Niet van toepassing
Methodenartikel
14 juli 2023
Niet van toepassing
Het skeletspierweefsel, dat ongeveer 40% van het menselijk lichaam bedekt, is een belangrijk orgaan dat essentiële functies ondersteunt, van beweging tot ademhaling en metabolisme. Belangrijk is dat het een unieke capaciteit heeft om zichzelf na verwonding te herstellen en met deze regeneratieve capaciteit volledige functionele en structurele herstel van ernstige schade in minder dan een maand mogelijk maakt. Verschillende celtypen zijn betrokken bij deze opmerkelijke herstelcapaciteit, waarbij de spierstamcellen een centrale rol spelen.
Spiersonderzoekers over de hele wereld hebben verschillende tests ontwikkeld om skeletspier op functioneel, moleculair en cellulair niveau te analyseren. Elke techniek heeft zijn eigen sterktes, met in vivo testen op diermodellen die de optie vertegenwoordigen met de meeste relevantie voor mensen en de complexiteit van levende organismen. De in vitro en ex vivo tegenhangers winnen terrein, aangezien onderzoeksgroepen over de hele wereld ernaar streven dierproeven te minimaliseren in het licht van het internationaal erkende Replacement-Reduction-Refinement (3R) principe. Deze Methode-collectie had tot doel in vivo en ex vivo modellen te bieden voor moleculaire, cellulaire en functionele spierstudies in verschillende soorten.
Montandon et al.1 beschrijven technieken om snel spierregeneratie-fenotypes te karakteriseren in zebravissen van controle- en mutante genotypen. Eerst worden embryo's gegenotypeerd met materiaal dat van geanesthetiseerde dieren wordt geschud. Dit is een opwindende vooruitzichten omdat de meeste protocollen die de genotypering van genetisch gemodificeerde embryo's betreft, een gelijktijdige opoffering van het embryo vereisen. Vervolgens wordt regeneratie geïnduceerd door een specifiek gebied van de musculatuur van de zebravislarve te steken. Dankzij de optische eigenschappen van de sarcomeer kan de integriteit van de beschadigde spier worden beoordeeld met behulp van beeldvorming na verwonding. Dit protocol is van groot belang voor wetenschappers die spierregeneratie bestuderen, aangezien het een snelle, potentieel hoogdoorvoerige methode is om verschillende mutanten te onderzoeken op regeneratieve defecten.
Hüttner et al.2 en Pegoli et al.3 presenteren een methode die cellulaire en moleculaire studies van spierstamcellen mogelijk maakt, de celpopulatie die centraal staat in spierregeneratie. De methode is zeer interessant voor onderzoekers die zich richten op studies over vroege activering en cel-niche-interacties. De methode van cultuur van enkele myofibers maakt het mogelijk om spierstamcellen tot 96 uur te kweken en te bestuderen terwijl ze nog steeds geassocieerd zijn met de spiervezels en signalen ontvangen van deze nabije, endogene, niche. De techniek is bijzonder uitdagend om te vestigen vanwege de vele delicate stappen die Hüttner et al.2 zorgvuldig uitleggen (bijv. zachte spierdissectie en dissociatie). Verder gaan de auteurs in detail over siRNA-targeting voor functionele analyses van factoren die het gedrag van stamcellen kunnen beïnvloeden, en ze benadrukken het belang van het vergelijken van siRNA-getransfecteerde met controle-getransfecteerde cellen van dezelfde muis en spier. Tegelijkertijd beschrijven Pegoli et al.3 hoe deze methode kan worden aangepast om spierstamcellen te bestuderen in de context van Emery-Dreifuss spierdystrofie en vroeg postnataal leven, waarbij de nadruk wordt gelegd op de uitdagingen die gepaard gaan met spierfragiliteit in deze context. Om de efficiëntie van het protocol te verhogen, begeleiden ze de lezers met afbeeldingen van vezels met goede en slechte overleving en benadrukken ze de noodzaak om de verteringstijd "empirisch te valideren".
Zaidan et al.4 beschrijven een ex vivo kweeksysteem van het skeletspierweefsel dat de productie van quiescent-achtige reservecellen begunstigt, terwijl het ook een aantal andere celtypen behoudt, die beide uitdagingen onder alternatieve kweeksystemen presenteren. Deze methode kan dus nuttig zijn voor onderzoekers die zich richten op kiemruststudies of niche-stamcelinteracties, inclusief onder omstandigheden die moleculaire paden wijzigen met behulp van geneesmiddelen, siRNA's of vectoren. Het protocol omvat snelle dissectie van de achterbeenspieren, gevolgd door enzymatische vertering en filtratie. Daarna worden cellen in kweek geplaatst, met het verschijnen van reservecellen binnen een week. Het protocol maakt grootschalige amplificatie van deze reservecellen mogelijk, met de mogelijkheid van live-celbeeldvorming met behulp van genetisch getagde muizen, zoals Pax7nGFP.
Park et al.5 tonen aan hoe nitraat en nitriet kunnen worden gemeten in skeletspier, een van de belangrijkste opslagorganen voor nitraat. De beschreven methode is van bijzonder belang voor onderzoekers die de fysiologie van oefeningen en met stikstofoxide gerelateerde neuromusculaire of metabole stoornissen bestuderen. Hoewel er significante technologische ontwikkelingen zijn om nitraat- en nitrietmetingen te vergemakkelijken, zijn er verschillende parameters die het eindresultaat kunnen beïnvloeden en die door de auteurs zorgvuldig worden beschreven en vergeleken (bijv. homogenisatiemethode, biopsiegrootte, spiertype).
Hessel et al.6 beschrijven in grote detail een procedure voor het nemen van biopsieën uit de Tibialis anterior spier van menselijke patiënten om vezels van voldoende lengte te verkrijgen voor mechanische experimenten. De auteurs benadrukken dat patiënten met recente schade aan de spier moeten worden uitgesloten. Zodra de geïnformeerde toestemming van in aanmerking komende patiënten is verkregen, wordt echografie gebruikt om de beste plaats in de spier voor biopsiecollectie te beoordelen. Na het bespreken van de ideale injectieroute, voert het team de biopsie uit met behulp van een gespecialiseerde naald. Ten slotte worden postoperatieve patiëntenzorg en weefselverwerkingsmethoden
De auteurs hebben niets te onthullen.
Geen externe financiering ondersteunde dit werk.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen