$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle meercellige organismen op aarde, inclusief dieren en planten, zijn ongeveer 1,7 miljard jaar geleden geëvolueerd uit eencellige eukaryoten1. In tegenstelling tot primitieve prokaryoten hebben eukaryotische cellen een membraangebonden kern en veel membraangesloten organellen in hun cytoplasma, waaronder mitochondriën, het Golgi-apparaat, het endoplasmatisch reticulum (ER), lysosomen en vesikeltjes. Deze organellen vormen compartimenten waarin gespecialiseerde biologische functies en zeer efficiënte metabolische activiteiten gelokaliseerd zijn. Vanwege de beperkte resolutie van lichtmicroscopie bevatten de meeste intracellulaire organellen functionele structuren die onder de lichtdiffractiegrens vallen, waardoor hun visualisatie een uitdaging is2. Innovatieve microscopische en biologische labelingtechnieken beginnen de hoge-resolutie visualisatie van ultrafijne architecten en de in vivo dynamische eigenschappen van organellen mogelijk te maken. Deze verzameling brengt recente methoden samen die met succes verschillende intracellulaire organellen in verschillende soorten hebben gelabeld en geïmaged, en daarmee onze kennis van de spatie-temporele regulatie van de biologie van organellen hebben verbeterd.
In de afgelopen decennia hebben de ontwikkeling van fluorescerende sensoren en het labelen van eiwitten in levende cellen onze kennis van de dynamica van intracellulaire netwerken, signaaltransductie en cel-cel-interacties sterk vergemakkelijkt. Door gebruik te maken van geavanceerde anorganische synthetische methoden zijn fluorescerende halfgeleidernanokristallen met nano-schaal, ook bekend als kwantumdots of QD, uitgevonden als een nieuwe klasse van optische reporters. Normaal gesproken zijn QD-deeltjes binnen 2-10 nm groot en hebben ze een hoge fotosensitiviteit, stabiliteit en lage cytotoxiciteit voor cellen. QD-deeltjes zijn opgekomen als alternatieven voor organische kleurstoffen en fluorescerende eiwitten voor het beeldvormen van intracellulaire processen met hoge resolutie. In het protocol van Aishwarya et al. beschrijven de auteurs QD-gemedieerde immunolabeling gevolgd door beeldvorming met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)3. Door antilichaam-gerichte QD-labeling en beeldvorming onder TEM met superresolutie uit te voeren, slaagden de auteurs erin de lokalisatie van Sigmar1 op meerdere celorganellen in volwassen muizenhartcellen te visualiseren en de verrijking ervan op de lysosomen en de mitochondriale membranen te benadrukken. Naast het benadrukken van de hoge resolutie en hoge gevoeligheid van QD-TEM, vermelden de auteurs ook verschillende nadelen van de methoden. Zo vernietigt het osmiumtetraoxide dat wordt gebruikt bij QD-gemedieerde immunolabeling onomkeerbaar de eigenschappen van het specimen, en het optimaliseren van de fixatie- en antigeenontmaskeringsstappen is een sleutel maar uitdagende element om hoge kwaliteitsbeelden te garanderen.
Naast QD zijn er ook veel andere verschillende kleurstoffen met succes toegepast voor het labelen van organellen in levende cellen. Die methoden hebben de live-beeldvorming van het transformatie- of translocatieproces van celorganellen in vivo vergemakkelijkt. Soms worden meerdere organelspecifieke kleurstoffen gebruikt om verschillende soorten organellen tegelijkertijd te visualiseren. In het protocol van Liu, Li et al.4, geven de auteurs een gedetailleerd protocol voor het live kleuren en beeldvormen van zowel mitochondriën als lysosomen in muis embryonale fibroblast (MEF) cellen door twee verschillende kleurstoffen te gebruiken: MitoTracker Green en LysoTracker Red4. In deze studie vertoonden beide kleurstoffen een hoge fluorescerende gevoeligheid en stabiliteit specifiek voor mitochondriën en lysosomen, respectievelijk. Bovendien observeerden en registreerden de auteurs het kritische in vivo cellulaire proces van mitofagie geïnduceerd door carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) in MEF-cellen met behulp van het protocol. In de discussie vermelden de auteurs dat het protocol kan worden toegepast met verschillende cellijnen of cellen uit weefsels door de kleurstoffconcentratie en kleuringstijd te optimaliseren.
Door gebruik te maken van reporterconstructies bestaande uit organelspecifieke eiwitten gefuseerd met fluorescerende tags, kan men in vivo organeldynamiek en expressiepatronen observeren zonder immunolabeling. In het protocol van Liu, Zhu et al.5, geven de auteurs een gedetailleerd protocol voor het beeldvormen van de meeste soorten subcellulaire organellen in de levende knoppende gist, Saccharomyces cerevisiae5. Voor beginners die met knoppende gist werken, is dit protocol nuttig om te leren hoe ze de subcellulaire lokalisatie van eiwitten kunnen identificeren en organellen van belang kunnen volgen met behulp van time-lapse beeldvorming. Een beperking van het protocol is dat de meeste constructies die in het protocol worden gebruikt, niet kunnen worden gebruikt voor het labelen van organellen in andere soorten. Voor verschillende soorten eukaryotische cellen zouden de organelspecifieke patronen van fluorescerende eiwitten nog steeds moeten worden gevalideerd door antilichaamimmunokleuring.
Een antilichaamopnametest werd voor het eerst ontwikkeld voor de specifieke live-labeling van endosomaal Notch/Delta-signalering in de sensorische orgaanvoorlopers van het Drosophila notum6. Vanwege de dosisgevoelige aard van Notch/Delta-signalering is het niet geschikt om een reporterconstructie binnen cellen te expresseren voor het visualiseren van Notch/Delta-signalering in vivo, omdat een extra kopie van het reporter-gefuseerde gen de normale signalering zou onderbreken en, op zijn beurt, het cellot. In het protocol van Zhao en Guo7, passen de auteurs de antilichaamopnametest toe voor het beeldvormen van Notch/Delta endosomaal verkeer in de radiale glia-progenitorcellen van de zich ontwikkelende zebravisbrein7. In het protocol, na het micro-injecteren van anti-DeltaD-Atto647N geconjugeerd antilichaam precies in de 24 hpf (uren na bevruchting) embryonale achterhersenventrikel, wordt het hele proces van endosomaal verkeer geregistreerd met behulp van het geïnternaliseerde anti-