagen3. Het therapeutisch gebruik van fagen ("faagtherapie") wordt echter belemmerd door bezorgdheid over fagen die fungeren als mobiele genetische elementen met het vermogen om virulentie- en resistentiegenen horizontaal over te dragen4. De uitgestrektheid van "donkere materie"5 (genen met onbekende functies) is zowel verontrustend als aanlokkelijk. Donkere materie wordt beschouwd als een hiaat in ons begrip van faagbiologie en een grotendeels onaangeboorde bron voor moleculaire hulpmiddelen en potentiële nieuwe therapieën6. De ontwikkeling van high-throughput sequencing-technieken, samen met verbeterde genannotatie 7,8,9 en nieuwe peptide-vouwalgoritmen10, verbetert de detectie, beschrijving en functionele voorspelling van faaggenen. De wetenschap is echter nog ver verwijderd van het valideren van de genfuncties van de meeste fagen in cultuur of in de echte wereld.

RNA-sequencing (RNA-Seq) kan genexpressie tijdens faaginfectie globaal in kaart brengen en heeft het begrip van zowel de faag- als de bacteriële elementen die betrokken zijn bij lytische en lysogene cycli aanzienlijk verbeterd11,12. Tijdens lysogene processen worden gematigde faaggenomen geïntegreerd in bacterieel DNA om profagen te worden13. Globale experimenten met genexpressieprofilering kunnen worden gebruikt om profaag-beperkte genen te identificeren die gecodeerd zijn op gematigde faaggenomen, maar alleen tot expressie komen tijdens de lysogene toestand11. Dergelijke genen coderen niet voor structurele faageiwitten en zijn niet betrokken bij faaginfectieprocessen. RNA-Seq kan worden gebruikt om die genen te identificeren die meer kans hebben om de biologie van de bacteriële gastheer te beïnvloeden, hetzij door een functiewinst te induceren, hetzij door de bestaande bacteriële genen te reguleren, waardoor de bacteriën zich vaak kunnen aanpassen aan veranderende omgevingen. Daarom zou het vermogen van profagen om te fungeren als microbiële poppenmeesters, die een reeks bacteriële functies beheersen, kunnen worden bestudeerd.

Er zijn twee belangrijke barrières voor de effectieve analyse van profaag-beperkte genexpressie. Ten eerste is de beschikbaarheid van gevoelige hosts een belangrijk punt. Per definitie zijn profagen al opgenomen in hun specifieke gastheergenoom, dus het is een uitdaging om een vatbare wild-type gastheer te vinden om de globale genexpressie te vergelijken in de aan- en afwezigheid van het profag. Dit kan worden bereikt door de novo infectie van een andere vatbare gastheer of door de deletie van de profag uit het oorspronkelijke wildtype-isolaat, zonder de rest van het gastheergenoom te verstoren. De tweede barrière ligt in de heterogene aard van lysogene populaties. Sommige profagen worden door mutatie of recombinatie afgebroken om "cryptisch" te worden, wat betekent dat ze op een specifieke locatie van het bacteriële genoom zijn gefixeerd. Andere profagen zijn echter "actief" en kunnen spontaan of na blootstelling aan inducerende factoren in een replicatieve, lytische cyclus worden geïnduceerd. In veel lysogene culturen betekent de snelheid van spontane inductie dat een deel van de bacteriële cellen altijd lytische faagreplicatie ondergaat14,15,16. Een hoog niveau van expressie van late faaggenen in deze populaties maskeert de genexpressie op laag niveau geassocieerd met lysogeenbeperkte genexpressie11,17. Het percentage lysogenen dat spontane profage-inductie ondergaat, kan variëren met de groeitoestand, groeiomstandigheden of andere triggers. Daarom, om de effecten van profagen op het lysogeen te bestuderen, moeten spontane profage-inductiegebeurtenissen zoveel mogelijk worden geminimaliseerd door de groeiomstandigheden te optimaliseren om de lysogene toestand te bevorderen.

Deze studie rapporteert het voorbereidende werk dat is gedaan om de invloed te onderzoeken van een reeks samenwonende profagen van de Liverpool Epidemic Strain (LES) van Pseudomonas aeruginosa. Actieve profagen werden geïnduceerd en geïsoleerd uit LES en gebruikt om de gastheerstam van het model P. aeruginosa, PAO116,18,19, te infecteren. Het hele genoom van de wildtype P. aeruginosa-stam, PAO1, en zijn lysogeen, PAO1Φ2, werd gesequenced (op een diepte van 30x dekking) om de identiteit van de wildtypestam te verzekeren en om te bevestigen dat het lysogeen was. De LES is in verband gebracht met verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij patiënten met cystische fibrose, en LES-fagen 19 zijn gesuggereerd om de aanpassing aan de cystische fibrose-longomgeving te helpen16,19,20. Ondanks sterk bewijs dat deze profagen de biologie van hun gastheer beïnvloeden20,21, moeten de meeste van hun genfuncties nog worden gekarakteriseerd en worden de specifieke interactiemechanismen slecht begrepen. Een transcriptomics-benadering kan empirisch de functies van het profagegenen blootleggen in een gecontroleerde gastheerachtergrond. Aangezien spontane inductie de expressieprofielen kan beïnvloeden, wordt in dit artikel beschreven hoe de groeiomstandigheden kunnen worden geoptimaliseerd om de lysogene toestand te bevorderen. Een dergelijke synchronisatie van culturen kan worden gevalideerd door real-time PCR om de expressieniveaus te kwantificeren van belangrijke genetische markers die geassocieerd zijn met cruciale stadia van LES-faagreplicatie in PAO1. Dezelfde benadering is eerder gebruikt om de profaag-beperkte functies van Shiga-toxigene fagen te identificeren die de beweeglijkheid, zuurresistentie en antimicrobiële resistentie beïnvloeden in Escherichia coli11,17,21,22.

Protocol

1. Maak een selecteerbare indicatorhost (Figuur 1)

OPMERKING: Faagcultuurlysaten kunnen besmettende cellen van de oorspronkelijke bacteriële gastheer bevatten. Het hebben van een antibioticaresistente indicatorstam maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen de indicatorstam en de oorspronkelijke bacteriële gastheer van het profag. Het gebruik van een selecteerbare indicatorstam maakt het mogelijk om de infectieuze faagdeeltjes nauwkeurig te tellen zonder dat centrifugatie- of filtratiestappen nodig zijn om de faag uit de lysogeencellen te verwijderen na de faagamplificatiestappen. De selecteerbare indicatorgastheerstam vermindert ook de tijd en het aantal stappen voor faagtelling, zodat meerdere condities tegelijkertijd kunnen worden uitgeprobeerd.

  1. Identificeer een geschikte indicatorgastheerstam die vatbaar is voor lytische en lysogene infectie door de gematigde faag van belang. De P. aeruginosa labstam PAO118,20 werd gebruikt en is gevoelig voor de drie LES-fagen (LESΦ2, LESΦ3 en LESΦ4).
  2. Kies een geschikt selectiemiddel (hier werd rifampicine gebruikt) en voer een bouillonverdunningstest uit om de minimale remmende concentratie (MIC) voor de indicatorgastheer te bepalen (16 μg·ml−1 is de MIC voor PAO1)23,24.
  3. Stel de indicatorgastheerculturen achtereenvolgens bloot aan toenemende concentraties van het selectieve middel in lysogene bouillon (LB), beginnend onder de MIC (in dit geval 5 μg·mL−1), gedurende 18-24 uur, met schudden, en bij 37 °C.
  4. Breng de cultuur die met de hoogste concentratie groeit in een verhouding van 1:100 (entmateriaal tot medium) over in tweevoudig verhoogde concentraties van het selectieve agens (telkens 18-24 uur) totdat de MIC voldoende is verhoogd. PAO1 werd een rifampicine-resistente stam (PAO1-RifR) bij 300 μg·mL−1 rifampicine.

2. Temporele directe opsomming van spontane inductie (figuur 2)

  1. Zet 's nachts starterculturen op van zowel het lysogeen (bijv. P. aeruginosa PAO1-lysogeen dat LES-fagen herbergt) als de indicatorgastheer (PAO1-RifR) door een enkele kolonie te inoculeren in 5 ml LB, en incubeer bij 37 °C met schudden bij 180 tpm (18-24 uur).
  2. Creëer verse lysogene en indicatorgastheerculturen door de nachtculturen te inoculeren in 100 ml LB in een verhouding van 1:100, en incubeer bij 37 °C met schudden (180 rpm).
    1. Bewaak de lysogeengroei door de OD600 en de haalbare telling te meten met behulp van de Miles Misra-techniek25. Om dit te doen, verzamelt u elk uur een monster van 1 ml van elke lysogeencultuur vanaf het punt van inoculatie gedurende 8 uur.
    2. Verdun het monster onmiddellijk na de winning serieel door 100 μl van het monster toe te voegen aan 900 μl van het respectieve medium. Draai goed op de maximale snelheid, gooi de punt bij elke verdunning weg en ga door met de verdunningsreeks van 10−1 tot 10−9.
    3. Breng 10 μl van de benodigde verdunningen in drievoud aan op een LB-agarplaat, laat drogen en incubeer gedurende 18-24 uur bij 37 °C.
    4. Om het aantal levensvatbare bacteriële cellen te berekenen, zoek je een verdunning met gemakkelijk telbare kolonies. Tel het aantal kolonies op elke plek en gebruik vervolgens de volgende formule:
      figure-protocol-1
      OPMERKING: Naarmate de lysogecultuur groeit, zullen actieve faagdeeltjes worden geproduceerd door spontane inductie. De productie van infectiefagen betekent dat het transcriptoom van de lysogene populatie nu besmet is met lytische replicatiecyclus-geassocieerde genexpressie van het lytische faagreplicatiesignaal en de bijbehorende gastheercelrespons. Het is dus belangrijk om het groeistadium te identificeren waarin het aandeel lysogene cellen tot vrije infectieuze faagdeeltjes het hoogst is om zoveel mogelijk achtergrondtranscriptieruis (gegenereerd door het lytische faagtranscriptoom) in de dataset te beperken.
  3. Om de infectieuze faagdeeltjes in elk temporeel monster te inventariseren, inoculeert u 5 ml steriele 0,4% bacteriologische agar in LB (bovenste agar) met 100 μL mid-exponentiële fase-indicatorgastheer (OD600: 0,4-0,5; in dit geval PAO1-RifR) in aanwezigheid van een geschikt selectiemiddel (in dit geval 50 μg·ml−1 rifampicine, aangezien de MIC van de PAO1-gastheer slechts 16 μg·ml−1 bedraagt; zie materiaaltabel, rij 8 en rij 9)
    1. Breng 10 μl van dezelfde seriële verdunning (zie stap 2.2.2) aan op de geënte bovenste agarlaag en laat drogen voordat u gedurende 18-24 uur bij 37 °C incubeert.
    2. Om de infectieuze faagdeeltjes te berekenen, zoek je een verdunning met gemakkelijk telbare plaques. Tel het aantal plaquettes op elke plek.
      figure-protocol-2
    3. Zoek de tijd/conditie waarvoor de spontane inductie per CFU (kolonievormende eenheid) minimaal is voor de verdere experimentele stappen.

3. Bereiding van niet-geïnduceerde en geïnduceerde lysogeenculturen voor RNA-extractie (figuur 3)

  1. Zet een nieuwe nachtcultuur op door een enkele kolonie van het lysogeen te inoculeren in 5 ml LB en incubeer bij 37 °C met schudden (180 rpm) gedurende 18-24 uur.
  2. Subcultuur: de nachtcultuur in 80 ml LB in een verhouding van 1:100 in acht kolven van 250 ml.
  3. Label de eerste kolf als "niet-geïnduceerd" en de andere als "geïnduceerd", samen met de tijdstippen waarop elk monster moet worden geoogst (d.w.z. "geïnduceerde t = 0", "geïnduceerde t = 10 min", "geïnduceerde t = 20 min", enz.; Figuur 3).
  4. Voeg na 90 minuten incubatie, wanneer de OD600 tussen 0,1-0,2 ligt, of op het moment van minimale spontane inductie (zie de bespreking), 4 μL 1% ijsazijn (v/v) toe aan de niet-geïnduceerde kolf (figuur 3).
    OPMERKING: Aangezien het inducerende middel in dit werk werd gemaakt met 1% ijsazijn als oplosmiddel, werd dezelfde hoeveelheid oplosmiddel alleen toegevoegd als controlestap. Alternatieve controles kunnen worden overwogen, afhankelijk van de bereiding van verschillende inductoren.
  5. Voeg de kweek van 80 ml uit de niet-geïnduceerde kolf toe aan 720 ml steriele LB en voeg onmiddellijk de stopoplossing toe (ijskoud 5% [v/v] fenol, pH 4,3, 95 % [v/v] ethanol) met een volume van 20% van het kweekvolume (160 ml), en incubeer op ijs gedurende minimaal 30 minuten en niet langer dan 2 uur om de RNA-transcripten te stabiliseren12, 26,27. Dit is het niet-geïnduceerde monster.
  6. Induceer de resterende culturen in zeven kolven van 250 ml (figuur 3) met de MIC van een geschikt inducerend middel (in dit geval 25 mg·mL−1 norfloxacine, bereid in 1% ijsazijn [m/v], gebruikt in een eindconcentratie van 1 μg·mL−1), meng goed en incubeer bij 37 °C en met schudden bij 180 tpm gedurende 1 uur.
    OPMERKING: Deze stap dwingt de lysogeencultuur in een meer gecoördineerde staat van lytische replicatie. De meeste cellen in de kweek zullen beginnen met de lytische productie van infectieuze faagdeeltjes.
  7. Laat de cellen herstellen door 80 ml kweek uit de geïnduceerde kolf toe te voegen aan 720 ml steriele LB, waardoor het inducerende middel effectief wordt verdund. Oogst de bacteriecellen uit elke kolf om de 10 minuten van tijd 0 tot 1 uur door een stopoplossing toe te voegen, zoals vermeld in stap 3.5.
    OPMERKING: De stopoplossing stabiliseert het RNA gedurende maximaal 2 uur. Om de stabiliteit van het monster te verbeteren, voert u echter alle volgende stappen uit bij 4 °C.
  8. Oogst zo spoedig mogelijk door centrifugatie bij 10.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C, met een maximum van 2 uur na de behandeling om afbraak van RNA te voorkomen.
  9. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de bacteriepellets voorzichtig in de resterende vloeistof met behulp van een verstelbare automatische pipet voordat u elk monster overbrengt naar een microfugebuis van 1.5 ml.
  10. Centrifugeer de microfugebuisjes op hoge snelheid (13.000 x g) in een microfuge bij 4 °C gedurende 1 minuut en gooi het resterende supernatant weg.
  11. Vries de pellets snel in door elke verzegelde microfuge-buis in vloeibare stikstof te dompelen. Dit zal de efficiënte lysis van de cellen voor RNA-extractie bevorderen.
  12. Voeg TRIzol (1 ml) toe aan elke bevroren pellet en homogeniseer de suspensie door middel van pipetteren (niet vortex). Bewaren bij −80 °C tot gereedheid om RNA-extractie uit te voeren voor alle monsters.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd.
  13. Herhaal stap 3.1–3.13 met drie biologische replicaten.

4. Isolatie van RNA uit niet-geïnduceerde en geïnduceerde lysogeenculturen

KRITIEK: Al deze stappen moeten worden uitgevoerd in een RNase-vrije omgeving28. De werkbanken moeten worden afgeveegd met 10% NaClO of gepatenteerde RNase-inactivators. Het laboratoriummateriaal moet worden behandeld met RNase-remmers zoals DEPC-behandeling, en bij alle reacties moet nucleasevrij water worden gebruikt.

  1. Ontdooi de ingevroren met TRIzol behandelde pellets uit stap 3.12 op ijs en voeg 400 μL chloroform van moleculair-biologische kwaliteit toe.
  2. Schud de flacons goed door inversie gedurende 10 s om de lysis van alle cellen te voltooien ( niet vortex). Incubeer vervolgens 2-5 minuten bij kamertemperatuur (21 °C).
  3. Scheid de waterige laag van het TRIzol/chloroform-mengsel door centrifugeren met behulp van een gekoelde microfuge op tafel bij 4 °C en 13.000 x g gedurende 15 min.
  4. Vang de waterige fase (~ 500 μL, bovenste laag) op met behulp van een pipet van 1.000 μL en zorg ervoor dat de interfase of organische fase (onderste laag) niet wordt verstoord. Breng over naar een nieuwe microfuge-buis van 1,5 ml.
  5. Voeg 450 μl isopropanol van moleculair-biologische kwaliteit toe aan de afgescheiden waterfase, meng goed door inversie ( niet vortex) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (21 °C).
  6. Recupereer het RNA door centrifugatie met behulp van een gekoelde centrifuge bij 4 °C en 13.000 x g gedurende 30 min.
  7. Gooi het supernatans weg zonder de RNA-pellet te verstoren en was de pellet tweemaal met 800 μL 70 % ethanol bereid met nucleasevrij water (niet op en neer pipetteren). Zorg voor de stabiliteit van de RNA-pellet door de centrifugatiestap na elke wasbeurt 5 minuten te herhalen.
  8. Gooi de ethanol weg en laat de pellet aan de lucht drogen.
    NOTITIE: Zuig de ethanol rond de pellet voorzichtig op met behulp van een microtip van 10 μL en droog de pellet door de buis om te keren op schoon vloeipapier. De RNA-pellet moet kleurloos worden en de randen moeten gegolfd en zichtbaar lijken. Als u te weinig droogt, kan er ethanol achterblijven die van invloed kan zijn op stroomafwaartse processen, en als u de pellet te veel droogt, kan de resuspensie worden bemoeilijkt.
  9. Resuspendeer het RNA in nucleasevrij water (50 μL) door te incuberen bij 65 °C op een thermoshaker met intermitterend mengen (elke 30 s) gedurende een totaal van 3-5 minuten.
    KRITIEK: De 2'- OH-groep van RNA is in staat om de autosplitsing van RNA-strengen te katalyseren bij een hoge temperatuur boven 65 °C en een hoge pH. Temperaturen onder de 65 °C vertragen de resuspensie van het resterende DNA, waardoor de hoeveelheid DNA die in een later stadium met DNase I-vertering moet worden verteerd, wordt beperkt. Daarom is het van cruciaal belang om de temperatuur op 65 °C te houden om de beste monsters te verkrijgen.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd en de monsters kunnen worden opgeslagen bij -80 °C.

5. Verwijdering van contaminerend DNA uit het RNA door DNase-behandeling

  1. Om besmettend DNA uit het totale RNA te verwijderen vóór de eerste-streng cDNA-synthese, voegt u een volume van 0,1 volume 10x DNase-buffer en 1 μL DNase-enzym toe aan 10 μg totaal RNA. Meng de tube voorzichtig en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  2. Resuspendeer het DNase-inactiveringsreagens en voeg minimaal 2 μL of 10% volume van het totale reactievolume toe. Meng goed en incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (21 °C) tijdens de redispersie van het DNase-inactiveringsreagens.
  3. Pelleteer de DNase-reagentia door centrifugatie met behulp van een tafelmodel microcentrifuge bij 10.000 × g gedurende 1,5 min.
  4. Breng het supernatans met het RNA over in een nieuwe buis zonder de pellet te verstoren.
    OPMERKING: Controleer de kwaliteit van RNA met behulp van een UV-spectrofotometer op een schaal van 1 μL en een nucleïnezuurcomputeranalysator op basis van microfluïdisch volgens de instructies van de fabrikant; gezuiverd totaal RNA kan worden opgeslagen bij -80 °C. Voor qRT-PCR zou RNA direct op dit punt kunnen worden gebruikt. Voor gevoeligere stroomafwaartse processen, zoals RNA-sequencing, die een strikte monsterkwaliteit vereisen, moet een A260/230-verhouding van ε 2,0 worden bereikt om verder te gaan.
  5. Vul het volume van de DNA-vrije RNA-oplossing aan tot 500 μL met nucleasevrij water.
  6. Voeg 50 μl nucleasevrij 3 M natriumacetaat (pH 5,3) en 495 μl isopropanol toe. Meng goed en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Deze stap zal het RNA neerslaan.
  7. Recupereer het RNA door centrifugatie bij 13.000 x g en 4 °C gedurende 30 min.
  8. Was de RNA-pellet driemaal met ijskoude 70% ethanol door de monsters na elke wasbeurt gedurende 5 minuten te centrifugeren bij 13.000 x g en 4 °C om de zouten volledig te verwijderen.
  9. Controleer de kwaliteit van het RNA met behulp van een UV-spectrofotometer op schaal van 1 μL en een nucleïnezuurcomputeranalysator op basis van microfluïdisch volgens de instructies van de fabrikant; gezuiverd totaal RNA kan worden opgeslagen bij -80 °C.
    OPMERKING: De gids29 werd gebruikt om de RNA-kwaliteitsnormen te bereiken. Als de verhouding A260/230 <2,0 is, herhaalt u stap 5,5–5,9.

6. Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van het DNase-vrije RNA

  1. Valideer de efficiëntie van de DNase-behandeling voor elk monster door een kwantitatieve PCR uit te voeren met behulp van 16S rRNA-primers (tabel 2) met 1 μg totaal RNA, en bevestig dat er geen amplificatieproduct wordt geproduceerd.
    OPMERKING: De ideale primers om gDNA-contaminatie te beoordelen, zijn primers die zijn ontworpen om te gloeien op intron-exon-juncties of regulerende regio's in prokaryoten of op transcriptioneel inactieve plaatsen30,31.
  2. Bepaal het RNA-integriteitsnummer (RIN) met behulp van een op microfluïdisch gebaseerde nucleïnezuurcomputeranalysator volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Monsters die een RIN-≥ 9 vertonen, moeten worden gebruikt voor de synthese van de eerste streng. Monsters die een RIN < 9 vertonen, moeten worden weggegooid en de isolatiestappen (1.1-5.4) moeten worden herhaald.
  3. Kwantificeer de totale RNA-concentratie met behulp van de HS RNA-testkit en een fluorimeter volgens de instructies van de fabrikant.

7. Eerstestrengs cDNA-synthese

  1. Bereid voor elk monster een RNA-primermengsel door 1 μg totaal RNA te mengen met 1 μL willekeurige hexameren (50 ng·μL−1) en 1 μL 10 mM dNTP-mengsel. Pas vervolgens het totale volume aan tot 10 μL met nucleasevrij water.
  2. Incubeer de reactie gedurende 5 minuten bij 65 °C en plaats ze 1 minuut op ijs.
  3. Maak voor elk monster een cDNA-synthesemix door 2 μL 10x RT-buffer toe te voegen; 4 μL van 25 mM MgCl2; 2 μL 0,1 M DTT; 1 μL RNaseremmer (40 U·μL−1); en 1 μL van het reverse transcriptiereagens (200 U·μL−1) in de aangegeven volgorde.
  4. Voeg de cDNA-synthesemix toe aan het RNA/primermengsel. Meng voorzichtig en centrifugeer de monsters kort om de componenten op de bodem van de buis te verzamelen.
  5. Bereid het mengsel voor door de monsters gedurende 10 minuten bij 25 °C te incuberen, gevolgd door 50 minuten bij 50 °C. Beëindig de reacties door gedurende 5 minuten bij 85 °C te incuberen en op ijs af te koelen.
  6. Voeg 1 μL RNase H toe aan elke buis en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C om het RNA uit de DNA:RNA-hybride te verwijderen.
  7. Verdun ten slotte de cDNA-synthesereactie tot een totaal volume van 80 μL en bewaar deze bij -80 °C tot verder gebruik.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd.

8. Standaardcurve en kwantitatieve (q)-PCR om de expressieniveaus te bepalen van markergenen die verschillende stadia van faagreplicatie aangeven

  1. Identificeer een set doelgenen die kunnen fungeren als markers voor elk stadium van replicatie van de faag van belang. In ons geval waren deze zoals beschreven in tabel 2.
  2. Amplificeer elk van de doelgenen uit het genomische DNA van de sjabloon met behulp van relevante primers en met behulp van PCR met de volgende amplificatievoorwaarden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 2 min; denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s; gloeien op de optimale gloeitemperatuur afhankelijk van de primers (hier werd 58 °C gebruikt) gedurende 30 s; verlenging bij 72°C gedurende 1 min; en de laatste verlenging bij 72 °C gedurende 5 min.
  3. Zuiver elk amplicon met behulp van een PCR-zuiveringskit en kloon ze in een TA-kloonvector volgens de instructies van de fabrikant. Controleer de volgorde van elk gekloond product door middel van Sanger-sequencing.
    OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd.
  4. Bereken het aantal kopieën voor individuele plasmiden met behulp van de volgende vergelijking20:
    figure-protocol-3
  5. Maak een standaardsjabloon voor elk markergen door het plasmide-DNA serieel te verdunnen van 109 kopieën/μL tot 10 2 kopieën/μL in moleculair nucleasevrije steriele H2 O.
  6. Voer kwantitatieve PCR uit volgens de instructies van de fabrikant voor het geprefereerde qPCR-systeem met 1 μL cDNA (uit stap 7.7) voor elk monster in drievoud, samen met de respectieve plasmidestandaarden in drievoud; voer de PCR uit in een plaat met 96 putjes voor elk doelwit.
  7. Zet het aantal log-DNA-kopieën (x-as) af tegen de cyclusdrempel (y-as, Ct) en gebruik een geschikt platform zoals Excel of R om een lineaire regressieberekening uit te voeren om de bepalingscoëfficiënt (R2) en een lineaire vergelijking weer te geven.
    OPMERKING: De bepalingscoëfficiënt moet hoger zijn dan 0,98.
  8. Schat het aantal kopieën voor elk doel met behulp van de lineaire vergelijking (y = mx + b) afgeleid van de lineaire regressie (stap 8.7), waarbij y de geschatte Ct is; x is het log-DNA-kopienummer; m is de helling van de lijn, die de verandering in de Ct ten opzichte van het aantal DNA-kopieën definieert; en b is het snijpunt op de y-as dat de geschatte Ct vertegenwoordigt voor één DNA-kopie32.
  9. Bereken voor elk markergen de efficiëntie van de PCR-amplificatie (E) met behulp van de parameters van de lineaire regressie van de standaardcurve en de volgende vergelijking, waarbij m de helling is die is afgeleid van stap 8.7 en stap 8.8:
    figure-protocol-4
  10. Valideer alle primers in termen van hun procentuele efficiëntie met behulp van de volgende vergelijking:
    NOTITIE: Het rendement moet tussen de 90% en 110% liggen.
    figure-protocol-5
  11. Bereken het absolute kopiegetal van het DNA met behulp van de volgende formule:
    figure-protocol-6
    waarbij Ct (stap 8.8) de cyclusdrempel is, b het snijpunt (stap 8.8), m de helling (stap 8.8) en E de efficiëntie van PCR-amplificatie (stap 8.9).
    KRITIEK: Bij het vergelijken van de amplificatie van twee of meer doelen door q-PCR, moet de PCR-efficiëntie voor elk doelwit worden berekend om het absolute aantal DNA-kopieën te vergelijken.
  12. In deze studie werden de 16S rRNA-, proC- en rpoD-genen gebruikt als de algemene interne controles, en gyrB werd gebruikt als inductiecontrole33,34,35.
    OPMERKING: Bij het kiezen van interne controles uit de RNA-seq-gegevens, is het het beste om interne controles te selecteren die niet veranderen in expressieniveaus voor de geteste omstandigheden. Een zorgvuldige afweging van passende controles is altijd belangrijk voor een zinvolle interpretatie van de resultaten.

Resultaten

In dit werk werd de directe temporele telling van faagproductie van een PAO1 LESΦ2-lysogeencultuur gekweekt onder niet-inducerende omstandigheden gebruikt om de impact van spontane LESΦ2-inductie te bepalen. De faagdichtheid was op het laagste punt met een gemiddelde van ~2,61 x 106 plaquevormende eenheden (PFU)·ml−1 2 uur na subcultuur in vers medium tijdens de vroege exponentiële groeifase, wat suggereert dat lysogene de dominante toestand was. De LESΦ2-titer nam snel toe tot een gemiddelde van ~2,4 x 108 PFU·ml−1 binnen 4 uur en bereikte de hoogste dichtheid na 6 uur (gemiddelde van ~5,83 x 109 PFU·mL−1; Figuur 4).

Minimale spontane inductie werd waargenomen tijdens de vroege logfase van lysogeengroei (na 2 uur). De meetbare aanwezigheid van fagen in het kweekmedium was echter het resultaat van vele eerdere gebeurtenissen, waaronder de volgende: het verpakken van nucleïnezuren in eiwitkoppen, de assemblage van eiwitten in faagdeeltjes en de expressie van late faaggenen, faaggenen in het middenstadium en vroege regulerende faaggenen. Het was belangrijk om de geïnfecteerde cellen te vangen voorafgaand aan de expressie van de faag-geassocieerde replicatiegebeurtenissen; Daarom werd gekozen voor 90 min om de cultuur te laten groeien voorafgaand aan de inductie. Om het genexpressieprofiel van de PAO1 vast te leggen, werden LESΦ2-lysogene monsters van een cultuur vóór en na inductie geoogst gedurende een periode van 90 minuten, zoals vermeld in stap 3.4. Dit tijdstip van 90 minuten is ruim voordat hoge niveaus van spontane inductie van de residente profhage worden gedetecteerd door de plaquetest uit stap 2.3.2. Omdat de bacteriële celdichtheid laag was tijdens de vroege exponentiële groei, werden de kweekvolumes opgeschaald tot 800 ml om voldoende materiaal te garanderen voor de genexpressiestudies. De monsters werden verzameld uit de niet-geïnduceerde cultuur en geïnduceerde culturen om de 10 minuten, en RNA werd geëxtraheerd om het expressieprofiel van de belangrijkste markers voor lysogenie en lytische replicatie tijdens de bacteriegroei in kaart te brengen. Totaal RNA werd gezuiverd en gevalideerd voor de afwezigheid van genomisch DNA met behulp van qPCR-assays gericht op het 16S rRNA-gen (stap 6.1). De monsters die een RIN ≥ 9 bereikten, doorstonden de kwaliteitscontrole en werden omgezet in cDNA.

Het geannoteerde LESΦ2-genoom werd onderzocht om genen te identificeren die bekende spelers zijn in de lysogene en lytische replicatiecycli van gematigde fagen. Deze geïdentificeerde genen werden vervolgens gebruikt om de qRT-PCR te valideren voor de expressieprofilering van de lysogeencyclus-beperkte en lytische cyclus-geassocieerde genen van geïnduceerde en niet-geïnduceerde culturen. We kwantificeerden het absolute aantal DNA-kopieën en voerden een Wilcoxon-tekentest uit met behulp van R36 om de expressieniveaus in niet-geïnduceerde en geïnduceerde culturen te vergelijken (Figuur 5). Een duidelijke toename van de expressie van het cro-gen (een vroege marker van lytische replicatie) van ~2,31 x 109 kopieën in niet-geïnduceerde culturen tot ~3,02 x 1011 kopieën 30 minuten na inductie (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01) werd waargenomen. Evenzo vertoonden O-eiwitten en P-eiwitten, die markers in het middenstadium zijn van lytische replicatie (en waarvan wordt voorspeld dat ze betrokken zijn bij de replicatie van het faaggenoom), ook een significante opregulatie van ~ 1,74 x 108 tot ~ 1,25 x 10 10 kopieën (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01) en van ~ 6,05 x 102 tot ~ 5,68 x10 5 exemplaren (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01). Ten slotte werden de staart-geassocieerde structurele genen gebruikt als late markers van de lytische replicatiecyclus. Nogmaals, we zagen een significante toename van de expressie van ~2,31 x 106 kopieën in niet-geïnduceerde culturen tot ~4,38 x 108 kopieën 30 minuten na inductie (Wilcoxon signed-rank test: p < 0,01). De kwantitatieve RT-PCR-gegevens bevestigden dus dat de genexpressie van gevestigde markergenen voor lytische replicatie de verwachte trend volgde, waarbij de vroege, midden- en late markers meervoudige differentiële expressie vertoonden in de voorspelde volgorde (Figuur 5). Aangezien de expressie van de markers voor lytische replicatie 30 minuten na herstel werd opgereguleerd, wordt dit beschouwd als een geschikt representatief tijdstip voor het bestuderen van het transcriptomische landschap van actieve gematigde fagen en hun bacteriële gastheren tijdens de lytische cyclus.

We hebben enige expressie van lytische genen waargenomen in niet-geïnduceerde omstandigheden, wat bevestigt dat er altijd enige spontane inductie optreedt, zelfs in geoptimaliseerde culturen waarin de lysogeenaantallen worden weergegeven met de hoogste verhouding tussen CFU en vrijgekomen PFU in de vroege logfase. Dit betekent dat er altijd een zekere mate van "ruis" in de transcriptomics-gegevens zal zijn, wat het belang van zorgvuldig voorbereide controles, inclusief geïnduceerde en niet-geïnduceerde culturen, versterkt. De juiste keuze van de interne controlegenen om de vouwveranderingen in expressie te bepalen, is afhankelijk van het zorgvuldig onderzoeken van de transcriptomics-gegevens om genen te identificeren die op hetzelfde niveau tot expressie worden gebracht in zowel de niet-geïnduceerde als de geïnduceerde monsters. Onze voorlopige resultaten suggereren dat rpoD het meest betrouwbare controlegen was dat werd getest en de meest stabiele expressie had (~1,71 x 10, 5 kopieën vóór inductie en ~3,33 x 10,5 kopieën 30 minuten na inductie; Wilcoxon signed-rank test: p = 0,3594) vergeleken met de 16S rRNA- of proC-genen (Figuur 5). De variabiliteit van de expressie van de interne controles leidde tot het meten van de absolute aantallen transcripties. Toekomstig onderzoek van de transcriptomics-gegevens zal de keuze van geschikte interne controles voor verdere validatie ondersteunen.

Het cI-gen werd gebruikt in onze genprofileringsoefening, omdat het een algemeen erkende marker van lysogene is. Vergeleken met de markers voor lytische replicatie was de expressie van het cI-gen relatief stabiel (Figuur 5), maar het aantal kopieën van dit gen was geruststellend hoog in de niet-geïnduceerde culturen in vergelijking met die van de markers voor lytische replicatie. Deze gegevens zijn in overeenstemming met de lage PFU-aantallen in dezelfde monsters, wat bevestigt dat een hoge repressorexpressie geassocieerd was met lagere niveaus van faagproductie. De hier gerapporteerde gegevens tonen aan dat de expressie van het cI-transcript voor deze specifieke faag niet significant wordt gedownreguleerd na inductie, zoals te zien is in de Stx-fagen11,17. Repressoractiviteit wordt normaal gesproken gecontroleerd op zowel transcriptioneel als posttranslationeel niveau, dus het repressorgen kan worden getranscribeerd, maar het resulterende eiwit wordt onmiddellijk onderworpen aan autosplitsing. Verdere experimenten zijn nodig om transcriptionele en posttranslationele controles te valideren. Bovendien blijkt uit onze standaardcurve dat de minimale detectielimiet van qPCR ~102 kopieën is.

Samen valideren onze bevindingen van plaque- en qRT-PCR-assays onze strategie voor kweek- en RNA-monstervoorbereiding om een goed gecontroleerde input voor RNA-Seq-experimenten te genereren. De niet-geïnduceerde culturen in de vroeg-exponentiële fase vertoonden lage niveaus van spontane inductie en lytische genexpressie, wat de dominantie van lysogenie suggereert. Daarentegen vertoonden de culturen die 30 minuten na inductie werden geïsoleerd een significante toename van de expressie van markergenen die wijzen op de dominantie van lytische replicatie.

figure-results-1
Figuur 1: Het protocol voor het maken van de rifampicine-resistente indicatorgastheer (gemaakt met BioRender.com). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De experimentele opzet voor het opsommen van de PFU en CFU van een lysogeen uit hetzelfde monster. (Gemaakt met BioRender.com) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De experimentele opzet voor bemonstering geïnduceerde en niet-geïnduceerde culturen voor RNA-isolatie. (Gemaakt met BioRender.com) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Temporele opsomming van spontane inductie. Temporele opsomming van de spontane productie van LES-profagen met behulp van de PFU van het PAO1 Φ2-lysogeen met de gelijktijdige CFU, n = 8 (twee biologische en vier technische replicaten); De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. De donkerrode punten geven de CFU·mL−1 in LB aan; de donkerblauwe punten geven de PFU·mL−1 in LB aan. De spontane afgifte van de φ2-infectiefaag door de lysogenen bevindt zich op het laagst meetbare niveau 2 uur na inoculatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Absoluut aantal kopieën van de doelmerkergenen. Het absolute aantal kopieën van faagmarkergenen bevestigt de voorspelde expressiepatronen, afgeleid met behulp van RT-qPCR, van genen waarvan wordt verwacht dat ze een belangrijke rol spelen in lysogene en lytische cycli. De stippen vertegenwoordigen zowel drie biologische als drie technische replicaten (n = 9). (EEN) Het rode vak vertegenwoordigt de lysogene marker, cI; (B) groen staat voor de vroege lytische marker, cro; (C,D) blauw staat voor de midlytische markers, DNA-replicatiegenen; (E) magenta vertegenwoordigt de late lytische marker, staartstructurele genen; (F-H) grijs staat voor de gastheermarkers die werden gebruikt als interne controles, en (I) wit staat voor de DNA-gyrase B, die werd gebruikt als inductiecontrole. De ononderbroken horizontale lijnen geven de mediaan van de verdeling aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Primers ontworpen in deze studie. De sequenties van specifieke primers voor de markergenen en interne controles die in deze studie worden gebruikt, worden verstrekt, samen met hun bijbehorende NCBI-toetredings-ID's. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Efficiëntie van de primers die in dit onderzoek zijn gebruikt, berekend met behulp van de qPCR-standaardcurve. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

De creatie van een selecteerbare indicatorgastheer, die eerder werd gebruikt in plaque-assays om de spontane inductie van Stx-faag uit E. coli MC106137,38,39 nauwkeuriger te kwantificeren, is hier beschreven voor P. aeruginosa-faag LESΦ2. Deze interventie heeft als bijkomend voordeel dat de stappen en tijd voor de verwerking van het monster worden verminderd, waardoor de gelijktijdige beoordeling van spontane inductiesnelheden in meerdere kweekomstandigheden mogelijk wordt. Er bestaat een risico op het genereren van andere mutaties tijdens de creatie van rifampicine-resistente varianten40; In dit werk werd de geëvolueerde stam echter alleen gebruikt als indicatorgastheer voor de telling van plaques uit culturen van belang en werd deze niet opgenomen in de transcriptomische analyse. Zolang de selecteerbare indicatorstam even vatbaar blijft voor infectie door de faag van belang, is er geen bezorgdheid over andere verworven mutaties. Desalniettemin werden er geen verschillen in de polymorfismeprofielen van het restrictiefragment gedetecteerd door de pulsveldgelelektroforese (PFGE)-analyse van PAO1WT en PAO1RIF (gegevens niet getoond).

Bij het kiezen van gastheercellen is het zeldzaam om een indicatorstam te vinden die niet al profagen herbergt. PAO1 herbergt bijvoorbeeld de draadvormige profaage Pf4. De experimentele controles voor deze studie waren ontworpen om de genexpressie van specifieke fagen (in dit geval LES-profag 2) en de effecten die deze faag heeft op bacteriële genexpressie direct te kunnen onderzoeken. In de vergelijking van transcripties van PAO1 met de LES-propagage 2 en zonder de LES-propagage 2 (zowel lysogeen als niet-lysogeen dragen het endogene Pf4), die dienen als interne controles om de impact van Pf4 op de gastheer uit te sluiten. Bovendien is aangetoond dat Pf4 meestal geen lysis veroorzaakt in zijn gastheercel41 en daarom niet in staat is om de resultaten van deze experimenten te verstoren.

Het is algemeen bekend dat zorgvuldige kwaliteitscontrole cruciaal is bij de voorbereiding van monsters voor het produceren van zinvolle omics-gegevens42. Zoals eerder beschreven11, wordt de zorgvuldige karakterisering van profage-activiteit bij de bereiding van lysogeculturen voor dergelijke studies echter zelden uitgevoerd. Hier beschrijven we onze systematische protocollen voor het voorbereiden van een goed gecontroleerde en geoptimaliseerde set culturen voor transcriptomische studies om de interacties tussen bacteriën en gematigde fagen beter te onderzoeken. De synchroniciteit van de populatie werd gecontroleerd door de cultuur door ten minste vier verdubbelingen te brengen voordat deze werd behandeld met het inducerende antibioticum norfloxacine. Door de MIC van norfloxacine voor de stam in het onderzoek te bepalen, konden we ervoor zorgen dat de concentratie van het inducerende middel net boven de MIC lag voor de "inductie"-behandeling. De behandelde cellen werden vervolgens 1:10 verdund om de norfloxacineconcentratie na de behandeling van 1 uur onder de MIC te verlagen, zodat de cellen zich konden herstellen en het faagreplicatieproces konden voltooien, eindigend in de lysis van de cel en het vrijkomen van infectieuze faagnakomelingen. De cellen gaan pas na de inductiestimulus de lytische replicatiecyclus in als de concentratie norfloxacine tijdens de herstelperiode onder de MIC is gebracht. In dit geval betekent een stijging van meer dan 1 μg·ml−1 norfloxacine dat het geneesmiddel niet effectief kan worden verdund onder de MIC, aangezien de MIC voor norfloxacine voor PAO1 0,19 μg·mL−1 is. Het niveau van de verdunning van de inductor moet in evenwicht zijn met de behoefte aan lysogeenterugwinning en het behoud van de kweekdichtheid voor het oogsten van het RNA. De hier besproken gegevens tonen aan dat het mogelijk is om culturen te synchroniseren om monsters te maken waarin lysogenie domineert, waardoor de ruis van spontane inductie wordt verminderd en de detectie van echte lysogenie-gedreven veranderingen in genexpressie mogelijk wordt. Aangezien de lysogene toestand overheersend is in de vroeg-exponentiële groeifase wanneer de bacteriële celdichtheid laag is, raden we aan om de culturen op te schalen om voldoende RNA te oogsten voor latere genexpressiestudies zoals RNA-Seq.

Het gebruik van norfloxacine als inducerend middel om culturen in de lytische cyclus te dwingen is goed gerapporteerd43,44; Dit zal echter ook de expressie van andere bacteriële genen in het proces beïnvloeden45,46. Om dit te beperken, moeten RNA-bibliotheken van controle-wildtypeculturen die onder dezelfde inducerende en niet-inducerende omstandigheden worden gekweekt, worden opgenomen in RNA-Seq-experimenten. Het gebruik van interne controles en belangrijke markergenen om de stadia van faagreplicatie door qRT-PCR te valideren, is ook cruciaal voor nauwkeurige vergelijkingen. Kwantitatieve RT-PCR-profilering kan niet worden geïnterpreteerd door de absolute aantallen transcripten voor elk gen op verschillende tijdstippen te vergelijken; Het is de vorm van het profiel die telt. Ten eerste is slechts één klein gebied in het transcript voor een gen bemonsterd, dus of het een kortlevend of langlevend element is, is onbekend27. Zeker, RNA-Seq-mapping van transcripten laat zien dat de dichtheid van de mappinggegevens aanzienlijk varieert over de lengte van een gen. Ten tweede is het de vorm van het genexpressieprofiel dat moet worden geïnterpreteerd voor een markergen dat geassocieerd is met de lytische cyclus of de lysogene levensstijl of zelfs losgekoppeld is van de faagregulerende circuits11. Spontane inductie is een reëel probleem in lysogeenkweek en zal altijd resulteren in de expressie van lytische cyclus-geassocieerde genen. Profilering toont echter wel aan dat de genen die geassocieerd zijn met de lytische replicatiecyclus worden onderdrukt in hun expressie pre-inductie (ten minste twee logvouwen) en opwaarts gereguleerd na inductie.

De eerder uitgevoerde transcriptomische analyses van Stx-faaginteracties met E. coli ondersteunen een grondig begrip van de faaggenen die betrokken zijn bij het handhaven van lysogenie en het activeren van de lytische cyclus11,17. Momenteel zijn de LES-fagen van P. aeruginosa geannoteerd, maar hun belangrijkste genfuncties zijn minder goed begrepen. Transcriptomische studies zullen de herannotatie van de LES-profagen mogelijk maken en ons begrip van de genen die betrokken zijn bij de lysogene en lytische cyclus verbeteren. Het koppelen van gensequentie aan functie vormt een grote uitdaging in de studie van nieuwe profagen, wat verder benadrukt dat er meer studies nodig zijn om de faaggenfuncties te bevestigen voor de productie van betere annotatietools47. De bredere toepassing en aanpassing van de protocollen en extra kwaliteitscontrolemaatregelen die in dit videoartikel worden beschreven, kunnen helpen bij het onthullen van verschillende profagefuncties en zo bij het verbeteren van annotatiepijplijnen en het transformeren van ons begrip van faag- en bacteriële biologie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PAO16
LESB586
LES fagenGeïnduceerd en gezuiverd uit LESB58 met behulp van Norfloxacine.Deze studie
Lysogenie Broth (LB)Merck1.10285.500
LB AgarMerck1.10283.500
Agar AgarFisherA/1080/53
Top Agar0,4 g Agar Agar+2,5 g LB Broth in 100 mL water; autoclave en gebruik.-
RifampicineSigma (Stock: 50 mg/mL in Methanol- Goed mengen en gebruik 0,22µm filter om te steriliseren en bewaar het in -20°C tot gebruik)R3501
Glazuur AzijnzuurFisher 1% (v/v) in water10060000
NorfloxacineSigma (Stock: 25 mg/mL van 1% Glazuur Azijnzuur- Goed mengen en gebruik 0,22µm filter om te steriliseren en bewaar het in -20°C tot gebruik; Om bevriezing en ontdooien te voorkomen, bewaar als kleine aliquoten)N9890
Fenol verzadigd met citraat buffer pH 4,3SigmaP-4682
Ethanol van moleculaire biologie kwaliteitFisher16695992
TRIzolInvitrogen12044977
ChloroformFisher11398187
IsopropanolFisher17150576
Nuclease-vrij H2OInvitrogen10526945
10X TURBO DNaseAmbionAM1907
Qubit RNA HS, BR KitInvitrogenQ10210
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511
SuperScriptIII first strand synthese kitInvitrogen18080051
PCR ReagentiaBioline Mytaq Red 2XBIO-25043
qPCR ReagentiaSensifast SYBR Hi RoxBIO-92020
PCR zuiveringskitIsolate II PCR and Gel KitBIO-52060
TA klonering kitTA Cloning Kit, met pCR 2.1 Vector, zonder competente cellenK202040
StepOne Real Time PCR systeemThermo Fisher Scientific4376600

Referenties

  1. Lin, D. M., Koskella, B., Lin, H. C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance. World Journal of Gastrointestinal Pharmacology and Therapeutics. 8 (3), 162-173 (2017).
  2. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New tools for genetic manipulations from bacterial immunity systems. Annual Review of Microbiology. 69 (1), 209-228 (2015).
  3. Santos, S. B., Azeredo, J. Bacteriophage-based biotechnological applications. Viruses. 11 (8), 737(2019).
  4. Rodríguez-Rubio, L., Jofre, J., Muniesa, M. Is genetic mobilization considered when using bacteriophages in antimicrobial therapy. Antibiotics. 6 (4), 32(2017).
  5. Hatfull, G. F. Dark Matter of the biosphere: The amazing world of bacteriophage diversity. Journal of Virology. 89 (16), 8107-8110 (2015).
  6. Yukgehnaish, K., et al. PhageLeads: Rapid assessment of phage therapeutic suitability using an ensemble Machine Learning approach. Viruses. 14 (2), 342(2022).
  7. Seemann, T. Prokka: Rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 30 (14), 2068-2069 (2014).
  8. Arndt, D., et al. PHASTER: A better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Research. 44, W16-W21 (2016).
  9. Banerjee, S., et al. FINDER: An automated software package to annotate eukaryotic genes from RNA-Seq data and associated protein sequences. BMC Bioinformatics. 22 (1), 205(2021).
  10. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  11. Veses-Garcia, M., et al. Transcriptomic analysis of Shiga-toxigenic bacteriophage carriage reveals a profound regulatory effect on acid resistance in Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (23), 8118-8125 (2015).
  12. Owen, S. V., et al. A window into lysogeny: revealing temperate phage biology with transcriptomics. Microbial Genomics. 6 (2), e000330(2020).
  13. Davies, E. V., Winstanley, C., Fothergill, J. L., James, C. E. The role of temperate bacteriophages in bacterial infection. FEMS Microbiology Letters. 363 (5), 015(2016).
  14. Livny, J., Friedman, D. I. Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Molecular Microbiology. 51 (6), 1691-1704 (2004).
  15. Fogg, P. C. M., et al. Identification of multiple integration sites for Stx-phage Φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiology. 153 (12), 4098-4110 (2007).
  16. James, C. E., et al. Differential infection properties of three inducible prophages from an epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa. BMC Microbiology. 12, 216(2012).
  17. Riley, L. M., et al. Identification of genes expressed in cultures of E. coli lysogens carrying the Shiga toxin-encoding prophage Φ24B. BMC Microbiology. 12 (1), 42(2012).
  18. Stover, C. K., et al. Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen. Nature. 406 (6799), 959-964 (2000).
  19. Winstanley, C., et al. Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa. Genome Research. 19 (1), 12-23 (2009).
  20. Davies, E. V., et al. Temperate phages enhance pathogen fitness in chronic lung infection. The ISME Journal. 10 (10), 2553-2555 (2016).
  21. Allison, H. E. Stx-phages: drivers and mediators of the evolution of STEC and STEC-like pathogens. Future Microbiology. 2 (2), 165-174 (2007).
  22. Allison, H. E., et al. Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-encoding bacteriophages and characterization of novel double lysogens. Infection and Immunity. 71 (6), 3409-3418 (2003).
  23. Mori, N., et al. A peptide based on homologous sequences of the β-barrel assembly machinery component BamD potentiates antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (9), 2173-2181 (2012).
  24. Chojnacki, M., et al. A novel, broad-spectrum antimicrobial combination for the treatment of Pseudomonas aeruginosa corneal infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (10), e00777(2019).
  25. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. Epidemiology & Infection. 38 (6), 732-749 (1938).
  26. Srikumar, S., et al. RNA-seq brings new insights to the intra-macrophage transcriptome of Salmonella Typhimurium. PLoS Pathogens. 11 (11), e1005262(2015).
  27. Kröger, C., et al. The transcriptional landscape and small RNAs of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), E1277-E1286 (2012).
  28. Green, M. R., Sambrook, J. How to win the battle with RNase. Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2019).
  29. Koetsier, G. A practical guide to analyzing nucleic acid concentration and purity with microvolume spectrophotometers. New England BioLabs Inc. , Available from: https://www.neb.com/-/media/nebus/files/application-notes/technote_mvs_analysis_of_nucleic_acid_concentration_and_purity.pdf?rev=c24cea043416420d84fb6bf7b554dbbb (2019).
  30. Saunders, N. A., Lee, M. A. Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2013).
  31. Bustin, S. A. A-Z of Quantitative PCR. , International University Line. La Jolla, CA. (2004).
  32. Ruijter, J. M., et al. Efficiency correction is required for accurate quantitative PCR analysis and reporting. Clinical Chemistry. 67 (6), 829-842 (2021).
  33. Fothergill, J. L., Neill, D. R., Loman, N., Winstanley, C., Kadioglu, A. Pseudomonas aeruginosa adaptation in the nasopharyngeal reservoir leads to migration and persistence in the lungs. Nature Communications. 5 (1), 4780(2014).
  34. Huang, J., et al. Temperature-dependent expression of phzM and its regulatory genes lasI and ptsP in rhizosphere isolate Pseudomonas sp. strain M18. Applied and Environmental Microbiology. 75 (20), 6568-6580 (2009).
  35. Savli, H., et al. Expression stability of six housekeeping genes: a proposal for resistance gene quantification studies of Pseudomonas aeruginosa by real-time quantitative RT-PCR. Journal of Medical Microbiology. 52 (5), 403-408 (2003).
  36. Kassambara, A. rstatix: Pipe-Friendly Framework for Basic Statistical Tests. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=rstatix (2022).
  37. McDonald, J. E., et al. High-throughput method for rapid induction of prophages from lysogens and its application in the study of Shiga toxin-encoding Escherichia coli strains. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2360-2365 (2010).
  38. Smith, D. L., et al. Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 189 (20), 7223-7233 (2007).
  39. James, C. E., et al. Lytic and lysogenic infection of diverse Escherichia coli and Shigella strains with a verocytotoxigenic bacteriophage. Applied and Environmental Microbiology. 67 (9), 4335-4337 (2001).
  40. Rees, V. E., et al. Characterization of hypermutator Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis in Australia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (4), e02538(2019).
  41. Li, Y., et al. Excisionase in Pf filamentous prophage controls lysis-lysogeny decision-making in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology. 111 (2), 495-513 (2019).
  42. Van Kampen, A. H. C., Moerland, P. D. Taking bioinformatics to systems medicine. Systems Medicine. 1386, 17-41 (2016).
  43. Matsushiro, A., Sato, K., Miyamoto, H., Yamamura, T., Honda, T. Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. Journal of Bacteriology. 181 (7), 2257-2260 (1999).
  44. James, C. E., et al. Lytic activity by temperate phages of Pseudomonas aeruginosa in long-term cystic fibrosis chronic lung infections. The ISME Journal. 9 (6), 1391-1398 (2015).
  45. Shaw, K. J., et al. Comparison of the changes in global gene expression of Escherichia coli induced by four bactericidal agents. Microbial Physiology. 5 (2), 105-122 (2003).
  46. Long, H., et al. Antibiotic treatment enhances the genome-wide mutation rate of target cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), E2498-E2505 (2016).
  47. González-Tortuero, E., et al. VIGA: A sensitive, precise and automatic de novo VIral Genome Annotator. bioRxiv. , (2018).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ProfaaggenexpressieLysogeen TranscriptoomonderzoekSpontane InductiePseudomonas AeruginosaLytische ReplicatieKwantitatieve PCRRNA integriteitGroeiprofileringTherapeutische Doelwitten

Gerelateerde artikelen