Subdurale zachte elektrocorticografie (ECoG) array-implantatie en langdurige corticale opname bij minivarkens

Summary

Hier presenteren we een methode voor de prestatie- en veiligheidsbeoordeling op lange termijn van zachte subdurale elektrode-arrays in een minivarkensmodel, waarbij chirurgische methoden en hulpmiddelen, postoperatieve magnetische resonantiebeeldvorming, elektrofysiologie van de auditieve cortex, elektrochemische eigenschappen van het implantaat en postmortale immunochemie worden beschreven.

Abstract

Neurologische stoornissen en ziekten kunnen worden gediagnosticeerd of behandeld met behulp van elektrocorticografie (ECoG) arrays. Bij geneesmiddelresistente epilepsie helpen deze bij het afbakenen van het epileptische gebied dat moet worden verwijderd. In langdurige toepassingen zoals brein-computerinterfaces worden deze epicorticale elektroden gebruikt om de bewegingsintentie van de hersenen vast te leggen, om de robotledematen van verlamde patiënten te besturen. De huidige stijve elektroderoosters beantwoorden echter niet aan de behoefte aan hersenopnames met hoge resolutie en bio-integratie op lange termijn. Onlangs zijn vervormbare elektrode-arrays voorgesteld om implantaatstabiliteit op lange termijn met hoge prestaties te bereiken. Er zijn echter preklinische studies voor deze nieuwe implantaattechnologieën nodig om hun functionaliteit en veiligheidsprofiel op lange termijn te valideren voor hun vertaling naar menselijke patiënten. In deze context worden varkensmodellen routinematig gebruikt bij de ontwikkeling van medische hulpmiddelen vanwege hun grote orgaanafmetingen en gemakkelijke omgang met dieren. In de literatuur worden echter slechts enkele toepassingen voor de hersenen beschreven, meestal als gevolg van chirurgische beperkingen en integratie van het implantaatsysteem op een levend dier.

Hier rapporteren we de methode voor implantatie op lange termijn (6 maanden) en evaluatie van zachte ECoG-arrays in het minivarkensmodel. De studie presenteert eerst het implantaatsysteem, bestaande uit een zachte microgefabriceerde elektrode-array geïntegreerd met een magnetische resonantiebeeldvorming (MRI)-compatibele polymere transdermale poort die instrumentatieconnectoren bevat voor elektrofysiologische opnames. Vervolgens beschrijft de studie de chirurgische ingreep, van subdurale implantatie tot herstel van dieren. We richten ons op de auditieve cortex als een voorbeeld van een doelgebied waar opgewekte potentialen worden geïnduceerd door akoestische stimulatie. Ten slotte beschrijven we een data-acquisitiesequentie die MRI van de hele hersenen, implantaat elektrochemische karakterisering, intraoperatieve en vrij bewegende elektrofysiologie en immunohistochemische kleuring van de geëxtraheerde hersenen omvat.

Dit model kan worden gebruikt om de veiligheid en functie van nieuw ontwerp van corticale prothesen te onderzoeken; Verplichte preklinische studie om vertaling naar menselijke patiënten voor te stellen.

Introduction

Neurologische stoornissen en ziekten kunnen worden gediagnosticeerd of behandeld met behulp van elektrocorticografie (ECoG) arrays. Deze elektroderoosters worden geïmplanteerd aan het oppervlak van de hersenen en maken opname of stimulatie van de menselijke cortex^mogelijk1. In het geval van resistente epilepsie helpen ze bijvoorbeeld bij het afbakenen van het epileptische gebied om 2 te^verwijderen. In langdurige toepassingen zoals brein-computerinterfaces worden deze epicorticale elektroden gebruikt om de bewegingsintentie van de hersenen vast te leggen, om de robotledematen van verlamde patiënten te besturen^. De huidige elektroderoosters zijn echter gemaakt van stijve metalen blokken die zijn ingebed in stijve polymere substraten en voldoen niet aan de behoefte aan hersenopnames met hoge resolutie en langdurige subdurale bio-integratie (>30 dagen). In plaats daarvan creëren ze lokale weefselreacties die leiden tot fibrotische inkapseling van het geïmplanteerde apparaat, wat na verloop van tijd tot slechtere prestaties leidt. Onlangs zijn flexibele of rekbare elektrode-arrays met behulp van dunne polymere substraten vervaardigd door microfabricagetechnieken voorgesteld om hoge prestaties te bereiken bij implantaties op lange termijn door de weefselreactie te beperken ^4,5. Er zijn echter preklinische studies voor deze nieuwe implantaattechnologieën nodig om hun functionaliteit en veiligheidsprofiel op lange termijn te valideren, zodat vertaling naar menselijke patiënten kan worden overwogen. In deze context worden minivarkens- en varkensmodellen routinematig gebruikt bij de ontwikkeling van apparaten in andere medische contexten (bijv. het cardiovasculaire, skelet- of maagstelsel) vanwege hun grote orgaanafmetingen en gemakkelijke omgang met dieren ^6,7,8. In de literatuur worden echter slechts enkele toepassingen beschreven die gericht zijn op de hersenen voor neurofysiologie, meestal vanwege chirurgische benaderingsbeperkingen en integratie van het implantaatsysteem op een levend dier 9,10,11,12. Deze zijn vaak niet compatibel met chronische implantatie bij levende dieren, omdat ze bijvoorbeeld de ontwikkeling van complexe hardware vereisen, zoals implanteerbare ingebedde elektronica. Bovendien onderzoeken ze niet de invloed van het implantaatsysteem op het doelweefsel, wat cruciaal is voor het bioveiligheidsaspect in translationele studies. Het varkensmodel staat dicht bij de menselijke anatomie in termen van corticale structuur, schedelbot en huiddikte¹³. Bovendien maakt hun vermogen om gedragstaken te leren ze tot een krachtig model voor het onderzoeken van functionele revalidatiestrategieën of zintuiglijke^{waarnemingen14}.

De vertaling van nieuwe technologieën en therapieën naar de mens vereist een beoordeling van de veiligheid en werkzaamheid, zoals vereist door de bevoegde medische autoriteiten. Deze worden meestal beschreven in technische documenten en normen¹⁵, maar ze vereisen alleen het slagen voor deze tests en onderzoeken niet het werkelijke effect van de implantatie van het apparaat of het verzamelen van andere nuttige gegevens parallel aan de veiligheidsstudie. Voor een volledige bioveiligheids- en prestatiestudie van de hersenen presenteren we hier een longitudinale en systematische verzameling van hersenbeeldvormingsgegevens, elektrofysiologische metingen, beoordeling van elektrochemische eigenschappen van de geïmplanteerde elektroden en postmortale histologie in een varkensmodel. Om dit te bereiken, moeten verschillende aspecten in overweging worden genomen om een volledig experimenteel model te creëren: (i) minimaal invasieve chirurgische toegang voor implantatie van het apparaat samen met een mechanisch stabiele transdermale poort om verbinding te maken met de elektroden, (ii) een robuust elektrofysiologisch registratieparadigma dat dient als prestatie-output voor de geïmplanteerde elektroden, zowel onder anesthesie als in vrij bewegende omstandigheden, (iii) in vivo beeldvorming (computertomografie [CT] en/of magnetische resonantie beeldvorming [MRI]) op verschillende tijdstippen om de evolutie van de hersenen en het implantaat te volgen, evenals de compatibiliteit van het geïmplanteerde systeem met de beeldvormingsapparatuur, en (iv) een weefselvoorbereidingspijplijn om de hersenen te extraheren voor histologische analyse.

Hier rapporteren we over de methode voor implantatie op lange termijn (6 maanden) en evaluatie van zachte ECoG-arrays in het minivarkensmodel (schematisch weergegeven in figuur 1). De zachte elektrode-arrays werden gepresenteerd in onze vorige rapporten en zijn gemaakt van dunne siliconenmembranen waarin elastische gouden dunne films zijn ingebed die worden gebruikt als elektrische sporen^16,17. Het contact met het weefsel wordt gemaakt door een mix van platina nanodeeltjes ingebed in een siliconenmatrix voor een zachte en efficiënte elektrochemische interface met het hersenweefsel¹⁸. De implantaten zijn via een flexibele kabel die subduraal door de schedel en de huid is getunneld, verbonden met een transdermale poort die de connectoren op de kop van het dier herbergt. De grootte en vorm van het implantaat kunnen worden aangepast aan het doel en de behoeften van het onderzoek. De huidige elektrodestrips in deze studie weerspiegelen de werkelijke grootte van de klinische strips. Klinisch beschikbare subdurale strips en roosters werden gebruikt als vergelijkingspunten met dezelfde benadering. De polymere MRI-compatibele transdermale poort wordt op de schedel geplaatst met behulp van een voetplaatsysteem dat deze stevig aan de schedel verankert. Hier beschrijven we in detail de chirurgische ingreep, van subdurale implantatie van beide hersenhelften tot herstel van het dier. We richten ons op de auditieve cortex als een voorbeeld van een doelgebied, waar opgewekte potentialen worden geïnduceerd door akoestische stimulatie, zowel in verdoofde als vrij bewegende omstandigheden. Op verschillende tijdstippen worden de hersenen van het dier in beeld gebracht in MRI (of CT voor de klinische elektroden) onder narcose en worden de elektrochemische eigenschappen van de elektroden gemeten. Elektrodekarakteriseringsmethoden worden gebruikt om de evolutie van het implantaat en de elektrode-weefselinterface te volgen (zie Schiavone et ^al.19 voor meer details). Deze omvatten chronoamperometrie om de stimulatiemogelijkheden van het elektrodecontact te onderzoeken, elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS) die de evolutie van de resistieve en capacitieve componenten van de elektrode kan aangeven, en weerstandsmetingen tussen kanalen om te onderzoeken op hermetische inkapselingsstoringen. Ten slotte hebben we een weefselextractiepijplijn ontwikkeld om de hersenen na euthanasie te doordringen, te explanten met de elektroden op hun plaats, ze in secties te snijden en histologische analyses uit te voeren met behulp van verschillende ontstekingsmarkers. Over het algemeen zal deze methode preklinische studies mogelijk maken met robuuste multimodale gegevensverzameling voor toekomstige klinische vertaling van nieuwe technologieën en therapieën op de hersenen.

Protocol

Chirurgische en gedragsprocedures werden goedgekeurd door de lokale ethische commissie in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door lokale (kanton Genève) en federale (Zwitserse) veterinaire autoriteiten met autorisatienummer GE11120A. Vrouwelijke Göttingen-minivarkens (n = 7) op de leeftijd van 2-6 maanden (5-8 kg) werden in dit onderzoek gebruikt.

1. Preoperatieve planning

1. In vitro karakterisering van het zachte implantaatsysteem
   1. Chronoamperometrie: Registreer de spanningsval bij de injectie van een bifasische stroompulsevolutie (d.w.z. de spanningstransiënt [VT]) met behulp van een oscilloscoop die parallel is aangesloten op een pulsgenerator. Sluit de pulsgenerator achtereenvolgens aan op elke elektrode en een platinateller in zoutoplossing (fosfaatgebufferde zoutoplossing [PBS] 1x). Raadpleeg stap 3.1 voor de instellingen.
   2. Elektrochemisch impedantiespectrogram: Meet de elektrochemische impedantie bij verschillende frequenties met behulp van een potentiometer. Sluit de potentiometer achtereenvolgens aan op elke elektrode met behulp van de platinateller en een Ag/AgCl-referentie-elektrode in zoutoplossing (PBS 1x). Raadpleeg stap 3.2 voor de instellingen.
   3. Weerstand tussen kanalen: Meet in droge toestand de gelijkstroomweerstand (DC) tussen aangrenzende kanalen met behulp van een draagbare multimeter.
   4. Implantaatselectie: Selecteer na de drie hierboven genoemde metingen het implantaat samen met de volgende criteria: impedantie bij 1 kHz onder 100 kΩ en geen weerstand tussen kanalen onder 1 MΩ.
2. Sterilisatie
   1. Implantaatsterilisatie: Plaats de geselecteerde implantaten afzonderlijk in sterilisatiezakken samen met een sterilisatiemarker en sluit ze af. Gebruik dubbele verpakkingen om steriliteit tijdens de operatie te garanderen.
      NOTITIE: In dit geval wordt waterstofperoxide (H2 O₂) gassterilisatie gebruikt vanwege de korte tijdscyclus en lage temperatuur (55 °C). Alternatieven zijn ethyleenoxide (ETO)-gas of autoclaafsterilisatie, maar compatibiliteit met het implantaatsysteem moet worden gegarandeerd.
   2. Sterilisatie van instrumenten: Plaats de gereinigde instrumenten in dubbele sterilisatiezakken of steriele instrumentendozen, samen met sterilisatiemarkers. Autoclaafsterilisatie is het meest gebruikelijk voor instrumenten, maarH 2 O₂ of ETO zijn mogelijke alternatieven.

2. Chirurgische implantatie van zachte ECoG-arrays

1. Anesthesie
   1. Premedicatie: Isoleer het dier en vast het 's nachts. Injecteer een mengsel van midazolam in een dosis van 0,75 mg/kg, atropine in een dosis van 0,25 μg/kg en haldol in een dosis van 0,1 mg/kg intradermaal en wacht tot het dier verdoofd is. Weeg het dier voordat u verder gaat.
   2. Installatie van intraveneuze (IV) geleidingsdraad:
      1. Leg het dier op de operatietafel op een verwarmingskussen. Induceer anesthesie door een gezichtsmasker op het dier te plaatsen, met behulp van sevofluraan in een dosis van 3%-3,5%.
      2. Plaats elektrocardiogramafleidingen op de buik, een bloedverzadigingssensor op de staart en een temperatuursensor in het neusgat.
      3. Plaats een infuuskabel op een oorader en bevestig de toegang tot het bloed met een spuit gevuld met zoutoplossing. Zorg ervoor dat de ogen gehydrateerd blijven door zalf te gebruiken.
   3. Intubatie: Injecteer een bolus atracurium van 0,5 mg/kg, ketamine van 1 mg/kg en fentanyl van 1-2 μg/kg. Leg het dier op zijn rug voor intubatie. Plaats een buis van 4.5 mm.
   4. Medicatie: Stop na intubatie met de sevofluraan-anesthesie en installeer een propofol-infusie met 10 mg/kg/uur, fentanyl met 2 μg/kg/uur, atracurium met 0,2-0,5 mg/kg/uur en zoutoplossing met 4-7 mg/kg/uur. Start een infusie met mannitol in een dosis van 1 g/kg/u om de zwelling van de hersenen tijdens de operatie te verminderen.
      OPMERKING: Een multimodaal analgesieregime kan worden gebruikt indien aanbevolen door de plaatselijke dierethische commissie.
2. Preoperatieve röntgenfoto
   1. Plaats het dier op zijn buik in de sfinxpositie. Verwijder tijdelijk alle metalen voorwerpen in de buurt van de hersenen en schedel van het dier (bijv. temperatuurlood in het neusgat).
   2. Maak een röntgenfoto van het axiale en sagittale vlak met een contrast van het bot. Plaats een metalen voorwerp met bekende afmetingen in het sagittale acquisitieveld om te dienen als een schaal om de schedeldikte aan de voor- en achterkant van de hersenen te meten.
   3. Identificeer de locatie van de voorhoofdsholten (zichtbaar door holtes onder de schedel) en markeer de meest achterste locatie op de kop van het dier met een permanente marker. Dit geeft het verste punt aan waar een craniotomie of schroefplaatsing kan worden gedaan in de hieronder beschreven chirurgische benadering.
3. Aseptisch veld en huidvoorbereiding: Scheer het gehele oppervlak van het hoofd buiten het operatieveld. Gebruik een steriel kompres om het hoofd grondig te schrobben met betadine. Plaats vervolgens steriele gordijnen op de instrumententafel en op het dier om alleen het chirurgische venster te onthullen. Schrob ten slotte het hoofd opnieuw met een steriel kompres met betadine.
4. Craniotomie en durotomie
   1. Huidsnede: Snijd de huid in met een scalpelmes langs de middellijn. Scheid de spier en het botvlies (25 mm lateraal van bregma aan beide zijden en 40 mm anterieur en posterieur van bregma) van het bot met behulp van een raspatoire en plaats spreiders om optimale toegang te krijgen voor later boren.
   2. Metingen en markering: Identificeer bregma en lambda en markeer ze met een steriele chirurgische pen (Figuur 2A, B). Definieer met behulp van een steriele liniaal de omtrek van de botflap gecentreerd rond het implantatiedoel op beide hersenhelften. In dit specifieke geval werd gekozen voor de auditieve cortex, met coördinaten -5 mm tot -15 mm van bregma en -4 mm tot -20 mm lateraal. Pas vervolgens de craniotomie aan de grootte van het implantaat en anatomische oriëntatiepunten aan, waarbij de openingsgrootte wordt beperkt.
   3. Craniotomie:
      1. Boor met een botboor met een ronde snijboor de omtrek van de craniotomie, rekening houdend met de dikte van de schedel gemeten in stap 2.2. Spoel de boorlocatie met een zoutoplossing om oververhitting van het bot te voorkomen.
      2. Boor de omtrek voorzichtig homogeen totdat u de dura mater bereikt. Bij de eerste doorbraak beëindigt u het boren van de omtrek totdat deze voldoende is verdund om bijna door te breken. Gebruik vervolgens een platte spatel (aan de middellijnzijde of aan de zijkant) om de botflap in één stuk los te breken, waarbij u de craniotomierand als hefboom gebruikt. Als er te veel weerstand wordt ondervonden, ga dan door met het dunner maken van het bot.
      3. Leg het botstuk in steriele zoutoplossing.
      4. Zodra de botflap is verwijderd, snijdt u voorzichtig de rand van de craniotomie weg, met behulp van een Kerison om te voorkomen dat de scherpe botrand in de dura mater snijdt.
      5. Als er overmatig bloeden wordt aangetroffen op de dura mater of het bot, gebruik dan respectievelijk Gelfoam of botwas. Plaats een nat kompres (standaardkompres in steriele zoutoplossing) in de craniotomie en herhaal deze stap op de andere hersenhelft (Figuur 2B).
   4. Durotomie:
      1. Gebruik de naald uit een 6-0 hechtset om de dura mater voorzichtig aan het voorste of achterste uiteinde van de craniotomie halverwege tussen de mediale en laterale zijde te doorboren en op te tillen en het begin van een incisie te maken met het steekmes.
      2. Gebruik vervolgens een kleine platte spatel die in de subdurale ruimte wordt gestoken en die als snijbasis fungeert om de cortex te beschermen, maak een anteroposterieure spleet in de dura mater door gelijktijdig met beide gereedschappen naar voren te gaan. Zorg ervoor dat de spleet iets groter is dan de breedte van het implantaat (Figuur 2C). Als er bij deze stap een bloeding of beschadiging optreedt, bedek deze dan met gelschuim en wacht tot het stopt.
         OPMERKING: Het spleettraject moet worden aangepast als er grote bloedvaten in de dura mater aanwezig zijn om bloedingen te voorkomen.
5. Implantatie
   1. Apparaat inbrengen:
      1. Spoel het implantaat (aanvullende figuur 1A) aan beide zijden met zoutoplossing, zodat het gemakkelijker in de subdurale ruimte glijdt. Plaats het implantaat boven de dura mater-spleet en breng het apparaat met een kleine pincet subduraal in door het achtereenvolgens aan elke rand te schuiven.
      2. Houd het uiteinde van het voetstuk van het apparaat voorzichtig vast en ga met het implantaat mee om geen spanning te creëren die het inbrengen belemmert. Wanneer de verbindingsrand zich bovenop de gleuf bevindt, stopt u het inbrengen.
   2. Zet het implantaat vast: Om het implantaat op zijn plaats te houden, plaatst u een titanium brug over de kabel na de rand van de craniotomie of in de verankeringsvleugels en zet u deze vast met een of twee titanium schroeven met behulp van de juiste schroevendraaier (Figuur 2D).
   3. Plaatsing op de grond: Verwijder voorzichtig 1 cm van de isolatie van de aardingsdraden en breng deze epiduraal in aan het achterste uiteinde van de craniotomie (of een andere epidurale locatie ver van de betreffende cortex of grote bloedvaten) (draad in figuur 2E)
   4. Herhaal stap 2.4.4. en 2.5.1.-2.5.3 op de contralaterale hemisfeer.
   5. Intraoperatieve röntgenfoto om plaatsing te bevestigen:
      1. Plaats een nat kompres (standaardkompres in steriele zoutoplossing) over de operatieplaats om het weefsel gehydrateerd te houden. Plaats vervolgens een steriel operatielaken om de kop van het dier te bedekken.
      2. Maak röntgenfoto's van het vliegtuig (axiaal en sagittaal) om er zeker van te zijn dat de implantaten goed geplaatst zijn en niet gevouwen zijn, met behulp van de röntgenmarkeringen als indicatoren. Als dit niet het geval is, verwijdert u het laken en verwijdert u het apparaat om het opnieuw te plaatsen (volg de stappen 2.4.4. en 2.5.1.-2.5.3 opnieuw).
   6. Dura mater sluiting: Hecht de dura mater voorzichtig rond de implantaatkabel met behulp van een 3-0 resorbeerbare hechtdraad en een kleine naaldhouder. Breng de twee dura mater-randen zoveel mogelijk naar elkaar toe zonder met de hechtdraad door het dunne membraan te scheuren (Figuur 2D, E).
   7. Plaatsing van de botflap: Bevestig een titanium brug op het voorste en achterste deel van elke botflap met behulp van een titanium schroef. Zorg ervoor dat u de positionering van de Ti-bruggen plant met betrekking tot de plaatsing van de voetplaatpoten in de volgende stappen. Schroef het uiteinde van de titanium bruggen op de schedel (Figuur 2F, G).
6. Plaatsing van voetstuk en voetplaat
   1. Positionering: In deze configuratie heeft de voetplaat zes poten met elk twee schroefgaten (aanvullende afbeelding 1B). Plan de plaatsing van de voetplaat op de schedel om de locatie van de schroeven te optimaliseren (plaats ze niet aan de rand van de craniotomie of in de slaapspier). Sla de gaten in de poten over als ze niet kunnen worden vastgeschroefd.
   2. Vastzetten van de voetplaat: Draai de titanium schroeven van de voetplaat vast totdat deze stevig op zijn plaats zit (zie afbeelding 2H).
   3. Plaatsing van het voetstuk: Verwijder de titanium bruggen over de aansluitkabels en draai het voetstuk om om op de voetplaat te landen. Schroef de sokkel op de voetplaat. Controleer of het voetstuk stevig op zijn plaats zit (Figuur 2I).
7. Hechten en sluiten
   1. Reiniging van de wond: Reinig de onderhuidse ruimte van bot of ander vuil door te spoelen met zoutoplossing. Snijd wat huid rond de randen van de sokkel weg om een ronde rand te creëren die de cilinder volgt.
   2. Onderhuidse hechtingen: Verwijder de spreiders en vouw de huidflappen samen. Maak onderhuidse hechtingen met een 4-0 niet-resorbeerbare hechtdraad, 3 mm uit elkaar met behulp van eenvoudige onderbroken hechtingen of eenvoudige continue hechtingen. Begin weg van het voetstuk en beweeg er aan beide zijden van de incisie naartoe.
   3. Dermale hechtingen: Hecht de huid met een 6-0 niet-resorbeerbare hechtdraad, met hechtingen met een tussenruimte van 5 mm. Begin weg van het voetstuk en beweeg er aan beide zijden van de incisie naartoe. Zorg voor een goede weefselhechting tussen de twee huidflappen en in de buurt van de rand van het voetstuk om een holte te voorkomen (Figuur 2J).
   4. Wondverband: Reinig het wondgebied opnieuw met een steriel kompres en betadine. Breng een zelfklevend steriel verband aan over de wond.
8. In-vivometingen : Volg voor in-vivometingen rubrieken 3, 4 en 5.
9. Ontwaken: Nadat alle metingen zijn uitgevoerd, haalt u het dier van alle verdoving af, maar houdt u het onder ventilatie. Breng voor analgesie gedurende 24 uur een buprenorfinepleister (25 mg/uur) aan. Leg het dier op een met gordijnen bedekt verwarmingskussen om de wektijd te versnellen. Wanneer de spontane ademhaling is hersteld, extubeert u het dier en plaatst u het onder een zuurstofmasker totdat het bewustzijn is hersteld (dit kan 1 tot 4 uur duren).
10. Postoperatieve dierverzorging: Houd het dier gedurende 5 dagen nauwlettend in de gaten. Geef tweemaal daags een dosis cefalexine van 75 mg met voedsel, gescheiden van andere dieren. Voer dagelijks desinfectie van de wond uit door grote hoeveelheden betadine aan te brengen met gedrenkt steriel maandverband (het beste tijdens het voeden).
    LET OP: Langdurige zorg en huisvesting: Het geopereerde dier wordt 24 uur geïsoleerd gehouden. Het wordt teruggeplaatst in zijn oorspronkelijke sociale groep als het dier goed genoeg is om sociaal met zijn soortgenoten om te gaan. Dagelijkse observatie van het voetstuk en de huidopening moet worden uitgevoerd om de integratie van het apparaat op het hoofd te volgen. Reinig indien nodig de locatie rond het voetstuk met grote hoeveelheden betadine.

3. In vivo karakterisering van het zachte implantaat

1. Chronoamperometrie: Registreer de spanningsval bij de injectie van een bifasische stroompulsevolutie (d.w.z. de VT) met behulp van een oscilloscoop die parallel is aangesloten op een pulsgenerator. Sluit de pulsgenerator achtereenvolgens aan op elke elektrode en de aardingsdraad. Voer de stimulatiepuls uit bij 100 μA met een pulsbreedte van 300 μs bij 100 Hz.
2. Elektrochemische impedantiespectroscopie: Meet de elektrochemische impedantie op verschillende frequenties met behulp van een potentiometer. Sluit de pulsgenerator achtereenvolgens aan op elke elektrode, waarbij u de aardingsdraad gebruikt als zowel de tegenelektrode als de aarde. Stel de excitatiespanning in op 200 mV en het frequentiebereik van 1 Hz tot 1 MHz, met drie punten per decennium.
3. Korte metingen tussen kanalen: Meet de DC-weerstand tussen aangrenzende kanalen met behulp van een draagbare multimeter. In vivo wordt de DC-weerstand tussen kanalen alleen gemeten om te verifiëren dat er geen tekorten onder 1 kΩ verschijnen, wat wijst op een totale inkapselingsfout.

4. Elektrofysiologische registratie

1. Spontane activiteit: Sluit het draadloze opnamesysteem aan op het voetstuk en registreer de basisactiviteit gedurende 2-3 minuten. Deze opnames zullen dienen als een controle om de auditief opgewekte potentialen te analyseren.
2. Auditief opgewekte potentialen: Plaats naast het draadloze systeem luidsprekers in een gesloten veld in de oren van het dier. Akoestische stimulatie van de geluidspiek op verschillende frequenties (variërend van 200-20.000 Hz) met een geluidsdrukniveau (SPL) van ongeveer 70 dB gedurende 120 herhalingen. Bereken vervolgens het gemiddelde van de opnames en lijn ze uit over de stimulusperiode voor analyse.
3. Sensorisch opgewekte potentialen: Plaats de naalden in de snuit op drie verschillende posities. Roep sensorische potentialen op door de snuit gedurende ~30 s te stimuleren met de pulsgenerator op verschillende amplitudes om de rekruteringscurven te verkrijgen.

5. In vivo beeldvorming

1. Diertransport: Houd het dier onder propofol-anesthesie, zoals beschreven in stap 2.1. Gebruik een transportkar met een beademingsapparaat, spuitpomp en monitor voor vitale functies om het dier van de operatiekamer naar de beeldvormingsfaciliteiten en terug te vervoeren.
2. Röntgenscan computertomografie: Leg het dier op de scannertafel en verwijder alle metalen voorwerpen rond de kop (bijv. de temperatuursensor). Maak een CT-scan met de kleinste resolutie (0,4 mm plakdikte) met behulp van isometrische acquisitie met automatische stroom- en spanningsselectie voor botcontrast.
3. Magnetische resonantiebeeldvorming: Verwijder alle apparatuur die metaal bevat van het dier (gebruik MRI-compatibele infuusafleidingen en intubatiebuis). Houd het dier beademd en verdoofd onder sevofluraan op 3%-3,5%, met behulp van een beademingsapparaat dat zich buiten de MRI-kamer bevindt en via een lange buis met het dier is verbonden. Injecteer vóór de eerste sequentie een bolus fentanyl van 1-2 μg/kg. Gebruik drie isometrische sequenties met de kleinste resolutie: T1-, T2- en turbo spin echo (TSE)-gewogen sequenties (parameters weergegeven in aanvullend bestand 1).

6. Vrij bewegende opname

1. Volg dezelfde procedure als beschreven in rubriek 4 voor het registreren van wakkere signalen van de hersenen. Sluit de draadloze headstage aan door het dier in de armen van de onderzoeker te houden of het dier te voeren met lekkernijen om het af te leiden. Zorg voor de akoestische stimulatie met behulp van externe luidsprekers die dicht bij het dier zijn geplaatst.

7. Perfusie en weefselpreparatie

1. OPTIONEEL: Als het dier nog niet onder narcose is, volg dan stap 2.1 voor het anesthesieprotocol.
2. Inbrengen van een katheter in de halsslagader voor perfusie (aanvullende figuur 2)
   1. Dissectie van de halsslagader en halsader: snijd de keel door bij de middellijn met behulp van een cauterizer/snijder. Snijd eerst de huid door en vervolgens de spier langs de middelste witte lijn (geen bloedvaten eronder) (aanvullende figuur 2A).
   2. Open verder en gebruik de vingers om ruimte te maken rond de luchtpijp en onder de spier. Zoek naar de halsslagader (kloppend en rozeachtig); De nervus vagus is soms ook rond (wit) en de halsader kan zich onder of aan de zijkant (rood) bevinden. Plaats de strooiers (zie aanvullende figuur 2B).
   3. Begin met het disdelen van de halsslagader met een fijne pincet en een ronde schaar. Gebruik een schaar om bindweefsel te openen. Als er geen bloedvaten zijn, knip dan; als er bloedvaten zijn, schroei dan dicht en ga verder (aanvullende figuur 2C, D). Als het voldoende is ontleed, gebruikt u een klem om onder de halsslagader door te gaan, zodat deze volledig geïsoleerd is (aanvullende afbeelding 2E).
   4. Herhaal dezelfde handeling met de halsader (aanvullende figuur 2F).
   5. Wanneer beide bloedvaten volledig zijn ontleed en geïsoleerd, plaatst u er hechtdraad omheen. Sluit ze nog niet. Twee hechtingen rond de halsslagader, één helemaal aan de basis (hechtdraad 1-hartzijde voor hersenperfusie) en één aan de andere kant (hechting 2), zijn weergegeven in aanvullende figuur 2G.
   6. Plaats één hechting rond de halsader (hechting 3), niet gesloten; Markeer de draden met tape om de ader later in secties te snijden.
   7. Sluit hechting 1 zeer stevig, anders gaat deze bloeden (aanvullende figuur 2H). Leg drie knopen. Plaats een klem op de draad om gewicht te plaatsen en spanning in de halsslagader te creëren.
   8. Klem de halsslagader vast met behulp van een vaatklem aan de andere kant van de dissectie van de halsslagader (hersenzijde voor hersenperfusie; Aanvullende figuur 2I). Hechting 2 zit in het midden, nog niet gesloten.
   9. Gebruik een zwarte pincet om de halsslagader op te vangen en eraan te trekken. Snijd met een fijne schaar de helft van de halsslagader in de buurt van de basis van de dissectie (bij hechting 1, hartzijde; zie aanvullende figuur 2J). Zorg ervoor dat de sectie zo netjes mogelijk is en het vat zelf bereikt, niet alleen de "schede"; anders gaat de katheter er niet doorheen. Breng de katheter in zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 2K.
   10. Spoel en vul de katheter eerst met PBS, zodat er geen lucht meer in de katheter zit (aanvullende afbeelding 2K-inzet ).
   11. Sluit hechting 2 stevig genoeg zodat deze niet weggaat, maar niet te veel zodat de katheter nog een beetje kan bewegen (aanvullende afbeelding 2L). Verwijder vervolgens de vaatklem, voltooi het inbrengen van de katheter zo ver mogelijk en voltooi de sluiting van hechtdraad 2 (stevig sluiten).
   12. Gebruik desgewenst hechtdraden bij hechting 1 om de basis van de katheter aan de huid bij de uitgang van de wond te bevestigen als extra veiligheidsstap. Breng het dier vervolgens over naar de perfusiezone en sluit het aan op PBS/heparine. Wanneer de perfusie begint, trekt u aan hechtdraad 3 en snijdt u de halsader door
3. Euthanasie: Lever pentobarbital (90 mg/kg) intraveneus toe en spoel de lijn door met zoutoplossing om ervoor te zorgen dat de volledige dosis met succes wordt toegediend.
4. Perfusie: Gebruik een perfusiepomp (200 ml/min) om de halsslagaderkatheter aan te sluiten op PBS/heparine (1 l voor een varken van 15 kg) en vervolgens op PBS met 4% paraformaldehyde (PFA) (5 l voor een varken van 15 kg). Wanneer de perfusie begint, trekt u aan hechtdraad 3 en snijdt u de halsader door.
5. Weefselafname
   1. Onthoofding: Wanneer de perfusie voorbij is, maakt u de kop van het dier los van het lichaam met behulp van een scalpel, door de huid en spieren door te snijden en het mes tussen de eerste en tweede wervel te steken.
   2. Postfixatie: Dompel het hoofd nog eens 48 uur onder in 4% PFA in PBS bij 4 °C en breng het vervolgens over naar PBS voordat de hersenen worden geëxtraheerd.
   3. Extractie van hersenen en implantaten:
      1. Verwijder de huid met een scalpel en begin voorzichtig met het doorsnijden van het bot met behulp van een rongeur, beginnend bij de eerste wervels, langs het ruggenmerg naar het cerebellum. Zodra het cerebellum is blootgesteld, verwijdert u voorzichtig de slaapbeenderen en legt u de pariëtale en frontale kwabben bloot.
      2. Schroef nu het voetstuk van de voetplaat en knip de voeten van de voetplaat door met een tang. Verwijder het bot in de buurt van de kabelingang in de schedel om het implantaatsysteem van het bot te bevrijden, zonder de implantaten uit de dura mater-uitgang te trekken.
      3. Als de implantaatkabels in het bot zijn ingebed, knip de kabel dan zo dicht mogelijk bij de uitgang door. Zodra er voldoende hersenoppervlak is blootgelegd, knipt u de dura voorzichtig langs de middellijn met een kleine schaar.
      4. Maak de implantaatkabels los van de uitgang van de dura mater. Maak foto's van de plaatsing van het implantaat op de hersenen. Gebruik vervolgens een kleine lepel om de hersenen los te maken van de hersenzenuwen eronder. Pak de hersenen voorzichtig uit. Verwijder de implantaten uit de hersenen.
   4. Postfixatie van de hersenen: Afhankelijk van de perfusiekwaliteit, de geëxtraheerde hersenen opnieuw gedurende 24 uur postfixeren in 4% PFA in PBS bij 4 °C. Houd in 0,1 M PBS bij 4 °C totdat de hersenen zijn doorgesneden.
   5. Brain cut: Scheid de twee hersenhelften met een scheermesje. Snijd vervolgens de hersenen orthogonaal in vier verschillende stukken. Snijd de geïmplanteerde zone doormidden om twee blokken te verkrijgen met de geïmplanteerde zone en een controlegebied. Berg de andere twee blokken op als er meer bedieningsschuiven nodig zijn.
   6. Cryoprotectie en bevriezing van de hersenen: Breng de hersenblokkades eerst over in een oplossing van 15% sucrose en vervolgens 30% sucrose bij 4 °C totdat de hersenen zich storten en een evenwicht bereiken. Vries het weefsel vervolgens in isopentaan bij -55 °C in een weefselbevriezingssysteem.

8. Histologie

1. Weefsel doorsnijden
   1. Cryostaat: Plaats de bevroren hersenen in een cryostaat en trim totdat volledige secties zijn bereikt. Snijd vervolgens de hersenen in secties van 40 μm en dompel ze onder in groepen van drie in 0.1 M PBS in putplaten. Let goed op de volgorde van de platen.
   2. Sectieselectie: Selecteer de secties afhankelijk van de zone die moet worden geanalyseerd (geïmplanteerde regio of controlezone). Haal de secties achtereenvolgens uit de putplaten en gebruik een fijne borstel om ze op beschadigingen te inspecteren. Plaats ze in nieuwe putplaten gevuld met 0.1 M PBS voor verdere kleuring.
2. Immunohistochemie
   1. Bereiding: Incubeer de coupes in 0,3% Triton X/PBS gedurende 15 minuten, gevolgd door 3% runderserumalbumine (BSA)/PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
   2. Primaire antilichamen: Incubeer de weefsels met primaire antilichamen gedurende 48 uur bij RT (anti-GFAP, rat, verdund met 1/300; anti-Iba1, konijn, verdund met 1/400; anti-NeuN, cavia, verdund met 1/1.000; alles in 1% BSA/PBS). Dek de putplaten af met aluminiumfolie.
   3. Wassen: Was de putjes driemaal gedurende 5 minuten met 0.1 M PBS.
   4. Secundaire antilichamen: Incubeer de weefsels met secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij RT (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; allemaal verdund met 1/400 in 1% BSA/PBS).
   5. DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylind): Incubeer de weefsels met DAPI gedurende 15 minuten (1/1.000 in 1% BSA/PBS).
   6. Wassen: Was de putjes vijf keer met 0.1 M PBS gedurende 15 min.
   7. Montage: Monteer de geleiders met behulp van montagemedia en een dekglaasje. Bewaar de glaasjes in het donker in de koelkast bij 4 °C.
3. Beeldvorming
   1. Beeldvorming van het hele objectglaasje: Beeld van de objectglaasjes met een vergroting van 10x (objectieve werkafstandswaarde = 3.100 μm) met behulp van een objectglaasjesscannermicroscoop op drie verschillende golflengten (640 nm, 560 nm, 485 nm). Alle informatie over vermogen en versterking is te vinden in Aanvullend Bestand 2.
   2. Microscopische beeldvorming: Beeld van het interessegebied bij een vergroting van 20x (apochromaat 20x/0,8 M27) met behulp van een confocale microscoop op vier golflengten (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP). Alle informatie over vermogen en versterking is te vinden in aanvullend bestand 3.

Results

Om de plaatsing (figuur 3A) en de functionaliteit van de apparaten te bevestigen, worden elektrofysiologische opnames intraoperatief uitgevoerd na plaatsing van de voetstuk. Het basissignaal wordt eerst gedurende 2 minuten verkregen zonder stimuli als controle van de basale activiteit. Ten tweede wordt het dier akoestisch gestimuleerd met een toonuitbarsting op verschillende frequenties (500-20.000 Hz), en de ruwe gegevens worden gemiddeld over de stimulusperiode om auditief opgewekte potentialen over de array in kaart te brengen (bijv. bij 800 Hz in vergelijking met baseline; Figuur 3B). De hier getoonde gegevens zijn onbewerkt, maar als er te veel ruis aanwezig is, kunnen notch- en bandpassfilters worden toegepast. Typische geluidsbronnen in de operatiekamer zijn onder meer verwarmingskussens, verstopte boren en zuig- of cauterizers (onder andere) die vóór de aanschaf moeten worden verwijderd. Bij wakkere opnames moeten grote spierbewegingen rond het hoofd, zoals kauwen, worden vermeden voor schonere datasets.

Dit protocol werd op elk opnametijdstip toegepast en signalen voor een enkel kanaal konden in de loop van de tijd worden vergeleken. Een voorbeeld wordt geïllustreerd in figuur 3C, die de robuustheid en evolutie van de respons laat zien. De opnamecapaciteit van elk contact in de loop van het experiment kan worden geëvalueerd door de standaarddeviatie van het basissignaal op elk tijdstip te berekenen (figuur 3D). In deze studie nam de signaal-ruisverhouding af en vestigde zich tussen dag 0 en maand 6, ondanks enige variabiliteit als gevolg van de beperkte duur van de opnameperiode (d.w.z. 2 minuten). Dit kan verder worden gecorreleerd met elektrode-impedanties.

De in vivo beeldvorming wordt postoperatief uitgevoerd om de toestand van de hersenen en de positionering van het implantaat te beoordelen. In de eerste iteratie van het protocol werd geen intraoperatieve röntgenfoto gemaakt, wat resulteerde in een gevouwen apparaat, zoals zichtbaar is in figuur 4A op een T1-gewogen MRI-sequentie (zie daarnaast figuur 4B). Er werd geen gedragsverandering waargenomen bij het dier, maar na verloop van tijd resulteerde dit in een fibrotische inkapseling rond het apparaat als gevolg van de macroscopische compressie van de hersenen rond de implantaatlocatie (Figuur 4C). Na deze ervaring werd intraoperatieve röntgenstraling geïntroduceerd, zoals weergegeven in figuur 4D, waarbij de radiopake markers (zwarte balken zichtbaar op het implantaat in inzet figuur 4D) goed gepositioneerd zijn. Het oppervlak van de hersenen is dan intact, zoals te zien is in de postoperatieve MRI in figuur 4E. Over het algemeen is met dit implantaat- en voetstuksysteem beeldvorming van de hele hersenen mogelijk. Verschillende sequenties in de coronale vlakken maken het mogelijk om anatomische structuren te zien (Figuur 4F,G; T1 en T2 MRI-sequenties) of de aanwezigheid van vloeistof en bloed rond het implantaat (Figuur 4H; TSE-gewogen MRI-sequentie). Het voetstuksysteem creëert bijna geen artefacten, behalve enkele kleine zwart contrasterende holtes rond de titanium schroeven (zie figuur 4G). Bovendien worden in dit onderzoek klinische elektroden gebruikt als vergelijkingspunten, maar deze kunnen niet in beeld worden gebracht in de MRI vanwege verwarmings- en veiligheidsoverwegingen. Daarom worden CT-scans gemaakt van deze dieren, zoals weergegeven in figuur 4I. De elektroden zijn duidelijk zichtbaar en het sokkelsysteem heeft geen invloed op de beeldkwaliteit.

Na de implantatieperiode wordt het dier doorbloed en worden de hersenen geëxtraheerd. In deze studie wordt de analyse van de ontstekingsreactie op elke hersenhelft afzonderlijk uitgevoerd. Het doormidden snijden van de hersenen is gemakkelijker voor weefselvoorbereiding vóór secties, en heeft het voordeel dat secties op standaard microscopieglaasjes kunnen worden gemonteerd. Een voorbeeld van een hersenmonster wordt getoond voor (Figuur 5A) en na (Figuur 5B) het knippen in blokken. De omtrek van het implantaat is duidelijk zichtbaar en heeft een klein deukje in de hersenen veroorzaakt. Door in parallelle vlakken te snijden, is het weefsel dan al uitgelijnd met de cryostaat en kunnen secties gemakkelijk worden gesneden zonder weefselverlies voor trimmen (Figuur 5C). Na het kleuren wordt het hele weefselgedeelte in beeld gebracht (Figuur 5D), waarbij bijvoorbeeld de neuronlaag duidelijk in detail zichtbaar is (zie NeuN-marker). Hele secties zijn kwetsbaar en kunnen soms leiden tot enig verlies van weefsel (zie de onderkant van figuur 5D), maar het interessegebied is intact. Bij nadere beschouwing, mogelijk gemaakt door confocale microscopiebeeldvorming op 40x, zijn de cellen duidelijk gedefinieerd en maken ze bijvoorbeeld nauwkeurig onderzoek van ontstekingsmarkers mogelijk (Figuur 5E). Verdere kwantificerende analyse kan worden uitgevoerd om ontsteking tussen controle- en geïmplanteerde hemisferen te vergelijken. Figuur 6 toont de elektrochemische karakterisering van de geïmplanteerde elektroden. De in-vitro-elektrochemische impedantiespectroscopie van de zachte elektrode-array met impedantiemodulus en fase wordt weergegeven in figuur 6A en de impedantiemodulus bij 1 kHz gedurende 6 maanden implantatie wordt weergegeven in figuur 6B.

Figuur 1: Schema van het experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Minimaal invasieve implantatie van zacht ECoG in de hersenen . (A) Chirurgische toegang tot de schedel, met indicatie van bregma. (B) Bilaterale craniotomie met zichtbare dura mater. (C) Spleet-durotomie op de eerste hersenhelft. (D) Subdurale implantatie van zachte ECoG en dura mater-sluiting. (E) Spleet-durotomie op de tweede hersenhelft. Botflapfixatie op de eerste hersenhelft met behulp van titanium bruggen. (F) Implantatie van zacht ECoG op de tweede hersenhelft en dura mater-sluiting. (G) Fixatie van de botflap op de tweede hersenhelft. (H) Plaatsing van de voetplaat op de schedel. (I) Bevestiging van de voetstuk op de voetplaat. (J) Huidsluiting rond de voetstukbasis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Registratie van auditief opgewekte potentialen . (A) Schema van de plaatsing van de elektroden aan het oppervlak van de temporale kwab. (B) Representatief in kaart brengen van basislijnactiviteit (grijze sporen) en auditief opgewekte potentialen als reactie op een 800 Hz toonburststimulatie (paarse spoor). Elk gemiddelde komt overeen met één kanaal op de zachte ECoG-array. De middeling wordt geactiveerd op het analoge ingangssignaal van de geluidsstimulatie. "AAN" en "UIT" akoestische stimulatieperioden worden genoteerd op één kanaal linksonder. (C) Evolutie in de tijd (dag 0, maand 2 en maand 5) van een enkelkanaals respons na akoestische stimulus, vergeleken met het basissignaal wanneer er geen stimulus wordt gepresenteerd (grijs). De middeling wordt geactiveerd op het analoge ingangssignaal van de geluidsstimulatie. De stimulatieperioden "AAN" en "UIT" staan onderaan vermeld. Het opgewekte potentieel van de "AAN"-stimulatie is gemarkeerd met pijlen. (D) Standaarddeviatie per kanaal (gekleurde stippen) per tijdstip van de basisregistratie. De mediaanwaarden worden vetgedrukt blauw weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: In vivo beeldvorming van de hersenen en geïmplanteerde elektroden . (A) Postoperatieve T1-gewogen MRI in het coronale vlak. Een pijl geeft een gevouwen implantaat aan. (B) Vergrote deel van A, waar het vouwen van het implantaat een deuk in de hersenen veroorzaakt. (C) T1-gewogen MRI na implantatie na 1 maand, die compressie van de hersenen laat zien als gevolg van de fibrotische inkapseling van de hersenen op dezelfde locatie als C. (D) Röntgenfoto van het intraoperatieve vlak die de plaatsing van het implantaat verifieert en geen vouwen, zoals waargenomen door de plaatsing van de radiopake marker. Inzet: Foto van implantaat met radiopake marker zichtbaar. (E) Postoperatieve T1-gewogen MRI in het coronale vlak met optimale plaatsing van het implantaat. (F) T1-gewogen MRI na implantatie na 1 maand. (G) T2-gewogen MRI na implantatie na 1 maand. Een pijl toont het beeldartefact van de titanium schroeven die de voetplaat op zijn plaats op de schedel houden. (H) TSE-gewogen MRI na implantatie na 1 maand. (I) CT-scan van het dier geïmplanteerd met de klinische elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Histologie-analyse van de hersenen na langdurige implantatie. (A) Foto van een geëxplanteerde en doorbloede hersenhelft-linkerhersenhelft. (B) Geperfuseerde hersenen die in blokken zijn gesneden voorafgaand aan de bevriezingsstap. (C) Afbeelding van de opstelling van de hele bloksectie op de cryostaat; De volledige "voorgesneden blokken" kunnen worden doorgesneden. (D) Immunokleuring beeldvorming van de hele hemisfeer (diascanner, 20x objectief) en (E) zoomen op de eerste lagen van de cortex (confocale beeldvorming, 40x objectief) met gliacellen, astrocyten en neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Elektrochemische karakterisering van de geïmplanteerde elektroden. (A) In vitro elektrochemische impedantiespectroscopie van de zachte elektrode-array (kleine grijze lijnen voor elk kanaal, het gemiddelde in rood) met impedantiemodulus (boven) en fase (onder). (B) Evolutie van de impedantiemodulus bij 1 kHz gedurende 6 maanden na implantatie (gemiddelde in blauw; grijze lijnen zijn de afzonderlijke kanalen; de in-vitrometing wordt als referentie gegeven in rood). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: MRI-compatibele sokkel. (A) Chronisch MRI-compatibel transdermaal verbindingssysteem (voetstuk) om toegang te krijgen tot de zachte elektrode-array. (B) Voetstuk met elektroden gemonteerd op de voetplaat voor het verankeren van de schedel. Inzet: Details van de voetplaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Chirurgische toegang voor optimale doorbloeding van de hersenen. (A) Gesneden huid en toegang tot de locatie van de halsslagader en halsader. (B) Dissectie van het weefsel rond de bloedvaten. (C,D) Identificatie en dissectie van het weefsel rond de halsslagader en halsader. (E) Isolatie van de halsslagader van het onderliggende weefsel. (F) Isolatie van de halsader van het onderliggende weefsel. (G) Plaatsing van de hechtdraad rond de halsslagader (hechting 1 en hechtdraad 2) en de halsader (hechting 3). (H) Sluiting van hechting 3 aan de basis van de halsslagader (hartzijde) om bloedingen tijdens het openen van het bloedvat te voorkomen. (I) Klemming van de halsslagader aan de andere kant van H. (J) Doorsnede van de halsslagader. (K) Ingebrachte katheter in de opening van J. Inzet: Geprepareerde katheter met zoutoplossing die van een spuit naar de kathetertip wordt gespoeld. (L) Sluiting van hechting 2 om de katheter op zijn plaats en langs de slagader te houden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Parameters voor respectievelijk T1- (pagina's 1-2), T2- (pagina's (3-4) en TSE-gewogen (pagina's 5-6) MRI-sequenties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Metadata voor diascanner voor beeldvorming van het hele glaasje van gekleurde hersenplakjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Metadata voor confocale beeldvorming van vergrote delen van gekleurde hersenplakjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

We rapporteren hier een methode voor langdurige implantatie en evaluatie van zachte ECoG-arrays. In deze studie hebben we een consistente, minimaal invasieve chirurgische benadering ontworpen voor bilaterale implantatie van functionele elektroderoosters over de temporale kwabben (hier gericht op de auditieve cortex). We evalueerden eerst de functionaliteit van het raster door met succes de opgewekte potentialen in de loop van het onderzoek (6 maanden) vast te leggen en de elektrochemische eigenschappen van de elektroden te volgen (zie figuur 6). Ten tweede beoordeelden we de bioveiligheid van de roosters, in vivo door MRI te gebruiken en een volledig MRI-compatibel systeem op te zetten, en postmortem door een protocol te ontwerpen voor weefselafname en immunokleuring.

Om invasiviteit te minimaliseren, hebben we de grootte van het craniotomievenster geoptimaliseerd. Om de auditieve cortex op de temporale kwab te bereiken en om te voorkomen dat de temporale spier wordt verwijderd, hebben we een techniek ontwikkeld om het implantaat onder de dura te schuiven. Deze techniek maakt het mogelijk om het oppervlak van de blootgestelde hersenen drastisch te verkleinen en toch verre doelen te bereiken. Hoewel dit type implantatie misschien blind lijkt, maakt de implementatie van radiopake markers op de apparaten die worden gevisualiseerd in de röntgenfoto van het intraoperatieve vlak verificatie van de positionering mogelijk en zorgt ervoor dat de array niet onder de dura mater wordt gevouwen. Het subdurale glijden is veilig gebleken in de meeste herhalingen die we hebben uitgevoerd. Bovendien minimaliseert de durotomie in een spleetbenadering het uitpuilen van de hersenen gedurende de tijd dat de craniotomie open is en vergemakkelijkt het de sluiting rond het implantaat zonder dat er extra materiaal nodig is, zoals kunstmatige dura mater, wat de ontstekingsreactie zou kunnen beïnvloeden. Ten slotte is de kracht van deze chirurgische benadering het vermogen om te worden getransponeerd naar verschillende corticale regio's. Door te spelen met coördinaten, de craniotomiepositie en de grootte van het apparaat, die allemaal kunnen worden aangepast, kan deze methode zich richten op het grootste deel van het cortexgebied.

De hier gepresenteerde chirurgische methode, samen met functionele beoordeling en onderzoek van de bio-integratie in de loop van de tijd, is niet beperkt tot de zachte elektrodetechnologie die in dit rapport wordt gebruikt. Andere subdurale elektroden die worden ontwikkeld voor menselijke translatie kunnen met hetzelfde protocol worden geëvalueerd. De kracht van deze methode berust op het feit dat de meeste onderdelen, zoals de kabel en het voetstuk, modulair en personaliseerbaar zijn en kunnen worden aangepast aan het specifieke apparaat dat wordt getest. Bovendien kunnen intracorticale of diep penetrerende sondes ook worden gebruikt in plaats van of in combinatie met de subdurale elektroden, omdat hiervoor alleen de geometrie van de craniotomie en de durotomie hoeft te worden aangepast. De resultaten op lange termijn kunnen dan worden vergeleken met hun klinische tegenhangers, zoals we hier hebben gedaan.

Een van de belangrijkste beperkingen van de gepresenteerde methode is de aanwezigheid van schedelsinussen bij minivarkens, die zich in de loop van het eerste jaar ontwikkelen¹². Belangrijke aspecten waarmee rekening moet worden gehouden, zijn onder meer de leeftijd van implantatie en ook de grootte van het dier. Het uitvoeren van craniotomieën in de volwassen schedel verbreekt de integriteit van de sinussen en leidt tot een hoog risico op ernstige infectie in chronische omgevingen. Dergelijke sinussen zijn preoperatief zichtbaar op de röntgenfoto en CT-scan van het vlak. Aan de andere kant is het te vroeg uitvoeren van chronische implantatie, bij een te klein dier, ook niet optimaal wanneer de schedel een enorme groei en remodellering ondergaat. We veronderstelden dat deze "schedelbewegingen" na de operatie ervoor zouden kunnen zorgen dat het implantaat beweegt en vouwt, wat uiteindelijk schadelijk is voor het experiment. We hebben hier geconstateerd dat Göttingen-minivarkens, ongeveer 5-6 maanden oud (en 8 kg) op het moment van implantatie, de beste resultaten zouden moeten geven.

Voor het evalueren van de prestaties van het geïmplanteerde ECoG voor elektrofysiologische opnames, hebben we een snel protocol opgesteld voor auditieve evoked potential (AEP) opname dat kan worden gebruikt bij vrij bewegende dieren en onder sedatie. Het bestaat uit het presenteren van een reeks akoestische toonuitbarstingen op specifieke frequenties in de loop van een paar minuten. Het voordeel van een dergelijk protocol is het feit dat het kan worden afgestemd op de beschikbare opnameduur door het aantal gesonde frequenties te verminderen. Een uitdaging bij het opnemen van corticale signalen onder narcose is dat bij het analyseren en vergelijken van de gegevens rekening moet worden gehouden met het bewustzijnsniveau van het dier.

Het protocol voor perfusie werd in de loop van de tijd aangepast door observatie van de kwaliteit van de geëxtraheerde hersenen. We vonden het inderdaad gemakkelijker om alleen de halsslagader te katheteriseren, en niet de halsader. In eerste instantie worden in de literatuur methoden gepresenteerd waarbij de halsader wordt gekatheteriseerd om afvalstoffen af te voeren²⁰. In de praktijk beperkt dit de uitstroom uit de hersenen en leidt het tot een slechtere bloedafname en de algehele kwaliteit van de perfusie. Door de halsader door te snijden en de vloeistof te laten ontsnappen in een grote bak waar het dier ligt, neemt de efficiëntie van de perfusie toe.

We hebben een robuuste weefselvoorbereidingsmethode ontwikkeld die werkt met antilichamen die routinematig worden gebruikt voor het opsporen van ontstekingen. We hebben de twee hersenhelften om praktische redenen gescheiden, omdat de helft van de hersenen van het varken op standaard microscoopglaasjes past en dus compatibel is met de meeste beeldvormingsapparatuur die beschikbaar is in histologielaboratoria. Door de hersenen in blokken te snijden, wordt directe toegang tot de interessezone mogelijk gemaakt zonder dat de hele hersenen verder hoeven te worden gesneden of grote delen van het weefsel hoeven te worden bijgesneden. De hersenplakjes van 40 μm kunnen worden gepoold in standaard putplaten en op een vrij zwevende manier worden gekleurd zonder grote protocolwijzigingen ten opzichte van de immunokleuringen van andere soorten. Immunokleuring van de volledige hersenen kan ook worden overwogen door bijvoorbeeld gebruik te maken van CLARITY-methoden²¹.

Over het algemeen is dit protocol, dat betrekking heeft op gepersonaliseerd implantaatontwerp tot implantatie, functionaliteitsopvolging en bioveiligheidsbeoordeling, robuust en consistent. We hebben hier aangetoond dat het haalbaar is om het auditieve systeem te bestuderen, maar het kan worden getransponeerd om andere fysiologische functies te testen. Bovendien ligt de kracht van onze methode in het feit dat deze niet beperkt is tot minivarkens, maar volledig toepasbaar is op andere soorten zoals schapen, geiten of niet-menselijke primaten. Tot op zekere hoogte kan het ook gemakkelijk worden aangepast aan ratten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bone drill	BBraun	Elan 4 with  GA861 handpiece
Bone drill bit	BBraun	Neurocutter GP204R
Bonewax	Ethicon	W31G
Catheter	Venisystems	Abbocath 14G
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Cryostat	Leica	CM1950
Gelfoam	Pfizer	Gelfoam
Insert speakers	Etymotic	Etymotic ER2 insert Earphones
Multimeter	Fluke	Fluke 1700
Oscilloscope	Tektronix	MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
Perfusion pump	Shenzen	LabS3/UD15
Potentiostat	Gamry Instruments	Reference 600
Primary Antibody Anti-GFAP	Thermofischer	Anti-GFAP, Rat, # 13-0300
Primary Antibody Anti-Iba1	Fujifilm	Anti Iba1, Rabbit, 019-19741
Primary Antibody Anti-NeuN	SigmaAldrich	Anti-NeuN, GuineaPig, ABN90
Pulse Generator	AM Systems	Model 2100 Isolated Pulse Stimulator
Recording headstage	Multichannel systems	W2100-HS32
Recording system	Multichannel systems	W2100
Screwdriver	Medtronic	Handle: 001201, Shaft: 8001205
Secondary Antibody 488	Thermofischer	Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488, # A-11006
Secondary Antibody 555	Thermofischer	Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555, # A-21435
Secondary Antibody 647	Thermofischer	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647, # A-21245
Slide Scanner	Olympus	VS120
Snapfrost	Excilone	Excilone Snapfrost
Stab knife	Fine Science Tools	10316-14
Suture wire dermal	Ethicon	Vicryl 2-0
Suture wire dura mater	Ethicon	Mersilk 5-0
Suture wire for catheter	Ethicon	Vycril 3-0 without needle
Suture wire for lifting dura	Ethicon	Prolene 6-0 with BV-1 needle
Suture wire subcutaneous	Ethicon	Vicryl 4-0
Titanium bridge	Medtronic	TiMesh 015-2001-4	Cut out the required size
Titanium screws	Medtronic	9001635, 9001640
X-ray system	GE	GE OEC 9800 Plus C-Arm