"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Summary

Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.

Abstract

Gedurende het afgelopen decennium heeft proteomics op basis van massaspectrometrie een grondige karakterisering van biologische systemen mogelijk gemaakt voor een breed scala aan toepassingen. Het celoppervlakte-proteoom ("surfaceome") bij menselijke ziekten is van groot belang, aangezien plasmamembraaneiwitten de primaire doelwitten zijn van de meeste klinisch goedgekeurde therapieën, evenals een belangrijk kenmerk om zieke cellen diagnostisch te onderscheiden van gezonde weefsels. Echter, de gefocuste karakterisering van membraan- en oppervlakte-eiwitten van de cel is uitdagend gebleven, voornamelijk vanwege de complexiteit van cellulaire lysaten, die eiwitten van belang maskeren door andere eiwitten met een hoge abundantie. Om deze technische barrière te overwinnen en het celoppervlakte-proteoom van verschillende celtypen nauwkeurig te definiëren met behulp van massaspectrometrie-proteomics, is het noodzakelijk om het cellysaat te verrijken voor celoppervlakte-eiwitten vóór analyse op de massaspectrometer. Dit artikel presenteert een gedetailleerde workflow voor het labelen van celoppervlakte-eiwitten van kankercellen, het verrijken van deze eiwitten uit het cellysaat, en daaropvolgende monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse.

Introduction

Eiwitten dienen als fundamentele eenheden waardoor het merendeel van cellulaire functies wordt uitgevoerd. Het karakteriseren van de structuur en functie van relevante eiwitten is een essentiële stap om biologische processen te begrijpen. In het afgelopen decennium hebben vorderingen in massaspectrometrie technologie, analysesoftware en databases de nauwkeurige detectie en meting van eiwitten op een proteoom-breed niveau mogelijk gemaakt¹. Massaspectrometrie-gebaseerde proteomiek kan worden gebruikt in een diverse reeks toepassingen, van basiswetenschappelijke analyse van biochemische paden, tot identificatie van nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen in een translationeel kader, tot diagnose en monitoring van ziekten in de kliniek². Bij het screenen op nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen is de karakterisering van het celoppervlak proteoom bijzonder belangrijk, met meer dan 65% van de momenteel goedgekeurde humane geneesmiddelen die zich richten op celoppervlakte-eiwitten³. Het gebied van kankerimmunotherapie is ook volledig afhankelijk van kanker-specifieke celoppervlakte-antigenen om tumorcellen te targeten en specifiek te elimineren⁴. Massaspectrometrie-gebaseerde proteomiek kan dus dienen als een veelbelovend hulpmiddel om nieuwe celoppervlakte-eiwitten te identificeren voor therapeutische interventies.

Er zijn echter verschillende beperkingen bij het gebruik van conventionele proteomics-methoden om tumorcellen te onderzoeken op nieuwe celoppervlakte-eiwitdoelwitten. Een belangrijke zorg is dat oppervlakte-eiwitten een zeer klein deel uitmaken van de totale eiwitmoleculen in een cel. Daarom worden fragmenten van deze eiwitten gemaskeerd door een hoge abundantie van intracellulaire eiwitten bij het uitvoeren van massaspectrometrie-analyse van het gehele cellysaat⁵. Deze beperking maakt het uitdagend om het celoppervlakte-proteoom nauwkeurig te karakteriseren met een traditionele proteomics-workflow. Om deze uitdaging aan te pakken, is het noodzakelijk om manieren te ontwikkelen om celoppervlakte-eiwitten uit het gehele cellysaat te verrijken, vóór analyse op de massaspectrometer. Een van deze methoden omvat de oxidatie en biotin-labeling van geglycoseerde celoppervlakte-eiwitten in intacte cellen, en daaropvolgende verrijking van deze biotinylerende eiwitten uit het lysaat met een neutravidine pulldown, een proces dat "celoppervlakte-vangst" wordt genoemd⁶. Aangezien ~85% van de zoogdierceloppervlakte-eiwitten glycosyleerd worden geacht⁷, dient dit als een effectieve methode om het celoppervlakte-proteoom uit het hele cellysaat te verrijken. Dit artikel beschrijft een complete workflow, beginnend met gekweekte cellen, van celoppervlakte-biotin-labeling, en daaropvolgende monstervoorbereiding voor massaspectrometrie-analyse (Figuur 1). Over verschillende replica's biedt deze methode een robuuste dekking van het celoppervlakte-proteoom van een bepaald monster. Het gebruik van deze methode om het celoppervlakte-proteoom van zowel tumor- als gezonde cellen te karakteriseren, kan de ontdekking van nieuwe celoppervlakte-antigenen faciliteren om potentiële immunotherapeutische doelwitten te identificeren⁸.

Protocol

OPMERKING: AMO1 plasmacytoomcellen werden gebruikt voor dit celoppervlak proteoomexperiment. Hetzelfde protocol kan ook worden gebruikt voor andere celtypen, inclusief een breed scala aan suspensie- en adherente cellijnen⁹, evenals verschillende soorten primaire monsters¹⁰. De celnummers (startmateriaal voor het experiment) moeten echter doorgaans worden geoptimaliseerd voor gelijkwaardige proteoomdekking. Voor details met betrekking tot materialen en apparatuur, zie de Tabel van Materialen. Voor details met betrekking tot buffers en reagentiëoplossingen en hun samenstelling, zie Tabel 1.

1. Celoppervlak labelen met biotin

1. Tel de gekweekte cellen en pellet ongeveer 3,5 x 10⁷ levende cellen door centrifugatie (5 min bij 500 x g, 24 °C).
   OPMERKING: De AMO1 plasmacytoomcellen werden elke 3 dagen voorafgaand aan het oogsten gepasseerd met vers medium.
2. Aspereer het supernatant en resuspendeer de pellet door 1 mL koude (4 °C) Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS) (geen calcium, geen magnesium) toe te voegen en voorzichtig op en neer te pipetteren.
3. Pellet de cellen opnieuw (zoals in stap 1.1) en herhaal de wasstap (stap 1.2) nog een keer (twee wasbeurten in totaal).
4. Na de tweede wasbeurt, pellet de cellen (zoals in stap 1.1) en resuspendeer ze in 990 μL koude D-PBS door voorzichtig te pipetteren.
5. Bereid vooraf een voorraadoplossing van 160 mM natriummetaperiodaat (NaIO₄) voor. Splits in 50 μL aliquoten en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg 10 μL van 160 mM natriummetaperiodaat-oplossing toe aan de celsuspensie in stap 1.4, meng grondig en incubeer gedurende 20 min bij 4 °C op een end-to-end rotor.
6. Nadat de incubatie voltooid is, pellet de cellen (zoals in stap 1.1), decanteer het supernatant en resuspendeer in 1 mL koude D-PBS. Herhaal deze wasstap twee keer (drie wasbeurten in totaal). Na de derde wasbeurt, resuspendeer de cellen in 989 μL D-PBS.
7. Bereid vooraf een voorraadoplossing van 100 mM biocytinehydrazide voor. Splits in 50 μL aliquoten, en bewaar bij -20 °C gedurende maximaal 6 maanden. Voeg 1 μL aniline en 10 μL van 100 mM biocytinehydrazide toe aan de celsuspensie in stap 1.6, meng grondig en incubeer gedurende 60 min bij 4 °C op een end-to-end rotor.
8. Nadat de incubatie voltooid is, pellet de cellen (zoals in stap 1.1), decanteer het supernatant en resuspendeer in 1 mL koude D-PBS. Herhaal deze wasstap twee keer (drie wasbeurten in totaal).
9. Na de derde wasbeurt, aspireer het supernatant voorzichtig met een pipet, en snap-vries de celpellet door de buis in vloeibare N₂ te plaatsen. Plaats de bevroren pellet bij -80 °C, totdat klaar om verder te gaan met lysis en pulldown.

2. Cellyse en biotin pulldown

1. Ontdooi de bevroren celpellet op ijs.
2. Voeg 500 μL van 2x lysisbuffer toe aan de pellet, meng grondig en vortex gedurende 30 s.
   OPMERKING: Krachtig pipetteren en vortexen kunnen vereist zijn om de pellet volledig te lyseren. Sommige onoplosbare deeltjes (dwz DNA) zijn acceptabel, aangezien deze worden verwijderd in de daaropvolgende sonicatiestap.
3. Soniceer het cellysaat op ijs (drie bursts, 20 s elk, 60% duty cycle).
4. Centrifugeer het lysaat om eventuele resterende deeltjes te pelleten (10 min bij 17.200 x g bij 4 °C).
5. Terwijl het lysaat wordt gecentrifugeerd, voeg 100 μL neutravidine agarose resin bead toe aan een filtratiekolom. Bevestig de kolom aan een vacuüm manifold, pas een lichte vacuüm toe en was de korrels door 3 mL wasbuffer 1 erdoor te laten stromen.
6. Verwijder de filtratiekolom van de vacuüm manifold, doe de bodem af en voeg het opgehelderde cellysaat toe aan de kolom met de korrels. Doe de bovenkant van de kolom af en incubeer het lysaat met de korrels op een end-to-end rotor gedurende 120 min bij 4 °C.
   OPMERKING: Wanneer de bovenkant van de kolom wordt afgedekt, moet de bodem stevig op zijn plaats worden gehouden, anders kan deze losraken en kan het cellysaat lekken tijdens de incubatie.
7. Bereid wasbuffers 1, 2 en 3 voor (ongeveer 5 mL van elke wasbuffer per monster, zie Tabel 1) en plaats ze in een 42 °C waterbad
8. Nadat het lysaat de incubatie heeft voltooid, plaats de filtratiekolom terug op de vacuüm manifold, pas een lichte vacuüm toe en was de korrels door 5 mL wasbuffer 1 erdoor te laten stromen.
   OPMERKING: Meer dan 5 mL van de wasbuffers kan worden gebruikt voor het wassen; extra wassen kan achtergrond, niet-specifieke binding op de korrels verminderen.
9. Herhaal de wasstap met 5 mL wasbuffer 2.
10. Herhaal de wasstap met 5 mL wasbuffer 3.
11. Zodra de laatste wasbuffer volledig door de korrels is gegaan, verwijder de kolom uit de manifold. Voeg 100 μL van de "Lyse" oplossing toe aan de korrels en breng ze over naar een 1,7 mL low-protein-binding microcentrifugebuis met een pipet. Spin de buis kort om de korrels te laten bezinken en verwijder 50 μL van de oplossing zonder de bezonken korrels te verstoren.
    OPMERKING: De reagentia in deze stap en alle volgende stappen gebruiken een commercieel

Results

Voor dit experiment hebben we het celoppervlak-proteoom van een tumorcellijn gekenmerkt door N-geglycoseerde membraaneiwitten van intacte cellen te labelen met biotin en deze gelabelde eiwitten uit het volledige cellysaat te verrijken met een neutravidine-pulldown (Figuur 1). Verder hebben we proteoomanalyse uitgevoerd met behulp van LC-MS/MS om verrijkte celoppervlakte-eiwitten te karakteriseren. In tegenstelling tot de analyse van het volledige celproteoom was het doel hier om all...

Discussion

Proteomics op basis van massaspectrometrie is een krachtig hulpmiddel dat een onbevooroordeelde karakterisering van duizenden onbekende eiwitten op een voorheen onmogelijke schaal mogelijk heeft gemaakt. Deze aanpak stelt ons in staat om eiwitten te identificeren en te kwantificeren, evenals een reeks inzichten te verzamelen over de structurele en signaalcapaciteiten van cellen en weefsels, door de verscheidenheid aan eiwitten in een specifiek monster te karakteriseren. Verder dan globale eiwitprofilering in een monster,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kits
96X iST Sample Preparation Kit	PreOmics	P.O.00027	Proteomics sample preparation kit. Bevat reagentia voor reductie, alkylering en digestie. Bevat ook ontzoutingskolommen en reagentia.
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo	23275	Peptide kwantificeringskit. Bevat peptide standaarden en componenten van werkreagentia.
Reagentia
Acetonitrile	Fisher	A955-1
Ammonium bicarbonate	Millipore Sigma	09830-1KG
Biocytin hydrazide	Biotium	90060
D-PBS (zonder calcium- en magnesiumzouten)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003-225B01
Formic Acid	Honeywell	94318
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Single-Use Cocktail	Thermo	1861280
High Capacity Neutravidin Agarose Resin	Thermo	29204
Phosphate Buffered Saline	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001-22J01
RIPA Lysis Buffer, 10x	Millipore Sigma	20-188
Sodium chloride	Fisher	BP358-212
Sodium metaperiodate	Alfa Aesar	13798
Trypan Blue Stain (0,4%)	Gibco	15250-061
Ultrapure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575-038
Urea (Proteomics Grade)	VWR	M123-1KG
Apparatuur
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad	1450102
PrismR Microcentrifuge	Labnet International	C2500-R-230V
Sonicator	VWR	Branson Sonifier 240
Vacuum Manifold	Promega	Promega Vac-Man
Shaking Heatblock	Eppendorf	Eppendorf Thermomixer C
End-to-End rotator	Labnet	Revolver Adjustable Rotator
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC en UHPLC
Q Exactive Plus Hybrid Quadrapole Orbitrap Mass Spectrometer	Thermo	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Microplate Reader	Biotek	Biotek Synergy 2
Vacuum Concentrator	Labconco	7810010
Benodigdheden
1,5 mL Protein LoBind Tubes	Eppendorf	22431081
1,7 mL Microcentrifuge Tubes
Filtratiekolomnen	Bio-Rad	7326008
Spin Columns	Thermo	69725