Methodenartikel

Fluorescentie-gebaseerde methoden voor het onderzoek naar biomoleculaire interacties

23 februari 2024

1Interdisciplinary Institute for Neurosciences (IINS), CNRS UMR5297, University of Bordeaux

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BESPREKTE ARTIKELEN:

Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - een veelzijdige techniek om cellulaire kinetiek te kwantificeren. Journal of Visualized Experiments. (169), e62025 (2021).

Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. Fluorescerende lekkagetest om membraandestabilisatie door cel-penetratiepeptide te onderzoeken. Journal of Visualized Experiments. (166), e62028 (2020).

Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescerende metingen van fosfatidyloserine/fosfatidylinositol 4-fosfaat uitwisseling tussen membranen. Journal of Visualized Experiments. (169), e62177 (2021).

Abdelhamid, M. A. S., Rhind-Tutt, A. V., Ambrose, B., Craggs, T. D. Nauwkeurige en nauwkeurige single-molecule FRET-metingen maken met behulp van de OpenSource smfBox. Journal of Visualized Experiments. (173), e62378 (2021).

Redactioneel

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomoleculaire interacties spelen een sleutelrol in biologische processen en zijn daarom een fundamenteel belangrijk aspect van de levenswetenschappen. Fluorescentietechnieken zijn uitgegroeid tot enkele van de krachtigste en meest toegepaste methoden om deze processen te onderzoeken en te begrijpen. In vitro fluorescentiebenaderingen bieden het potentieel voor real-time detectie van extra- en intracellulaire moleculaire interacties, wat een groot voordeel vormt ten opzichte van andere benaderingen. Dit is gebruikt voor een verscheidenheid aan eiwit-eiwit, eiwit-nucleïnezuur en eiwit-membraaninteracties, die een cruciale rol spelen bij de regulatie van cellulaire processen.

Deze verzameling geeft een overzicht van verschillende fluorescentie-gebaseerde technieken en toepassingen voor de studie van biomoleculaire interacties en verbreedt ons begrip van cellulaire processen.

Reiser et al.1 beschrijven een high-throughput methode voor het analyseren van cellulaire kinetiek van individuele cellen via geautomatiseerde beeldverwerving en -verwerking (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]). Met behulp van deze techniek bieden fluorescente reporters een tijdsafhankelijke weergave van verschillende onafhankelijke biologische processen zoals genexpressie in een enkele cel na transfectie, cellulaire respons in signaalcascades, apoptotische gebeurtenissen of stamceldifferentiatie. De auteurs voeren beeldvorming uit in geïsoleerde celarrays met behulp van scanning time-lapse microscopie, wat leidt tot honderden trajecten van enkele cellen en voldoende gegevens voor statistische analyse. Fluorescerende tijdsverlopen van enkele cellen zullen onderzoekers helpen om mechanismen van genlevering beter te begrijpen en cellulaire heterogeniteit op te lossen - een kenmerk van complexe biologische systemen die normaal gesproken worden bepaald door intrinsieke fluctuaties.

Konate et al.2 rapporteren een biofysische methode om de interactie, verstoring en/of permeabilisatie van membraan-interagerende peptiden te karakteriseren. In hun protocol beschrijven ze nauwkeurig de verschillende stappen om liposomen te formuleren en te zuiveren en om fluorescentie lekkage te karakteriseren. De methode wordt toegepast met een cel-penetrerend peptide (CPP) genaamd WRAP in associatie met een klein interfererend RNA (siRNA) of gecombineerd met een krachtig therapeutisch peptide (iCAL36) en wordt vergeleken met de bekende CPP, penetratin. Deze techniek biedt meerdere voordelen. Het is snel en eenvoudig te implementeren. Het staat nauwkeurige controle van de samenstelling van het lipidemembraan toe om verschillende typen celmembranen na te bootsen. De fluoroforen kunnen worden aangepast afhankelijk van het peptide van belang en zijn eigenschappen van membraanlekkage. Ten slotte is het monster extreem stabiel na bereiding. De veelzijdigheid van de techniek maakt het een nuttige benadering om verschillende biologische vragen te onderzoeken met betrekking tot celschade of geneesmiddelafgifte.

De aanwezigheid van fosfatidyl serine (PS) in zoogdiercelmembranen is belangrijk in verschillende signaalprocessen zoals celapoptose of bij de recrutering van eiwitten voor membraanreparatie. De overdracht en veranderingen in PS-verdeling op het oppervlak van plasmamembranen zijn een sleutelvraag die Ikhlef et al.3 behandelen met hun artikel. Ze beschrijven een protocol om in real time PS en PI-4-P lipidetransport en -uitwisseling te meten door het recombinante gisteiwit Osh6p. De methode maakt gebruik van fluorescente sensoren om te detecteren of een lipide-overdrachtseiwit (LTP) lipiden extraheert of overdraagt in kunstmatige membranen langs een gradiënt tussen lipideblaasjes. Dit protocol maakt werk mogelijk met niet-gelabelde lipiden om de correcte binding van lipiden aan de LTP mogelijk te maken. Bovendien wordt een betere tijdsresolutie bereikt in vergelijking met conventionele methoden, zoals radioactiviteitsgebaseerde assays of massaspectrometrie. Deze methode zal onderzoekers helpen om de extractie en uitwisseling van lipiden tussen verschillende organellen en membranen beter te begrijpen.

Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) is een krachtige methode om biomoleculaire systemen te bestuderen. Deze techniek kan worden toegepast op enkele moleculen (bijv. smFRET) en maakt het mogelijk om absolute afstanden binnen biomoleculen te meten. Abdelhamid et al.4 presenteren een stapsgewijs protocol over hoe smFBox uit te voeren, een onlangs ontwikkelde confocale opstelling die in staat is om de FRET-efficiëntie tussen twee kleurstoffen op vrij diffunderende enkele moleculen te meten. Ze laten zien hoe de smFRET-techniek kan worden geïmplementeerd en gebruikt vanaf monstervoorbereiding tot instrumentopstelling, uitlijning, data-acquisitie en -analyse. Bovendien beschrijven ze hoe de correctiefactoren te bepalen die nodig zijn voor nauwkeurige FRET-afstandsmetingen. Hier wordt de methode toegepast op vrij diffunderende DNA-duplexen en kan worden uitgebreid tot een breed scala aan toepassingen, zoals de studie van eiwitconformatieveranderingen of eiwit-DNA-interacties.

Biologische processen omvatten zeer diverse en talrijke biomoleculaire interacties die ruimte laten voor de ontwikkeling van nieuwe fluorescentie-gebaseerde assays of sensoren. Deze verzameling biedt onderzoekers een overzicht van de innovaties en ontwikkelingen in fluorescentie-gebaseerde methoden. Elk artikel werpt licht op een andere fluorescentie-gebaseerde methode, waardoor wordt gemarkeerd hoe belangrijk en veelzijdig fluorescente assays zijn geworden. De verzameling beschrijft deze methoden en moedigt daarmee het brede gebruik ervan aan tussen verschillende groepen en onderzoeksgebieden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-L. J. werd gefinancierd door de Fondation pour la Recherche Médicale (FRM ARF201809006996).

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Reiser, A., Woschée, D., Kempe, S. M., Rädler, J. O. Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a versatile technique to quantify cellular kinetics. Journal of Visualized Experiments. (169), e62025(2021).
  2. Konate, K., Seisel, Q., Vivès, E., Boisguérin, P., Deshayes, S. Fluorescent leakage assay to investigate membrane destabilization by cell-penetrating peptide. Journal of Visualized Experiments. (166), e62028(2020).
  3. Ikhlef, S., Lipp, N. F., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate exchange between membranes. Journal of Visualized Experiments. (169), e62177(2021).
  4. Abdelhamid, M. A. S., Rhind-Tutt, A. V., Ambrose, B., Craggs, T. D. Making precise and accurate single-molecule FRET measurements using the OpenSource smfBox. Journal of Visualized Experiments. (173), e62378(2021).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Live cell ImagingSingle cell ArraysCellular KineticsFluorescent Leakage AssayMembrane DestabilizationCell penetrating PeptidePhosphatidylserine ExchangePhosphatidylinositol 4 phosphateSingle molecule FRETSmfBox

Gerelateerde artikelen