$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dieren zijn zeer complexe systemen die zijn samengesteld uit honderden verschillende celtypen, georganiseerd in tientallen verschillende weefsels en organen. Het bestuderen van hoe groepen cellen met elkaar en hun omgeving interageren tijdens de embryonale ontwikkeling geeft ons niet alleen een beter begrip van hoe volwassen lichamen zijn opgebouwd, maar kan ook de moleculaire en cellulaire grondslagen van ziekten en aangeboren afwijkingen onthullen. Bepaalde modelsystemen zijn beter geschikt voor het beantwoorden van specifieke biologische vragen dan andere, en wetenschappers gebruiken een breed scala aan soorten en experimentele technieken om de volledige diversiteit van organismische biologie te onderzoeken. Een gegeven experiment in de ontwikkelingsbiologie kan bijvoorbeeld genetische manipulatie, dierdissisectie, moleculaire biologie, biochemie en hoge-resolutiemicroscopie omvatten. Dergelijke methoden kunnen uitdagend zijn om te reproduceren op basis van alleen geschreven beschrijvingen en figuren, en daarom is het belangrijk om ze in videovorm te documenteren om de verspreiding van de juiste techniek en analysemethoden te bevorderen.
De relatie tussen ontwikkelingsmechanismen en regeneratie, met name in het zenuwstelsel, is een gebied van intensief onderzoek, en de zebravis, Danio rerio, is een sleutelmodel op dit gebied geworden vanwege zijn levenslange groei en regeneratieve capaciteiten. Opmerkelijk is dat er een complexe interactie is tussen cellen in het netvlies en het optische tectum, en deze interactie is noodzakelijk voor het tot stand brengen van de juiste verbindingen wanneer nieuwe neuronen aan de ogen en hersenen worden toegevoegd1. Hagen et al. beschrijven een techniek voor het karakteriseren van hoe neurale groei en ontwikkeling worden beïnvloed door denervatie na oogverwijdering bij levende zebravis-embryo's2. Ze beschrijven in detail hoe 1) oogverwijderingschirurgie wordt uitgevoerd, 2) larven worden gekweekt na de operatie, 3) de hersenmonsters worden gefixeerd, gedissecteerd en opgeslagen, 4) immunofluorescentie wordt uitgevoerd, en 5) de monsters correct worden gemonteerd en afgebeeld. Deze techniek kan worden gebruikt om een breed scala aan neuro-ontwikkelingsprocessen in vaste weefsels te bestuderen, en kan ook worden aangepast voor experimenten in levende embryo's.
Neurale crestcellen (NCC's) vertegenwoordigen een belangrijke ontwikkelingslijn die aanleiding geeft tot pigmentcellen, kraakbeen, bot, gladde spieren, neuronen en gliacellen, en deze cellen zijn betrokken bij vele soorten aangeboren afwijkingen3. Naast hun indrukwekkende pluripotentie ondergaan NCC's ook een epitheel-naar-mesenchym overgang gevolgd door uitgebreide migratie tijdens de ontwikkeling, waardoor ze een fascinerend paradigma zijn voor het begrijpen van de interactie tussen celbestemming en morfologie4. Kippenembryo's zijn een krachtig systeem voor het bestuderen van NCC-biologie, omdat NCC's kunnen worden gevisualiseerd in vivo en gekweekt ex vivo, waardoor ze veel soorten moleculaire behandelingen mogelijk maken die moeilijk zijn met andere systemen. Jacques-Fricke et al. beschrijven een flexibele methode voor het kweken van craniale neurale plooien om primaire NCC-culturen op fibronectine-gecoate dekglasjes te genereren, die vervolgens kunnen worden gevolgd door vaste-beelden of live-beelden experimenten5. Ze beschrijven hoe 1) de embryo's worden geïncubeerd en geïsoleerd, 2) de neurale plooien worden gedissecteerd en geplateerd, 3) de NCC's worden gefixeerd en gekleurd, en 4) de NCC-morfologie wordt gekwantificeerd en geanalyseerd.
De basale membraan—een extracellulaire matrix die langs het basale oppervlak van epitheliale cellen wordt gegenereerd—is cruciaal voor het tot stand komen van weefselmorfologie en orgaanfunctie bij dieren6. Het Drosophila folliculaire epitheel, dat de vormende ei omringt, is een uitstekend model voor het bestuderen van hoe basale membranen worden gevormd, omdat het alle belangrijke geconserveerde componenten van het basale membraan afscheidt7, en het matrix is georiënteerd naar de “buitenkant” van de eicellen, waardoor microscopie-gebaseerde analyses worden vergemakkelijkt8. Shah en Devergne beschrijven het gebruik van een van de meest populaire soorten superresolutiemicroscopie—Airyscan—om te onderzoeken hoe vesiculaire verkeer de vorming van basale membranen beïnvloedt9. Ze laten zien hoe 1) Drosophila ovaria worden verzameld en gefixeerd, 2) immunofluorescentie wordt uitgevoerd, 3) de monsters correct worden gemonteerd, en 4) hoogwaardige superresolutiegegevens worden vastgelegd voor driedimensionale analyse. We merken op dat dit artikel een uiterst nuttige en beknopte tutorial bevat over de juiste verwerving van niet-verzadigde, driedimensionale confocale datasets, wat van algemeen belang zou moeten zijn voor iedereen die fluorescentiebeelden wil kwantificeren.
Terwijl microscoopgebaseerde superresolutietechnologieën (bijv. STED, SIM en Airyscan)10 steeds gebruikelijker worden, zijn ze duurder dan standaard confocale microscopen en niet voor alle onderzoekers beschikbaar. Een alternatieve techniek voor het verkrijgen van superresolutiebeelden is expansiemicroscopie (ExM), die de fysieke uitbreiding van een biologisch monster in drie dimensies omvat door het in te bedden en te binden aan een zwellend hydrogel11. De uitgebreide monsters kunnen vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van een standaard confocale microscoop om afbeeldingen te genereren met een laterale resolutie in de orde van tientallen nanometer, die concurreert met andere soorten superresolutiemicroscopie12. Onze groep beschrijft hoe ExM kan worden geïmplementeerd in