Methodenartikel

Massaspectrometrie-gebaseerde benaderingen voor de analyse van eiwitstructuur van hogere orde

647 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64979

⸱

3 maart 2023

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

In dit artikel

Samenvatting

BESPROKEN ARTIKELEN:

Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting voor het bestuderen van eiwitinteracties in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Karakterisering van cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Massa spectrometrische benaderingen om eiwitstructuur en interacties in gelyofiliseerd poeder te bestuderen. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. Een waterstof-deuterium uitwisselings massa spectrometrie (HDX-MS) platform voor het onderzoeken van peptide biosynthetische enzymen. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalente labelen met diethylpyrocarbonaat voor het bestuderen van eiwit hogere orde structuur door massaspectrometrie. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator met beweegbare XY-standaard: Een nieuw platform voor het implementeren van in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153 (2021).

Haupt, C. et al. Het combineren van chemische cross-linking en massaspectrometrie van intacte eiwitcomplexen om de architectuur van multi-subunit eiwitassemblages te bestuderen. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747 (2017).

Lento, C. et al. Tijdsafhankelijke elektrospray ionisatie waterstof/deuterium uitwisselings massaspectrometrie voor het bestuderen van eiwitstructuur en dynamica. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-vrije hydroxyl radicaal eiwit footprinting om hogere orde structurele analyse van eiwitten uit te voeren. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. Mogelijk maken van real-time compensatie in snelle fotochemische oxidaties van eiwitten voor de bepaling van eiwit topografie veranderingen. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580 (2020).

Chaihu, L. et al. Capillaire elektroforese-gebaseerde waterstof/deuterium uitwisseling voor conformationele karakterisering van eiwitten met top-down massaspectrometrie. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672 (2021).

Redactioneel

De hogere orde structuur (HOS) is een belangrijk aspect van eiwitkarakterisering omdat het nauw verbonden is met eiwitfunctie. Massaspectrometrie (MS) is een van de belangrijkste methoden voor het beoordelen van eiwit-HOS1. Hoewel MS-gebaseerde benaderingen niet in staat zijn om de eiwitstructuur met atomaire resolutie op te lossen, hebben ze de voordelen van middelmatige tot hoge ruimtelijke resolutie, hoge specificiteit, lage monsterhoeveelheidvereisten, hoge doorvoer en proteomicsmogelijkheden.

MS-gebaseerde eiwitfootprintingbenaderingen beoordelen de eiwit-HOS door de oplosmiddel-toegankelijke oppervlakte van het eiwit te analyseren, en ze worden meestal gekoppeld aan verschillende chemische labelbenaderingen. Reversibele label, zoals door waterstof-deuterium uitwisseling (HDX), richt zich op de ruggengraat amide waterstof in het eiwit1,2. Onomkeerbare label gebruikt chemicaliën die specifieke aminozuurresiduen3 doelwitten of radicalen die een verscheidenheid aan verschillende residuen labelen met hogere reactiesnelheid1. Chemische cross-linking is ook onderdeel van de onomkeerbare label categorie, maar zijn bivalente eigenschap staat de bepaling van ruimtelijke beperkingen tussen twee cross-linked sites toe, wat unieke topologische inzichten biedt4,5. Al deze benaderingen kunnen worden gecombineerd om een 'toolbox' te vormen, waardoor MS een waardevol hulpmiddel wordt voor het ophelderen van eiwit-HOS.

We hebben deze methodencollectie georganiseerd om de recente ontwikkelingen op het gebied van MS-gebaseerde eiwit-HOS analyse te presenteren. De eerste set artikelen beschrijven HDX-gebaseerde benaderingen. Habibi en Thibodeaux6 beschrijven een relatief klassieke continue, bottom-up HDX-MS aanpak. Met in-solution waterstof-deuterium (H/D) uitwisseling bij meerdere uitwisselingstijdstippen gevolgd door on-column pepsine-digestie, kan de mate van deuteriumopname op peptideniveau worden bepaald. Bij het uitvoeren van differentiële experimenten (d.w.z. gebonden versus ongebonden toestanden), vertegenwoordigen peptiden die verhoogde of verlaagde deuteriumopnameniveaus vertonen, gebieden die veranderingen in HOS ervaren. De auteurs gebruiken lanthipeptide synthetases om de HDX-MS workflow mooi te demonstreren.

Naast de bottom-up aanpak kan HDX-MS ook op een top-down manier worden uitgevoerd, waardoor analisten verschillende scheidingsstrategieën kunnen toepassen op het niveau van intacte eiwitten. Chaihu et al.7 gebruiken capillaire elektroforese om verschillende eiwittoestanden of proteoformen die naast elkaar bestaan in de oplossing te scheiden. Eiwitten ondergaan de H/D-uitwisseling tijdens de elektroforese terwijl ze in de capillaire deuterium achtergrond elektrolyt oplossing migreren, en dit wordt gevolgd door top-down MS analyse en gasfase fragmentaties om de deuteriumopnameniveaus te beoordelen op zowel het globale als fragmentniveau. Ten slotte zijn er ook nog twee andere methoden in deze collectie die verschillende methoden van H/D-uitwisseling benadrukken, namelijk uitwisseling voor gelyofiliseerd poeder8 en uitwisseling na elektrospray ionisatie9.

De tweede groep artikelen behandelt de onomkeerbare label methode. Onder hen maakt de snelle fotochemische oxidatie van eiwitten (FPOP) gebruik van radicalen als labelsoorten om het oppervlak van het eiwit te markeren10,11. In de praktijk wordt waterstofperoxide fotogeactiveerd door middel van een laser om hydroxyl radicalen te produceren, die als actieve label soorten dienen. Misra en Sharp12 presenteren een strategie voor radicale dosimetrie waarbij adenine wordt gebruikt als reporter voor de radicale concentratie en een in-line radicale dosimetrie systeem wordt gebruikt om de adenine respons te monitoren. Dit maakt de real-time compensatie van de hydroxyl radicale concentraties mogelijk en dus de normalisatie van de reactiecondities om een nauwkeurige uitlezing te leveren. Vervolgens werkten Weinberger en Chea samen met de Sharp groep om een laser-vrije FPOP platform te ontwikkelen13. Door de gevaarlijke laser te vervangen door een plasma lichtbron en dit te combineren met de in-line radicale dosimetrie en een geautomatiseerd monster verzamelstelsel, ontwikkelen en bieden ze een geïntegreerde oplossing voor onderzoekers die eiwit-HOS moeten karakteriseren.

De drie artikelen van Jones' groep14,15,16 verkennen de mogelijkheid om FPOP en eiwitfootprinting naar in vivo studies te brengen. Het voordeel van deze aanpak is ongekend, omdat het toelaat dat de eiwit-HOS wordt geanalyseerd in de native omgeving. De succesvolle toepassing van footprinting in cellen14 en in Caenorhabditis elegans15 opent nieuwe mogelijkheden voor het volgen van de HOS van het hele proteoom in zijn native staat, waardoor een diepgaand begrip van de eiwit-HOS mogelijk wordt dat niet kan worden bereikt door andere hulpmiddelen.

Een andere belangrijke methode van onomkeerbare label maakt gebruik van chemische reagentia die specifieke aminozuurresiduen doelwitten3. Kirsch et al.17 rapporteren een goed gebruikte workflow van eiwitfootprinting door middel van covalente label. Door gebruik te maken van di-ethylpyrocarbonaat als labelreagens, onderzoeken de auteurs de veranderingen in eiwit-HOS door een paar soorten aminozuurresiduen op het oppervlak van het eiwit te labelen. Door differentiële experimenten gevolgd door proteoly

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs hebben geen dankbetuigingen.

Referenties

  1. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
  2. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
  3. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
  6. Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
  7. Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
  8. Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
  9. Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  10. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  11. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  12. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

Herprints en machtigingen

Tags

Protein InteractionsHydroxyl Radical FootprintingPhotochemical OxidationHydrogen-deuterium ExchangeCovalent LabelingProtein AnalysisElectrospray IonizationChemical Cross-linkingMulti-subunit AssembliesConformational Characterization
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.