Methodenartikel

Evaluatie van autofagieniveaus in twee verschillende pancreascelmodellen met behulp van LC3-immunofluorescentie

DOI:

10.3791/65005

⸱

28 april 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Bioquimica y Medicina Molecular Prof Alberto Boveris (IBIMOL), Universidad de Buenos Aires, CONICET, 2Signalling Programme, The Babraham Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol is om autofagische niveaus in alvleesklierkanker en pancreasacinaire cellen te bepalen door middel van LC3-immunofluorescentie en LC3-puntkwantificering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagie is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase te behouden. Kankercellen kunnen hun autofagieniveaus moduleren om zich aan te passen aan ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of schade veroorzaakt door chemotherapie. Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-eiwitten.

Hier werd de PANC-1-cellijn gebruikt als een model van menselijke kankercellen van de alvleesklier en de AR42J pancreas-acinaire cellijn werd gebruikt als een fysiologisch model van sterk gedifferentieerde zoogdiercellen. Deze studie gebruikte de immunofluorescentie van microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3) als een indicator van de status van autofagie-activering. LC3 is een autofagie-eiwit dat in basale omstandigheden een diffuus distributiepatroon vertoont in het cytoplasma (bekend als LC3-I in deze aandoening). Autofagie-inductie activeert de conjugatie van LC3 tot fosfatidylethanolamine op het oppervlak van nieuw gevormde autofagosomen om LC3-II te vormen, een membraangebonden eiwit dat helpt bij de vorming en uitbreiding van autofagosomen. Om het aantal gelabelde autofagische structuren te kwantificeren, werd de open-source software FIJI gebruikt met behulp van de "3D Objects Counter" -tool.

De meting van de autofagische niveaus, zowel in fysiologische omstandigheden als in kankercellen, stelt ons in staat om de modulatie van autofagie te bestuderen onder verschillende omstandigheden zoals hypoxie, chemotherapiebehandeling of de knockdown van bepaalde eiwitten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macroautofagie (gewoonlijk autofagie genoemd) is een gespecialiseerd katabolisch proces dat selectief cytoplasmatische componenten afbreekt, waaronder eiwitten en beschadigde organellen 1,2. Autofagie stelt cellen in staat om fysiologisch te reageren op stressprikkels en zo cellulaire homeostase3 te behouden. Tijdens autofagie wordt een dubbel membraanblaasje gevormd: het autofagosoom. Het autofagosoom bevat de ladingmoleculen en drijft ze naar het lysosoom voor afbraak 1,4.

Autofagosomen worden versierd door het autofagische eiwit microtubule-geassocieerde eiwit lichtketen 3 (LC3)5. Wanneer autofagie niet wordt geïnduceerd, wordt LC3 diffuus in het cytoplasma en de kern in de LC3-I-conformatie. Aan de andere kant, wanneer autofagie wordt geïnduceerd, wordt LC3 geconjugeerd met een fosfatidylethanolamine in het membraan van de autofagische structuren6. Deze nieuwe LC3-conformatie staat bekend als LC3-II1. De LC3-conformatieverschuiving veroorzaakt veranderingen in de cellulaire lokalisatie en de migratie van dodecylnatriumsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE), die kan worden gedetecteerd door technieken zoals immunofluorescentie en western blot 5,7. Op deze manier is LC3-conjugatie een belangrijke gebeurtenis in het autofagische proces die kan worden gebruikt om autofagische activiteit te meten.

De pancreasacinaire cel is een sterk gedifferentieerde cel die, onder gezonde omstandigheden, een lage mate van autofagie heeft. In verschillende fysiologische omstandigheden of onder farmacologische stimulatie kunnen ze echter autofagie activeren. Daarom is de bepaling van autofagische niveaus in deze cellijn nuttig voor het bestuderen van de potentiële directe of indirecte effecten van verschillende farmacologische of biologische agentia op autofagie 8,9.

Ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier is een van de dodelijkste vormen van kanker, gezien de late diagnose en de hoge chemotherapieresistentie10. Alvleesklierkankercellen hebben een hoge autofagie-activiteit als gevolg van de transcriptionele upregulatie en posttranslationele activering van autofagie-gerelateerde eiwitten11. Alvleesklierkankercellen kunnen hun autofagieniveaus aanpassen als reactie op ongunstige omstandigheden zoals hypoxie, tekort aan voedingsstoffen of door chemotherapie veroorzaakte schade11. Daarom kan het analyseren van de autofagieniveaus in alvleesklierkankercellen helpen begrijpen hoe ze zich aanpassen aan verschillende omgevingen en de effectiviteit van autofagiemodulerende behandelingen evalueren.

Deze studie toont een methode om LC3-immunofluorescentie uit te voeren in twee verschillende pancreascellulaire modellen. Het eerste model, PANC-1-cellen, diende als model voor ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier. Deze cellen werden behandeld met gemcitabine, een chemotherapeuticum waarvan eerder is aangetoond dat het autofagie induceert, met name in alvleesklierkankercellen die het oncogene Kirsten rat sarcoma virus-gen (KRAS)12,13 dragen. Het tweede model, AR42J-cellen, diende als een meer fysiologisch model van exocriene pancreascellen. Deze cellen werden gedifferentieerd met dexamethason om meer op acinaire pancreascellen te gaan lijken14. In deze cellen werd autofagie farmacologisch geïnduceerd door het gebruik van PP242, een krachtige mTOR-remmer15. In deze studie tonen we de toepasbaarheid aan van het protocol beschreven met twee verschillende pancreasmodellen en het vermogen om onderscheid te maken tussen toestanden van lage en hoge autofagie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celvoorbereiding

  1. Week 12 mm ronde coverslips in absolute ethanol en plaats ze verticaal in de putjes van een plaat met 24 putten.
  2. Verwijder het deksel en stel de multi-well plaat gedurende 15 minuten bloot aan ultraviolette straling.
  3. Plaats de coverslips horizontaal en was ze met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  4. Zaai een laag doorgangsaantal pancreascellen. Het bedrag moet worden aangepast om 50% -75% confluentie te verkrijgen op de dag van fixatie16.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 2,5 × 10 4 PANC-1 of 4 × 104 AR42J-cellen per put te zaaien om de cellen na 3 dagen te fixeren.
  5. Kweek de cellen in DMEM met 10% foetaal runderserum, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een couveuse bij 37 °C onder een bevochtigde atmosfeer met 5% koolstofdioxide (CO2).
    OPMERKING: Voor PANC-1-cellen wordt aanbevolen om de cellen gedurende 2 dagen tussen het zaaien van de cel en de volgende stappen te incuberen. Na deze tijd kunnen de cellen worden getransfecteerd, behandeld of gefixeerd. Dit protocol illustreert de behandeling met gemcitabine in niet-getransfecteerde PANC-1-cellen en de differentiatie- en PP242-behandeling voor niet-getransfecteerde AR42J-cellen.

2. Behandeling van de cellen

  1. Gemcitabine behandeling voor PANC-1 cellen
    1. Bereid een oplossing van 1 μg/μL gemcitabine in DMEM 2 dagen na het zaaien. Behandel elk putje met 2,6 μL van de 1 μg/μL gemcitabine oplossing om een uiteindelijke verdunning van 20 μM te verkrijgen.
    2. Incubeer de cellen gedurende 24 uur in de incubator.
  2. AR42J-differentiatie en PP242-behandeling
    1. Bereid een oplossing van 4 μg/ml dexamethason in DMEM.
    2. Behandel elk putje met 4,9 μL 4 μg/ml dexamethasonoplossing om een uiteindelijke verdunning van 100 nM te verkrijgen.
    3. Incubeer de cellen gedurende 48 uur in de incubator.
    4. Verwijder het medium en behandel elk putje met 0,5 μL van 1 mM PP242 om een uiteindelijke verdunning van 1 μM te verkrijgen.
    5. Incubeer de cellen gedurende 2 uur in de incubator.

3. Fixeren en permeabiliseren van de cellen

  1. Bereid een 24-well plaat met koude methanol en een 6-well plaat met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 2mM KH2PO4). Houd ze op ijs.
  2. Neem elke coverslip met een pincet, was deze twee keer in PBS en incubeer gedurende 6 minuten in methanol.

4. De cellen blokkeren

  1. Was elke coverslip tweemaal in PBS en incubeer gedurende 1 uur in 10% foetaal runderserum in PBS (blokkeringsoplossing).
    OPMERKING: In deze stap wordt het protocol mogelijk gepauzeerd. De coverslips kunnen 's nachts in de koelkast in de blokkeeroplossing worden bewaard en het protocol kan de volgende dag worden voortgezet.

5. De coverslips incuberen met het primaire antilichaam

  1. Bereid een 1:1.000 oplossing van anti-LC3 in de blokkerende oplossing en houd deze op ijs.
  2. Plaats een stuk laboratoriumafdichtingsfolie over het deksel met meerdere putten.
  3. Plaats één druppel (25 μL) per afdekplaat anti-LC3-oplossing over de afdichtingsfilm.
  4. Neem elke coverslip met een pincet en plaats deze over de primaire antilichaamdruppel, zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing.
  5. Bereid een vochtige kamer voor door een vochtig stuk papier in een plastic doos met platte bodem te plaatsen.
  6. Plaats de multi-well plaat in de vochtigheidskamer, bedek deze met folie en incubeer een nacht in de koelkast.

6. De coverslips incuberen met het secundaire antilichaam

  1. Verwijder de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer en plaats de coverslips terug in de multi-well plaat.
  2. Voer drie wasbeurten uit met PBS.
  3. Bereid een oplossing van fluorescerend gelabeld anti-konijn met een verdunning van 1:800 in de blokkerende oplossing en houd deze op ijs beschermd tegen licht.
  4. Plaats een afdichtfoliestuk over het meerpotige deksel.
  5. Plaats een druppel (25 μL) per dekslip van anti-konijnenoplossing over de afdichtingsfolie.
  6. Neem elke coverslip met een pincet en plaats deze over de primaire antilichaamdruppel, zorg ervoor dat de celzijde in contact is met de oplossing.
  7. Incubeer de multi-well plaat in de vochtigheidskamer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT) beschermd tegen licht.

7. Kleuring van de cellen met 4′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)

  1. Verwijder de multi-well plaat uit de vochtigheidskamer en plaats de coverslips terug in de multi-well plaat.
  2. Voer drie wasbeurten uit met PBS.
  3. Bereid een 300 nM-oplossing van DAPI in PBS (beschermd tegen licht).
  4. Incubeer elke coverslip met de DAPI-oplossing gedurende 10 minuten.
  5. Voer drie wasbeurten uit met PBS. Behoud de multi-well plaat beschermd tegen licht.

8. Montage

  1. Maak twee bekers klaar met water en een stuk papier.
  2. Plaats één druppel (10 μL) per coverslip van een polyvinylalcohol-Bis(trimethylaluminum)-1,4-diazabicyclo[2.2.2]octaanadductoplossing (PVA-DABCO) op een dia.
    OPMERKING: PVA-DABCO wordt bereid door 0,25 M DABCO, 10% W/V PVA, 20% glycerol en 50% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8) te combineren in ultrapuur water.
  3. Neem elke dekslip met een pincet, was het in elk waterbekerglas, droog het af in het papier en plaats het over de PVA-DABCO-druppel (met de cellen in contact met de oplossing).
  4. Laat het een nacht drogen, beschermd tegen licht.

9. Confocale microscopie bekijken en beelden vastleggen

  1. Visualiseer de coverslips in een omgekeerde confocale microscoop met een objectief van ongeveer 63x17.
  2. Leg representatieve afbeeldingen van de gelabelde cellen vast.

10. Kwantificeren van de LC3-stippen

  1. Sleep elk afbeeldingsbestand met de vastgelegde kanalen, zoals ".czi", naar het ImageJ (FIJI) -scherm om te openen. Klik op OK in het dialoogvenster en sluit het consolevenster.
  2. Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie Kleur > Gesplitste kanalen.
  3. Sluit de afbeeldingen die overeenkomen met de andere kanalen dan de LC3-afbeelding.
  4. Selecteer op het tabblad Afbeelding de optie > kleurbalans aanpassen
  5. Verplaats de schuifregelaar Maximum naar links totdat de afbeelding verzadigd is om de celcontouren te visualiseren.
  6. Teken de celomtrek met het gereedschap Selectie uit de vrije hand .
  7. Klik op de knop Reset om de kleuraanpassing opnieuw in te stellen.
  8. Selecteer op het tabblad Bewerken de optie Knippen om het geselecteerde item te knippen.
  9. Sluit de afbeelding zonder deze op te slaan.
  10. Selecteer op het tabblad Bewerken de optie Plakken.
  11. Kies in het menu Analyseren het gereedschap 3D-objectenteller.
  12. Stel de drempel in. In het voorbeeld van deze studie is de drempel vastgesteld op 2.000.
  13. Stel het groottefilter in. In deze studie ligt het tussen de 50 en 500.
  14. Zorg ervoor dat de vakken Objecten en Samenvatting zijn gemarkeerd.
  15. Klik op Ok. Het aantal punten wordt beschreven als objecten gedetecteerd in de samenvatting.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematisch diagram van het LC3 immunofluorescentieprotocol. Schematisch diagram dat het algemene protocol voor LC3-immunofluorescentie weergeeft. Figuur gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol voert immunofluorescentie van LC3 uit in pancreascellijnen om de autofagieniveaus in verschillende omstandigheden te bepalen. Het resultaat van dit experiment was de obtentie van cellulaire beelden van de rode en blauwe kanalen, overeenkomend met LC3 en DAPI. De LC3-beelden geven de cellulaire verdeling van dit eiwit aan, terwijl de DAPI de nucleaire lokalisatie toont. Figuur 2A toont een representatief beeld van de immunofluorescentie van LC3 en de samensmelting met DAPI-kleuri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om de endogene LC3-verdeling in de cel te visualiseren en de autofagische niveaus onder verschillende omstandigheden te kwantificeren. Een andere vergelijkbare methode die wordt gebruikt om de LC3-verdeling te analyseren en autofagie-activering te bepalen, omvat fluorescentie-gelabelde LC3-transfectie (zoals RFP-LC3)19. RFP-LC3-transfectie heeft de voordelen dat er geen fixatie nodig is (waardoor deze methode kan worden toegepast ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werden geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Universiteit van Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), de Nationale Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek en Technologie (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; en PUE 22920170100033) en het Nationaal Agentschap voor Wetenschappelijke en Technologische Promotie (PICT 2019-01664).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Corning46-013-CM
12 mm ronde dekglasjesHDACBR_OBJ_6467
24 Wel- Cel Cultuur PlaatSorfa220300
Absoluut ethanolBiopack2207.10.00
Alexa Fluor 594 Ezel anti-konijn IgG (H+L)InvitrogenR37119
Confocal Laser Scanning MicroscoopZeissLSM 800
DexamethasonSigma AldrichD4902
DMENSartorius01-052-1A
Foetaal RunderserumNATOCOR Lintc-634
GemcitabinaEli LillyVL7502
LC3B (D11) XP Konijn mAbCell Signaling Technology3868S
MethanolAnedra6197
Parafilm "M" (Laboratorium Afdichtingsfolie)Bemis/CurwoodPM-996
Pen-Strep OplossingSartorius03-031-1B
PP242Santa Cruz BiotechnologySC-301606
Trypsine EDTAGibco11570626

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
  2. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36 (13), 1811-1836 (2017).
  3. Kitada, M., Koya, D. Autophagy in metabolic disease and ageing. Nature Reviews Endocrinology. 17 (11), 647-661 (2021).
  4. Ktistakis, N. T., Tooze, S. A. Digesting the expanding mechanisms of autophagy. Trends in Cell Biology. 26 (8), 624-635 (2016).
  5. Tanida, I., Ueno, T., Kominami, E. LC3 and autophagy. Methods in Molecular Biology. 445, 77-88 (2008).
  6. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO Journal. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  7. Mizushima, N., Yoshimori, T. How to interpret LC3 immunoblotting. Autophagy. 3 (6), 542-545 (2007).
  8. Vanasco, V., et al. Mitochondrial dynamics and VMP1-related selective mitophagy in experimental acute pancreatitis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 640094(2021).
  9. Williams, J. A. Regulatory mechanisms in pancreas and salivary acini. Annual Review of Physiology. 46, 361-375 (1984).
  10. Mizrahi, J. D., Surana, R., Valle, J. W., Shroff, R. T. Pancreatic cancer. Lancet. 395 (10242), 2008-2020 (2020).
  11. Li, J., et al. Regulation and function of autophagy in pancreatic cancer. Autophagy. 17 (11), 3275-3296 (2021).
  12. Ropolo, A., et al. A novel E2F1-EP300-VMP1 pathway mediates gemcitabine-induced autophagy in pancreatic cancer cells carrying oncogenic KRAS. Frontiers in Endocrinology. 11, 411(2020).
  13. Pardo, R., et al. Gemcitabine induces the VMP1-mediated autophagy pathway to promote apoptotic death in human pancreatic cancer cells. Pancreatology. 10 (1), 19-26 (2010).
  14. Logsdon, C. D., Moessner, J., Williams, J. A., Goldfine, I. D. Glucocorticoids increase amylase mRNA levels, secretory organelles, and secretion in pancreatic acinar AR42J cells. Journal of Cell Biology. 100 (4), 1200-1208 (1985).
  15. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1(2021).
  16. Segeritz, C. -P., Vallier, L. Chapter 9 - Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , Academic Press. Cambridge, MA. 151-172 (2017).
  17. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68(2020).
  18. Grasso, D., et al. a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 8308-8324 (2011).
  19. Ropolo, A., et al. The pancreatitis-induced vacuole membrane protein 1 triggers autophagy in mammalian cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (51), 37124-37133 (2007).
  20. Karanasios, E., Stapleton, E., Walker, S. A., Manifava, M., Ktistakis, N. T. Live cell imaging of early autophagy events: Omegasomes and beyond. Journal of Visualized Experiments. (77), e50484(2013).
  21. Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization. Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).
  22. Zhang, Z., Singh, R., Aschner, M. Methods for the detection of autophagy in mammalian cells. Current Protocols in Toxicology. 69, 1-26 (2016).
  23. Yoshii, S. R., Mizushima, N. Monitoring and measuring autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1865(2017).
  24. Betriu, N., Andreeva, A., Semino, C. E. Erlotinib promotes ligand-induced EGFR degradation in 3D but not 2D cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma cells. Cancers. 13 (18), 4504(2021).
  25. Wang, W., Dong, L., Zhao, B., Lu, J., Zhao, Y. E-cadherin is downregulated by microenvironmental changes in pancreatic cancer and induces EMT. Oncology Reports. 40 (3), 1641-1649 (2018).
  26. Kim, S. K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305(2020).
  27. Meng, Y., et al. Cytoplasmic EpCAM over-expression is associated with favorable clinical outcomes in pancreatic cancer patients with Hepatitis B virus negative infection. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (12), 22204-22216 (2015).
  28. Brock, R., Hamelers, I. H., Jovin, T. M. Comparison of fixation protocols for adherent cultured cells applied to a GFP fusion protein of the epidermal growth factor receptor. Cytometry. 35 (4), 353-362 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PANC 1 cellenAR42J cellenbehandeling met gemcitabineconfocale microscopie3D objectentellermethanolfixatieDAPI kleuring

Gerelateerde artikelen