Methodenartikel

Dissectie van muizen van het hele centrale en perifere zenuwstelsel

DOI:

10.3791/64974

⸱

24 februari 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Functional Genomics, Université de Sherbrooke, 2Department of Dermatology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 3Department of Pathology, Université de Sherbrooke, 4Centre de Recherche du Centre Hospitalier de Universitaire de Sherbrooke, Université de Sherbrooke, 5Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 6UTSW Comprehensive Neurofibromatosis Clinic, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 7Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om de dissectie van het centrale en perifere zenuwstelsel van muizen te voltooien. De ontlede weefsels worden verder geanalyseerd in downstream-toepassingen, zoals het maken van grove foto's of histologie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diermodellen vertegenwoordigen het werkpaard van het neurowetenschappelijke veld. Desondanks is er vandaag de dag nog steeds geen stapsgewijs protocol om een compleet zenuwstelsel van knaagdieren te ontleden, en er is ook geen compleet schema dat dit weergeeft dat vrij beschikbaar is. Er zijn alleen methoden beschikbaar om de hersenen, het ruggenmerg, een specifiek ganglion van de dorsale wortel en de heupzenuw (afzonderlijk) te oogsten. Hier geven we gedetailleerde foto's en een schema van het centrale en perifere zenuwstelsel van de muizen. Wat nog belangrijker is, we schetsen een robuuste procedure om de dissectie uit te voeren. De pre-dissectiestap van 30 minuten maakt het mogelijk om het intacte zenuwstelsel in de wervel te isoleren met spieren die vrij zijn van ingewanden en huid. Een dissectie van 2-4 uur volgt onder een microdissectiemicroscoop om het ruggenmerg en de thoracale zenuwen bloot te leggen en uiteindelijk het hele centrale en perifere zenuwstelsel van het karkas af te pellen. Dit protocol is een belangrijke stap voorwaarts in het bestuderen van de anatomie en pathofysiologie van het zenuwstelsel wereldwijd. De ontlede dorsale wortelganglions van een neurofibromatose type I muizenmodel kunnen bijvoorbeeld verder worden verwerkt voor histologie om veranderingen in tumorprogressie te ontrafelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het algemene doel van deze methode is om het centrale en perifere zenuwstelsel van een muis in één stuk te isoleren. Er is momenteel geen protocol om het hele zenuwstelsel van een knaagdier te ontleden om het op mondiaal niveau te bestuderen. Neurowetenschappers gebruiken meestal de heupzenuw als surrogaat voor elke perifere zenuw1, en de L3 tot L5 ganglions2 als surrogaat voor alle ganglions. Met behulp van deze methoden is het onmogelijk om te concluderen of de resultaten specifiek zijn voor de specifieke zenuw/ganglion. Aangezien bekend is dat ten minste sommige zenuwpathologieën niet alle zenuwen en ganglions in gelijke mate aantasten 3,4,5, moet men een techniek ontwikkelen om de isolatie van het volledige zenuwstelsel van knaagdieren mogelijk te maken om het globaal te bestuderen.

In de loop der jaren hebben we een methode ontwikkeld en verfijnd om het volledige centrale en perifere zenuwstelsel van muizen te ontleden. De eerste stap is in wezen een grove dissectie van de muizen ter voorbereiding op de microdissectiestappen onder de dissectiemicroscoop. In stap 2 tot en met 4 worden het ruggenmerg en de thoracale zenuwen blootgelegd, worden de hersenen ontleed en worden het hele ruggenmerg en de perifere zenuwen van het karkas afgepeld.

Deze methode is krachtig in combinatie met beeldvorming of histologie om elke macroscopische of microscopische verandering te documenteren 6,7,8,9. Neurowetenschappers die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van wereldwijde veranderingen of het uitvoeren van niet-hypothesegestuurde experimenten, zouden deze methode moeten gebruiken om het wereldwijde zenuwstelsel te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De protocollen die in deze studie zijn gebruikt, zijn goedgekeurd door het Comité Institutionnel des Animaux de l'Université de Sherbrooke, een gecertificeerde instelling van de Canadian Council on Animal Care.

1. Voorbereiding op microdissectie (pre-dissectie)

  1. Voer anesthesie uit met 5% isofluraan, gevolgd door euthanasie met 2% isofluraan en 10 psi CO2 totdat er geen vitale functies meer zijn.
    OPMERKING: Voer geen cervicale dislocatie uit, omdat dit het ruggenmerg en de cervicale ganglions beschadigt.
  2. Plaats de geëuthanaseerde muis met de voorkant naar boven (vooraanzicht) op een dissectiekussen en besproei de vacht met 70% ethanol.
  3. Zet vervolgens de bovenste en onderste ledematen vast met behulp van vier pinnen met een kleine diameter om de muis in positie te houden tijdens de dissectie.
  4. Knip met een chirurgische schaar de huid open van de onderbuik tot aan de keel.
  5. Trek de huid eraf om de inwendige organen bloot te leggen en gebruik extra pinnen om de huid aan elke kant te behouden terwijl de buikholte bloot komt te liggen.
  6. Snijd de thoracale kooi open om het hart en de longen bloot te leggen.
  7. Gebruik een standaard anatomische tang om de slokdarm en luchtpijp vast te pakken en snijd net boven de tang.
  8. Begin vervolgens alle inwendige organen af te pellen in een craniale tot caudale benadering. Om dit te doen, snijdt u het middenrif langs de wervelkolom om alle inwendige organen in één stuk te verwijderen.
  9. Maak de muis los en spoel extra muizenbloed uit de buikholte in een gootsteen.
  10. Plaats de muis met de voorkant naar beneden (achteraanzicht). Speld de bovenste en onderste ledematen vast en gebruik vier pinnen om de muis in positie te houden tijdens de dissectie.
  11. Verwijder met een chirurgische schaar de huid van het hoofd tot de achterpoten.
  12. Leg de linker heupzenuw (onderste ledemaat) bloot.
    1. Snijd de spieren open in het onderste deel van het linker onderste ledemaat.
    2. Lokaliseer en leg de heupzenuw bloot door de spier eromheen te verwijderen.
    3. Snijd de heupzenuw voorzichtig door bij de vertakking van de surale, tibiale en peroneale zenuw en spaar de bloedvaten.
    4. Ga door met het isoleren van de heupzenuw met behulp van een standaard anatomische tang en een extra fijne Bonn-schaar, totdat deze evenwijdig aan de wervelkolom wordt, waardoor er een vrije zenuw van ongeveer 2 cm overblijft.
    5. Steek de chirurgische schaar evenwijdig aan het ruggenmerg en knip de heup af.
    6. Ontwricht de heup door het heiligbeen en het dijbeen met de vingers uit elkaar te trekken.
      OPMERKING: Tijdens dit proces is het nodig om regelmatig te stoppen om voorzichtig aan de heupzenuw te trekken met een tang om verstoring te voorkomen.
    7. Scheur aan het einde voorzichtig de achterpoot van het muizenkarkas, zodat er een heupzenuw van ongeveer 4 cm lang overblijft.
      OPMERKING: Zoek tijdens dit proces de L2-zenuw en plaag deze uit de achterpoot om schade aan de L2 te voorkomen. Herhaal stap 1.12 voor de rechterkant.
  13. Leg de armzenuwen (bovenste ledematen) bloot.
    1. Manipuleer het karkas van de muis in de handen, in plaats van op een plat oppervlak (dissectiepad).
    2. Lokaliseer de linker plexus brachialis door het vet en de spieren in de linker oksel uit elkaar te plagen.
    3. Eenmaal gelokaliseerd, knipt u de belangrijkste vertakkingen van de plexus brachialis (radiaal, oksel, suprascapulair) en hun subvertakkingen rond de ellepijp af met een extra fijne Bonn-schaar, waarbij u vrije zenuwen van ongeveer 1,5 cm overlaat. Trek voorzichtig de plexus uit de linkerbovenledemaat.
    4. Ontwricht de linkerbovenledemaat; Zorg ervoor dat het zenuwvrij is. Herhaal stap 1.13 voor de rechterkant.
  14. Stel de hersenen bloot.
    1. Plaats nu de muis met de voorkant naar boven (vooraanzicht)
    2. Steek een mesje van de extra fijne Bonn-schaar in de mond en knip de onderkaak door de keel.
    3. Verwijder de onderkaak door verder te snijden van de wangen naar de keel.
    4. Snijd vervolgens het schedelbot door dat van het ene oor naar het andere gaat.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet te diep gaat en de hersenen beschadigt.
    5. Snijd en verwijder het gehemelte en de neusbeenderen om de schedel te openen.
    6. Snijd de C1-wervel aan de basis van de schedel door, waardoor het cerebellum en het begin van het ruggenmerg worden losgemaakt.
    7. Snijd ten slotte de schedel dwars tot aan het oog en verwijder de stukken van de schedel om de hersenen bloot te leggen.
      OPMERKING: Houd de hersenen in hun holte totdat de zenuwen zijn afgepeld.
  15. Verwijder eventueel extra vet of spieren van het karkas. Plaats het karkas in 10% formaline gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT), gevolgd door korte 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wasbeurten totdat er geen fixerende geur meer is, en ga verder met de volgende stap.
    OPMERKING: Als het zenuwstelsel in de komende 2 weken wordt ontleed, bewaar het dan bij 4 °C in PBS. Bewaar het anders voor onbepaalde tijd in 10% formaline. Gebruik altijd een chemische kap bij het manipuleren van formaline.

2. Blootstelling aan het ruggenmerg

  1. Gebruik een craniaal-naar-caudale benadering om het ruggenmerg bloot te leggen. Om elke wervel en hun spierlaag erboven te verwijderen, knipt u op de posities van tien uur en twee uur aan de ventrale zijde met behulp van een Vannas-veerschaar. Breek de wervel weg met een Dumont minitang. Zet dit proces voort via de hals- en borstwervels.
  2. Snijd voor het lumbale gedeelte de processus transversa aan weerszijden van de wervel. Knip vervolgens op de posities twee uur en tien uur door het mes van een Vannas-veerschaar in het wervelkanaal te steken. Verwijder de weefsels en let op de zenuwen die soms aan de botten vastzitten.
  3. Ga op dezelfde manier te werk voor het staartgedeelte.

3. Blootstelling van de thoracale zenuw

  1. Leg het karkas onder de dissectiemicroscoop om de voorste zijde zichtbaar te maken.
  2. Knip met behulp van de Vannas-veerschaar langs elke rib (van het borstbeen tot de onderste ledematen) om de perifere zenuwen bloot te leggen.
  3. Snijd vervolgens de wervel aan beide zijden (lateraal) van het ganglion door om het ganglion bloot te leggen.

4. Perifere zenuw pellen af

  1. Om het ruggenmerg af te pellen en de perifere zenuwen verder los te maken, gebruikt u de Dumont minitang om het ruggenmerg voorzichtig te rollen en de zenuwen één voor één uit te trekken, te beginnen met het caudale deel van het ruggenmerg.
    OPMERKING: Voordat u het afpelt, kan een extra fixatie worden uitgevoerd in 10% formaline gedurende 15 minuten bij RT, gevolgd door korte 1x PBS-wasbeurten totdat er geen fixerende geur meer is, zoals uitgevoerd in stap 1.15.
  2. Trek voor het thoracale deel aan de zenuw in een hoek van 90° (loodrecht op het ruggenmerg).
  3. Snijd voor de plexus brachialis de wervel naast de zenuw door, om ruimte te maken voor de zenuw.
    OPMERKING: De plexus brachialis kan niet onder de wervel worden gepasseerd, zoals in het thoracale gebied.
  4. Verwijder de overtollige spieren om de zenuwen vrij te maken.
  5. Bewaren in PBS bij 4 °C tot een totaal van 2 weken, of onbeperkt in 10% formaline bij RT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Knaagdieren hebben een belangrijke rol gespeeld in ons begrip van de biologie van het zenuwstelsel en pathofysiologie10. Intrigerend is dat er geen methoden zijn die de volledige dissectie van het centrale en perifere zenuwstelsel van een knaagdier presenteren om de anatomie en pathologische variatie in een real-time model te beoordelen 1,2,11. Figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te voorkomen dat de spieren en zenuwen uitdrogen, moet het karkas elke 10 minuten in PBS worden gedrenkt. Bij het ontwrichten van de onderste ledematen (stap 1.12.6) is het belangrijk om de heupzenuw plexus en L2 altijd in het zicht te hebben om beschadiging/scheuring te voorkomen. Bij het ontleden van de hersenen (stap 1.14.4) is het van cruciaal belang om niet te diep te gaan om de hersenen niet te beschadigen. Bij het ontleden van de dorsale wortelganglions en perifere zenuwen in h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaarden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JPB is een FRSQ J1-onderzoekswetenschapper en een ontvanger van de Early Investigator Research Award van het Amerikaanse ministerie van Defensie. LQL heeft een Career Award voor medische wetenschappers van het Burroughs Wellcome Fund en het Thomas L. Shields, MD Professorship in Dermatology.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dumont mini-forcepsFine Science Tools#11200-10
Extra Bonn schaarFine Science Tools#14084-08
Formaline 10%Fischer Scientific#22-046-361
PBS 1xBioShopCanada#PBS404.500
Standaard anatomische pincetFine Science Tools#91100-12
Chirurgische schaarFine Science Tools#140001-12
Vannas veer schaarKent Scientific#INS600124

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bala, U., Tan, K. L., Ling, K. H., Cheah, P. S. Harvesting the maximum length of sciatic nerve from adult mice: a step-by-step approach. BMC Reserach Notes. 7, 714(2014).
  2. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Reserach Notes. 9, 82(2016).
  3. Ikram, A., Rehman, A. Paraganglioma. StatPearls. , Treasure Island, FL. (2022).
  4. Ehara, Y., Koga, M., Imafuku, S., Yamamoto, O., Yoshida, Y. Distribution of diffuse plexiform neurofibroma on the body surface in patients with neurofibromatosis 1. The Journal of Dermatology. 47 (2), 190-192 (2020).
  5. Plotkin, S. R., et al. Updated diagnostic criteria and nomenclature for neurofibromatosis type 2 and schwannomatosis: An international consensus recommendation. Genetics in Medicine. 24 (9), 1967-1977 (2022).
  6. Brosseau, J. P., et al. NF1 heterozygosity fosters de novo tumorigenesis but impairs malignant transformation. Nature Communications. 9 (1), 5014(2018).
  7. Chen, Z., et al. Spatiotemporal loss of NF1 in Schwann cell lineage leads to different types of cutaneous neurofibroma susceptible to modification by the hippo pathway. Cancer Discovery. 9 (1), 114-129 (2019).
  8. Liao, C. P., et al. Contributions of inflammation and tumor microenvironment to neurofibroma tumorigenesis. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2848-2861 (2018).
  9. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  10. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. The Mouse Nervous System. , Elsevier, Academic Press. New York. (2012).
  11. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  12. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  13. Brosseau, J. P., et al. The biology of cutaneous neurofibromas: Consensus recommendations for setting research priorities. Neurology. 91, 14-20 (2018).
  14. Wu, J., et al. Preclincial testing of sorafenib and RAD001 in the Nf(flox/flox);DhhCre mouse model of plexiform neurofibroma using magnetic resonance imaging. Pediatric Blood & Cancer. 58 (2), 173-180 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Dissectie van het zenuwstelselcentraal zenuwstelseldissectie van de muisisolatie van het ruggenmergdorsale wortelgangliondissectie van de nervus ischiadicusmicrodissectiemicroscoopmuismodel voor neurofibromatoseanatomie van het zenuwstelsel
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen