$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Histologisch hebben wetenschappers zich sterk verlaten op dierproeven om te bepalen of een medisch product (d.w.z. medicijn of medisch hulpmiddel) veilig is voordat het op mensen wordt getest. Hoewel dierproeven in veel situaties nog steeds gerechtvaardigd zijn, is het vinden van alternatieven zeer wenselijk. Met de recente vorderingen in wetenschap en techniek, is de ontwikkeling van alternatieven voor dierproeven haalbaarder dan ooit. Een hernieuwde focus op de ontwikkeling van humane in vitro alternatieve methoden voor hartveiligheidsbeoordeling is ten minste gedeeltelijk toe te schrijven aan vorderingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie. Menselijke hartcellen kunnen in een laboratorium worden gegenereerd met behulp van een eenvoudige bloed- of huidmonster van een patiënt, wat menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) oplevert die geschikt zijn voor robuuste hoogdoorvoertests. Vooruitgang in 3D weefselbio-engineering, micro-elektrode array technologieën, levende celafbeeldingen en andere technologieën is ook van groot belang geweest voor de ontwikkeling van de protocollen in deze verzameling.
Het protocol van Gerges et al.1 past een niet-invasieve optische methode (MyoBLAZER) toe om veranderingen in contractiliteit bij volwassen humane primaire ventriculaire cardiomyocyten te beoordelen. De cellen worden elektrisch gepact en beeldanalyse meet sarcomeerverkorting over meerdere cellen parallel. Deze methode kan concentratie-responscurven verzamelen elke 30 min per verbinding per apparaat, en biedt structuur-activiteitsrelatiegegevens. Deze niet-invasieve optische methode helpt de fysiologie en farmacologie van volwassen humane cardiomyocyten tijdens hoogdoorvoerscreening te behouden. Bovendien kan het gebruik van humane volwassen cardiomyocyten een kritische translationele schakel bieden om contractiliteit te voorspellen.
De methodologie van Lickiss et al.2 presenteert een hybride contractiliteit en impedantie/extracellulair veldpotentiaal (EFP) technologie, die significante pro-maturatiefuncties toevoegt aan een industriestandaard 96-well platform door gebruik te maken van een zachte, flexibele, siliciumgebaseerde celcultuursubstraat. De aanpak bleek succesvol door de fysiologische positieve inotrope respons op isoproterenol opnieuw vast te stellen in commercieel verkrijgbare gezonde hiPSC-CM's, die bewust afwezig is in de standaard (stijve substraat) cultuur zonder de noodzaak van een 3D systeem. Het hybride systeem maakt de directe meting van contractiekracht (mN/mm2), klopsnelheid, evenals celmonolayer dichtheid en integriteit mogelijk. Het gaat ook in op de uitdagingen van een traditioneel 3D systeem (d.w.z. lage doorvoer, aanzienlijke trainingsbehoeften), waardoor de tijd en kosten die nodig zijn om de test te voltooien worden verminderd.
De verzameling bevat ook werk van Feaster et al.3, die een in vitro, hoogdoorvoer, niet-invasieve methode demonstreren om cardiale contractiliteitsmodulatie (CCM) therapie te evalueren in 2D humane stamcelcardiomyocyten geplateerd op een flexibele Matrigel-matras, met behulp van sondevrije video-gebaseerde microscopie. De auteurs benadrukken acute effecten van CCM op de contractiele eigenschappen van gezonde en zieke hiPSC-CM's. Deze tool biedt een goedkope methode om de veiligheid of werkzaamheid van CCM's te begrijpen, en zou de afhankelijkheid van dierstudies kunnen verminderen en helpen bij de regelgevende besluitvorming van medische apparaten voor cardiale elektrofysiologie.
Het verfijnde protocol van Schaefer et al.4 beschrijft een nieuwe uitbreiding van het standaard micro-elektrode array (MEA) systeem dat normaal gesproken extracellulair veldpotentiaal in hiPSC-CM's opneemt, waardoor intracellulaire-achtige actiepotentiaal opnamen mogelijk zijn door celmembranen te openen met nanoseconde laserstraalpulsen. Dit apparaat omvat niet alleen standaard MEA voordelen (d.w.z. signaalpropagatiebewaking, acute en chronische experimenten), maar biedt ook inzicht in intracellulaire-achtige actiepotentiaalvorm zonder het gebruik van sterke elektrische veldpulsen voor celleletroporatie.
Het protocol van Berry et al.5 beschrijft een nieuw platform dat reproduceerbare fabricage van 3D geëngend spierweefsels (EMT's) voor directe contractiliteitskrachtmetingen mogelijk maakt. Het instrument kan micronewtonveranderingen in contractiliteitskracht detecteren, waardoor het een krachtig hulpmiddel is voor dosisafhankelijke compound screening. Contractiliteit in hiPSC-gebaseerd hartweefsel, evenals skeletspierweefsels, kan in tot 24 weefsels tegelijkertijd worden opgenomen, en de gegevens kunnen longitudinaal over weken of maanden worden geanalyseerd. Daarom zijn minimale aanvullende vaardigheden of training vereist voor de onderzoekers.
Ten slotte beschrijft de publicatie van Zhao et al.6 een reeks functionele assays (extracellulair veldpotentiaal, actiepotentiaal, contractiliteit en calcium) geoptimaliseerd voor gebruik met cardiomyocyten die in huis kunnen worden gegenereerd door gebruikerslaboratoria. Dit kan worden gedaan met behulp van eerder gepubliceerde differentiatieprotocollen en iPSC's beschikbaar van de Stanford University Cardiovascular Institute Biobank (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), wat een breed scala aan “zieke” en controlecellen biedt. Dit is een complete set methoden voor de belangrijkste cardiale contractiliteit en elektrofysiologische opnamen, inclusief standaard benaderingen (patch clamp, micro-elektrode arrays, calciumgevoelige fluorescentieprobes en video-gebaseerde contractiliteitsmetingen).
Kortom, hoewel de huidige methodenverzameling niet claimt compleet te zijn (en blijft groeien), is het al een relatief uitgebreide set methoden die veel huidige uitdagingen illustreert bij contractiliteit en elektrofysiologische opnamen in humane cardiomyocyten. Het omvat protocollen voor primaire humane cardiomyocyten1, commercieel verkrijgbare hiPSC-CM's afgeleid van gezonde donoren2,