Dit artikel presenteert de methodologie voor het verkrijgen en beoordelen van vasculaire calcificatie door het isoleren van muriene aorta's gevolgd door het extraheren van verkalkte extracellulaire blaasjes om het mineralisatiepotentieel te observeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld en vasculaire verkalking is de belangrijkste voorspeller van cardiovasculaire gebeurtenissen; Er zijn momenteel echter geen behandelings- of therapeutische opties voor vasculaire calcificatie. Verkalking begint in gespecialiseerde extracellulaire blaasjes (EV's), die dienen als kernhaarden door calcium- en fosfaationen te aggregeren. Dit protocol beschrijft methoden voor het verkrijgen en beoordelen van verkalking in muriene aortas en het analyseren van de bijbehorende geëxtraheerde EV's. Eerst wordt grove dissectie van de muis uitgevoerd om relevante organen te verzamelen, zoals de nieren, lever en longen. Vervolgens wordt de muriene aorta geïsoleerd en weggesneden van de aortawortel naar de dijbeenslagader. Twee tot drie aorta's worden vervolgens samengevoegd en geïncubeerd in een spijsverteringsoplossing voordat ze ultracentrifugatie ondergaan om de EV's van belang te isoleren. Vervolgens wordt het mineralisatiepotentieel van de EV's bepaald door incubatie in een fosfaatrijke oplossing en het meten van de lichtabsorptie bij een golflengte van 340 nm. Ten slotte worden collageenhydrogels gebruikt om de verkalkte minerale vorming en rijping geproduceerd door de EV's in vitro te observeren.
Inleiding
Verkalking is de belangrijkste voorspeller van sterfte en morbiditeit van hart- en vaatziekten1. Verkalking verandert de slagaderwandmechanica door de opbouw van calcium- en fosfaatmineralen2. Bij atherosclerose kan verkalking lokale stress verergeren en resulteren in plaqueruptuur, wat de belangrijkste oorzaak is van hartaanvallen. Mediale verkalking - vaak als gevolg van chronische nierziekte - is wijdverspreider en leidt tot significante arteriële verstijving, disfunctie en cardiale overbelasting 2,3. Momenteel zijn er geen therapeutische opties voor de behand....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het in vivo werk werd goedgekeurd en gecontroleerd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Florida International University en voldeed aan de huidige richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH). Voor dit protocol verschilt de procedure niet afhankelijk van de stam, het gewicht, de leeftijd en het geslacht van de muis. Het type verkalking dat wordt bestudeerd, diëten en behandelingen kunnen de duur van het onderzoek en het gewicht van de gebruikte muis veranderen en kunnen afhankelijk zijn van een specifieke stam en geslacht van de muis die in het onderzoek wordt gebruikt. Voor dit protocol werden zowel mannelijke als vrou....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zodra de aorta's zijn geëxtraheerd, toont beeldvorming met behulp van een nabij-infrarode optische scanner een visuele weergave van de aorta en de vasculaire verkalking (figuur 1). De pixelintensiteitswaarden in de gescande fluorescerende afbeelding vertegenwoordigen de verdeling van verkalking en worden hier weergegeven met behulp van een gekleurde heatmap. Kwantificeringsmethoden omvatten het identificeren van een positieve drempel en het rapporteren van het procentuele gebied van de aorta.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bij het uitvoeren van het protocol is het belangrijk om de kritieke stappen voor het verkrijgen van succesvolle resultaten te noteren. Tijdens de isolatie van de murine aorta is het van vitaal belang dat de perfusie goed wordt uitgevoerd. Bij het injecteren van de PBS moet ervoor worden gezorgd dat de rechterkamer niet wordt doorboord. Dit zou ervoor zorgen dat de vloeistof rechtstreeks uit de ventrikel lekt en niet door de longen circuleert, waardoor bloed in de aorta achterblijft. Zodra de perfusie goed is uitgevoerd e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health (NIH) (1R01HL160740 en 5 T32GM132054-04) en de Florida Heart Research Foundation. We willen Kassandra Gomez bedanken voor haar hulp bij het synthetiseren en in beeld brengen van de hydrogels.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 8-well chambered coverglass | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inch Needle | BD | 305175 | |
| Collagen, High Concentraion, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| Curved Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| Dissection Dish | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| Dissection Pan and Wax | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade) | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Protease Inhibitor | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potassium Chloride | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodium Chloride | Fischer Chemical | BP358 | |
| Sodium Hydroxide | Thermo Scientific | A4782602 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX Multimode Reader | Agilent | ||
| Tissue culture plate, 96-well | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| Tris Hydrochloride | Fischer Chemical | BP153 |
Referenties
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78(2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Media....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
