Method Article

Monitoring Stub1-gemedieerde Pexofagie

DOI:

10.3791/65010

⸱

May 12th, 2023

 , 
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol geeft instructies voor het activeren en monitoren van Stub1-gemedieerde pexofagie in levende cellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoogdiercellen kunnen peroxisomen omkeren via Stub1-gemedieerde pexofagie. De route maakt mogelijk cellulaire controle van de kwantiteit en kwaliteit van peroxisomen mogelijk. Tijdens dit proces transloceren heat shock protein 70 en het ubiquitine E3 ligase, Stub1, op peroxisomen om te worden omgedraaid om pexofagie te initiëren. De Stub1 ligase-activiteit maakt de accumulatie van ubiquitine en andere autofagie-gerelateerde modules op gerichte peroxisomen mogelijk. Het verhogen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) niveaus binnen het peroxisomale lumen kan Stub1-gemedieerde pexofagie activeren. Men kan daarom kleurstof-ondersteunde ROS-generatie gebruiken om deze route te activeren en te monitoren. Dit artikel schetst de procedures voor het gebruik van twee klassen kleurstoffen, fluorescerende eiwitten en synthetische fluoroforen, om pexofagie in zoogdiercelculturen te initiëren. Deze op kleurstof ondersteunde ROS-generatie gebaseerde protocollen kunnen niet alleen worden gebruikt om alle peroxisomen binnen een celpopulatie wereldwijd aan te pakken, maar kunnen ook de manipulatie van individuele peroxisomen binnen afzonderlijke cellen mogelijk maken. We beschrijven ook hoe Stub1-gemedieerde pexofagie kan worden gevolgd met behulp van live-cell microscopie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroxisomen zijn enkelmembraangebonden organellen die aanwezig zijn in de meeste eukaryote cellen. Peroxisomen zijn een metabolisch compartiment dat essentieel is voor het uitvoeren van de bèta-oxidatie van vetzuren met een zeer lange keten, purinekatabolisme en etherfosfolipide- en galzuursynthese1. Peroxisoom-afgeleid acetyl-CoA regelt lipidehomeostase door de centrale signalering in metabolisme2 te reguleren. Daarom is het geen verrassing dat gecompromitteerde peroxisomale functies worden geïmpliceerd in verschillende ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, veroudering, kanker, obesit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van cellen die diKillerRed of zelflabelende eiwitten (SLPs) tot expressie brengen in het peroxisoomlumen

  1. Zaai de gewenste cellen op celkweekschalen met glazen bodem. Voor het experiment hier, zaad 2 x 105 menselijke SHSY5Y-cellen in 840 μL kweekmedium (DMEM / F-12 aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) of 6 x 104 muis NIH3T3-cellen in 840 μL kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% runderserum en 1% penicilline / streptomycine) op een 35 mm kweekschaal met een glazen microwell met een diameter van 20 mm.
    OPMERKING: Het aantal gezaaide cellen moet proportioneel worden aangepas....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier getoonde Stub1-gemedieerde pexofagie-inductieschema maakt gebruik van kleurstofondersteunde ROS-generatie binnen het peroxisoomlumen. Deze bewerking vereist minimale lichtintensiteiten. Peroxisomen die fluorescerende eiwitten of kleurstoffen bevatten, kunnen daarom worden verlicht met behulp van standaard laserscannende confocale microscopen. Focale verlichting leidt tot onmiddellijke en gelokaliseerde ROS-productie binnen individuele peroxisomen, zoals aangegeven door de fluorescerende reporter roGFP2-VKSKL (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe Stub1-gemedieerde pexofagie in celculturen kan worden geactiveerd door peroxisomale ROS-niveaus met licht te verhogen. Omdat het protocol afhankelijk is van kleurstof-geassisteerde ROS-generatie, moet men zorgen voor voldoende expressie van diKillerRed-VKSKL of kleurstof-gelabelde SLP-ligandkleuring in de cellen van belang. Gezien het feit dat verschillende celtypen of cellen met verschillende genetische achtergronden peroxisomen met enigszins verschillende eigenschappen kunnen bevatten, moet .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een MOST 111-2311-B-001-019-MY3 onderzoeksbeurs van de National Science and Technology Council in Taiwan.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell MatTekP35G-1.5-20-C20 mm glass bottomed
3-amino-1,2,4-triazole (3-AT)Sigma AldrichA8056
bovine serumThermoFisher Scientific16170060
Cell culture incubatorNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia Sinicamade by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70Academia SinicaHsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicagenerated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1
EGFP-Stub1Academia Sinicagenerated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal bovine serumThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligand PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Inverted Confocal Microscope OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000 ThermoFisher Scientific11668transfection reagent
NIH3T3 cellATCCCRL-1658adherent
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850reduced serum media
penicillin/streptomycinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinicagenerated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1
SHSY5Y cellATCCCRL-2266adherent

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stub1 Mediated PexophagyPeroxisome TurnoverReactive Oxygen SpeciesDye Assisted ROS GenerationUbiquitin E3 LigaseLive Cell MicroscopyFluorescent ProteinsSynthetic FluorophoresAutophagy AdaptersConfocal Microscopy

Related Articles