Methodenartikel

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

DOI:

10.3791/64977

⸱

17 februari 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR / Cas9-technologie heeft de waarde van zebravissen verhoogd voor het modelleren van menselijke genetische ziekten, het bestuderen van ziektepathogenese en medicijnscreening, maar protospacer adjacent motif (PAM) -beperkingen zijn een belangrijk obstakel voor het creëren van nauwkeurige diermodellen van menselijke genetische aandoeningen veroorzaakt door single-nucleotidevarianten (SNV's). Tot nu toe hebben sommige SpCas9-varianten met brede PAM-compatibiliteit efficiëntie getoond in zebravissen. De toepassing van de geoptimaliseerde SpRY-gemedieerde adenine base editor (ABE), zSpRY-ABE8e en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravissen heeft een efficiënte adenine-guanine base conversie mogelijk gemaakt zonder PAM-beperking. Hier wordt een protocol beschreven voor efficiënte adeninebasisbewerking zonder PAM-beperking in zebravissen met behulp van zSpRY-ABE8e. Door een mengsel van zSpRY-ABE8e mRNA en synthetisch gemodificeerd gRNA in zebravisembryo's te injecteren, werd een zebravisziektemodel geconstrueerd met een precieze mutatie die een pathogene plaats van de TSR2-ribosoomrijpingsfactor (tsr2) simuleerde. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het opzetten van nauwkeurige ziektemodellen voor het bestuderen van ziektemechanismen en behandelingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Single-nucleotide varianten (SNV's) die missense of nonsense mutaties veroorzaken zijn de meest voorkomende bron van mutaties in het menselijk genoom1. Om te bepalen of een bepaalde SNV pathogeen is en om licht te werpen op de pathogenese ervan, zijn nauwkeurige diermodellen nodig2. Zebravissen zijn goede menselijke ziektemodellen, vertonen een hoge mate van fysiologische en genetische homologie met mensen, een korte ontwikkelingscyclus en een sterk voortplantingsvermogen, wat gunstig is voor onderzoek naar pathogene kenmerken en mechanismen, evenals geneesmiddelenscreening3.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de Care and Use Committee van de South China Normal University.

1. Synthetisch gemodificeerd gRNA en zSpRY-ABE8e mRNA bereiden

  1. Ontwerp het gRNA volgens eerdere publicaties37,38.
    1. Selecteer bij voorkeur NRN als de PAM-reeks, omdat zSpRY-ABE8e een hogere voorkeur voor NRN PAM vertoont dan NYN PAM (waarbij R A of G is en Y C of T)18. Zorg ervoor dat het doel-adeninenucleotide zich in het zeer actieve bewerkingsvenster bevindt (derde tot negende nucleoti....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van de mutatie van TSR2 is gemeld dat deze Diamond Blackfan-anemie (DBA)42 veroorzaakt. Hier werd een DBA zebravismodel geconstrueerd met een tsr2 (M1V) mutatie met behulp van de i-Silence strategie. De adenine van het startcodon van de zebravis tsr2 werd met zSpRY-ABE8e succesvol omgezet in guanine (figuur 3).

De EditR-analyse van de Sanger-sequencingresultaten toonde aan dat er een A/G-overlap was op de adenineb.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de constructie van een zebravisziektemodel met behulp van de basiseditor zSpRY-ABE8e. In vergelijking met de traditionele HDR-route voor basisvervanging, kan dit protocol efficiëntere basisbewerking bereiken en het optreden van indelaten verminderen. Tegelijkertijd omvat dit protocol de implementatie van de onlangs voorgestelde i-Silence gen-knock-out strategie in zebravissen. Alles bij elkaar zal zSpRY-ABE8e de toepassing van zebravismodellen in ziekteonderzoek verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Barbara Garbers, PhD, van Liwen Bianji (Edanz) voor het bewerken van de Engelse tekst van een concept van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Key-Area Research and Development Program van de provincie Guangdong (2019B030335001), het National Key R&D Program of China (2019YFE0106700), de National Natural Science Foundation of China (32070819, 31970782) en het Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Lab of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals (PBEA2020YB05).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseSigma-AldrichA95391.5% Agarose gebruikt om een injectieplaat te maken
Borosilicaat glas capillaire Harvard ApparatusBS4 30-0016
Celcultuur schalen Falcon351029
ClonExpress Ultra One Step Cloning KitVazymeC115Kit voor Infusion clone 
Codon optimalisatie serviceSangon Biotech
Drummond MicrocapsDrummond MicrocapsP1299-1PAKLengte: 32 mm, capaciteit: 0,5 µL
EasyEdit gRNA serviceGenScript
Fijne pincettenFine Scientific Instrument11254-20Gebruikt om naald te breken
Flaming/Brown Micropipette Puller Stutter InstrumentP-97Gebruikt om de glazen capillairen te trekken
HotStart Taq PCR StarMixGenstarA033-101Gebruikt voor PCR-reactie
Intelligible kunstmatige klimaatboxTENLINPRX-1000AGebruikt om zebravisembryo's te kweken
MethylcelluloseSigma-AldrichM0512Gebruikt om zebravis te fixeren bij het fotograferen
Microloader pipettenpunten Eppendorf5242956003
mMACHINE kit 
Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2VazymeC214-01Kit voor plaatsgerichte mutagenese
Pneumatische microinjectorZGene BiotechZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9Addgene46757
RNeasy FFPE kit Qiagen73504Kit voor RNA-zuivering
Sanger Sequencing serviceSangon Biotech
Natriumhydroxide, korreligSangonA100173-0500NaOH gebruikt voor genoomextractie
Stereo MicroscoopOlympus SZX10Gebruikt voor foto van fenotype
SZ Series Zoom Stereo MicroscoopCNOPTECSZ650
T3 mMESSAGEAmbionAM1348Kit voor in vitro transcriptie 
TIANprep Mini Plasmid KitTIANGENDP103-03Kit voor plasmide extractiekit
TIANquick Mini ZuiveringskitTIANGENDP203-02Kit voor zuivering voor gelineairiseerd plasmide
TricaineSigma-AldrichE10521Gebruikt om zebravis te anesthetiseren
Tris (hydroxymethyl) aminomethaanSangonA600194-0500Onderdeel van Tris·HCl gebruikt voor genoomextractie
XbaINew England BiolabsR0145SRestrictieneuklease gebruikt voor plasmide linearisatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
  2. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Base editing bij zebravisPAM loze editingadenine base editingenkelnucleotidevariantCRISPR Cas9 zebravisziektemodel zebravisSanger sequencinggRNA ontwerpDiamond Blackfan anemie

Gerelateerde artikelen