Analyse van extracellulaire vesicle-gemedieerde vasculaire calcificatie met behulp van in vitro en in vivo modellen

Samenvatting

Dit artikel presenteert de methodologie voor het verkrijgen en beoordelen van vasculaire calcificatie door het isoleren van muriene aorta's gevolgd door het extraheren van verkalkte extracellulaire blaasjes om het mineralisatiepotentieel te observeren.

Samenvatting

Hart- en vaatziekten zijn de belangrijkste doodsoorzaak in de wereld en vasculaire verkalking is de belangrijkste voorspeller van cardiovasculaire gebeurtenissen; Er zijn momenteel echter geen behandelings- of therapeutische opties voor vasculaire calcificatie. Verkalking begint in gespecialiseerde extracellulaire blaasjes (EV's), die dienen als kernhaarden door calcium- en fosfaationen te aggregeren. Dit protocol beschrijft methoden voor het verkrijgen en beoordelen van verkalking in muriene aortas en het analyseren van de bijbehorende geëxtraheerde EV's. Eerst wordt grove dissectie van de muis uitgevoerd om relevante organen te verzamelen, zoals de nieren, lever en longen. Vervolgens wordt de muriene aorta geïsoleerd en weggesneden van de aortawortel naar de dijbeenslagader. Twee tot drie aorta's worden vervolgens samengevoegd en geïncubeerd in een spijsverteringsoplossing voordat ze ultracentrifugatie ondergaan om de EV's van belang te isoleren. Vervolgens wordt het mineralisatiepotentieel van de EV's bepaald door incubatie in een fosfaatrijke oplossing en het meten van de lichtabsorptie bij een golflengte van 340 nm. Ten slotte worden collageenhydrogels gebruikt om de verkalkte minerale vorming en rijping geproduceerd door de EV's in vitro te observeren.

Inleiding

Verkalking is de belangrijkste voorspeller van sterfte en morbiditeit van hart- en vaatziekten¹. Verkalking verandert de slagaderwandmechanica door de opbouw van calcium- en fosfaatmineralen². Bij atherosclerose kan verkalking lokale stress verergeren en resulteren in plaqueruptuur, wat de belangrijkste oorzaak is van hartaanvallen. Mediale verkalking - vaak als gevolg van chronische nierziekte - is wijdverspreider en leidt tot significante arteriële verstijving, disfunctie en cardiale overbelasting ^2,3. Momenteel zijn er geen therapeutische opties voor de behandeling of preventie van vasculaire calcificatie.

Vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) nemen een osteoblastachtig fenotype aan en geven verkalkende extracellulaire blaasjes (EV's) af die ontluikende mineralen nucleeren, waardoor verkalking wordt aangedreven ^4,5,6. Dit proces lijkt op de fysiologische mineralisatie van osteoblasten in bot⁷. Hoewel het eindpunt van mineralisatie vergelijkbaar is in de vaatwand- en botmatrix, verschillen de mechanismen waardoor de verkalkende EV's ontstaan in de twee weefsels⁸. Er zijn veel soorten modellen die worden gebruikt om vasculaire calcificatie te bestuderen. In vitro bootsen celkweekmodellen de osteogene overgang van VSMC's en de daaropvolgende mineraalvorming na met gespecialiseerde media.

Bij het bestuderen van in vivo verkalking hangt het gebruikte model af van het type verkalking dat wordt bestudeerd. Hyperlipidemische muismodellen worden vaak gebruikt om atherosclerotische verkalking te bestuderen, die meer focaal lijkt binnen lipidenrijke plaques⁹. Mediale verkalking is daarentegen wijdverspreider in de vasculatuur en wordt vaak bestudeerd met behulp van chronische nierziektemodellen die een adeninerijk dieetregime gebruiken om nierfalen te induceren of chirurgische technieken om aanzienlijke delen van de nieren te verwijderen^10,11. Agressieve modellen van vasculaire calcificatie hebben een combinatie van zowel hyperlipidemische als chronische nierziektemodellen^{gebruikt 12}. Dit protocol biedt een methode voor het beoordelen van vasculaire calcificatie in muriene aortas voor zowel mediale als atherosclerotische calcificatie, het extraheren van EV's uit de aortawand en het observeren van het mineralisatiepotentieel in de EV's verkregen uit in vitro celkweekmodellen. Toekomstige studies kunnen deze procedures gebruiken in mechanistische analyses van vasculaire calcificatie en om potentiële therapeutische interventies te beoordelen.

Protocol

Het in vivo werk werd goedgekeurd en gecontroleerd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Florida International University en voldeed aan de huidige richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH). Voor dit protocol verschilt de procedure niet afhankelijk van de stam, het gewicht, de leeftijd en het geslacht van de muis. Het type verkalking dat wordt bestudeerd, diëten en behandelingen kunnen de duur van het onderzoek en het gewicht van de gebruikte muis veranderen en kunnen afhankelijk zijn van een specifieke stam en geslacht van de muis die in het onderzoek wordt gebruikt. Voor dit protocol werden zowel mannelijke als vrouwelijke C57BL/6J-muizen gebruikt en kregen ze een verkalkingsdieet. De muizen werden geofferd tussen de 20 weken en 24 weken oud.

1. Isolatie en excisie van de aorta

1. Fluorescerende markers
   1. Achtenveertig uur voor euthanasie injecteert u de muizen met 20 μM OsteoSense 680, een fluorescerend beeldvormingsmiddel, in de aanbevolen dosis van 100 μL per 25 g via een intraveneuze injectie.
   2. Plaats onder de zuurkast een piepschuimplaat met vier t-pinnen, een emmer bekleed met een papieren handdoek, een buis van 50 ml gevuld met een papieren handdoek, een microcentrifugebuis van 1,5 ml, dissectiegereedschappen (zie de materiaaltabel) en ethanol in een spuitfles. Plaats bekers met PBS op ijs.
2. Bloedafname
   1. Voeg 2 ml isofluraan toe aan een conische buis van 50 ml gevuld met het keukenpapier. Plaats de buis in de emmer en sluit deze met het deksel.
      LET OP: Isofluraan moet worden behandeld in een goed geventileerde ruimte zonder recirculatie van uitlaatlucht vanwege de toxiciteit van kortdurende blootstelling.
   2. Breng één muis tegelijk in de emmer. Eenmaal verdoofd, plaatst u de muis op het keukenpapier in de dorsale positie. Houd de muis vast met de palm van de niet-dominante hand en plaats de oren terug met de duim en wijsvinger.
   3. Snijd met het pincet een van de ogen weg. Houd de muis boven de buis van 1,5 ml om te beginnen met bloedafname, waarbij 1 ml bloed moet worden verzameld. Zodra het bloed stopt met weglopen, plaatst u de muis terug in de emmer voor verdere sedatie.
3. Euthanasie
   1. Leg een papieren handdoek op de snijmat. Zodra de muis is verdoofd, plaatst u de muis op de mat in rugligging. Bevestig de muis in rugligging met behulp van een t-pin om elke ledemaat vast te houden.
   2. Spuit de buik van de muis in met alcohol. Til met het pincet de huid op de borststreek op. Knip met de schaar de mediale lijn in de thoracale holte. Zodra het borstbeen in het midden is gesneden, snijdt u het diafragma aan weerszijden van de ribbenkast af.
   3. Snijd indien nodig het frontale deel van de ribbenkast weg om het hart en de longen bloot te leggen.
4. Orgaanverwijdering
   1. Til met een pincet de huid op en maak een incisie langs de middellijn. Verwijder overtollige huid of vet. Verwijder de voortplantingsorganen en blaas, evenals vet buiten de middellijn.
   2. Verplaats de gastro-intestinale (GI) organen naar de rechterkant en volg de darmen in de middellijn. Eenmaal gevonden, til je de middellijn op en snijd je het maagdarmkanaal weg tot aan de maag.
   3. Snijd de nieren weg door ze weg te tillen van de middellijn. Snijd zo dicht mogelijk bij de nier.
   4. Begin vervolgens met het verwijderen van de lever door de lobben op te tillen en weg te snijden van de middellijn.
   5. Perfuseer het hart en de aorta. Injecteer met een spuit van 10 ml koude PBS in de rechterkamer. Wacht tot de longen zijn opgeblazen en wit worden. Verwijder de longen, evenals een overtollig middenrif of ribbenkast.
5. Botverwijdering
   1. Open een schaar wijd en plaats ze op het onderste deel van de muis boven de staart. Snijd naar beneden en begin met het optillen van de wervelkolom van de huid. Verwijder het vet van de zijkanten van de middellijn. Zodra de huid is losgemaakt, snijdt u de wervelkolom en intacte organen weg door recht boven het hart te snijden. Als u naar een stereoscoop transporteert, plaatst u de wervelkolom en intacte organen in een bekerglas PBS in de ijsemmer.
   2. Beweeg de wervelkolom en organen in de ontleedschaal. Vul met ijskoude PBS. Pin de wervelkolom en ribbenkast vast met behulp van naalden.
   3. Gebruik onder de dissectiemicroscoop een pincet om het hart voorzichtig op te tillen en begin boven de wervelkolom en onder de aorta te snijden. Ga hiermee door totdat de onderkant van de wervelkolom is bereikt. Verwijder de wervelkolom uit de ontleedschaal en pin het hart en eventuele vreemde vetten of spieren vast.
6. Microdissectie
   1. Beginnend bij het gebied direct onder het hart, identificeer de drie buisvormige structuren: de slokdarm, vena cava en aorta. Verwijder de slokdarm en vena cava om een duidelijk gezichtsveld van de aorta te hebben.
   2. Gebruik de microdissectietang en schaar om het vetweefsel op te tillen en zo dicht mogelijk bij de aorta te snijden. Zorg ervoor dat u de aorta niet snijdt. Ga hiermee door langs de mediale lijn totdat alle aorta en de dijbeenslagaders blootliggen.
   3. Verwijder in het hart al het vetweefsel en leg de drie takken bij de aortaboog bloot. Verwijder de aortawortel uit de linker ventrikel door de microdissectieschaar in de linker ventrikel in te brengen en de spier rond de aorta door te snijden.
   4. Zodra de aorta is geïsoleerd en gereinigd, beeldt u de aorta af met behulp van een nabij-infraroodscanner om vasculaire verkalking te visualiseren.
   5. Gebruik het aangepaste MATLAB-script (Supplemental File 1) om het totale signaal van de calciumtracer te kwantificeren, dat is genormaliseerd naar het totale gescande aortagebied. Het MATLAB-script functioneert met behulp van de Bioinformatics toolbox add-in. MATLAB wordt eerst naar de locatie van de TIFF-bestanden geleid vanuit de nabij-infraroodscan van de aorta's, de afzonderlijke bestanden worden vervolgens geopend en de pixelintensiteitswaarden worden uit de TIFF-bestanden geëxtraheerd.
      1. Zodra de afbeelding aan de gebruiker is gepresenteerd met een kleurenkaart, selecteert u de aorta met de grootste verkalking als de maximale schaal.
      2. Wanneer MATLAB vraagt "Hoeveel exemplaren zijn er in de afbeelding?" in het opdrachtvenster, voert u het aantal aorta's in de huidige afbeelding in en selecteert u elke aorta één voor één. Zodra een aorta is geselecteerd, maakt MATLAB een binaire afbeelding met een masker van de totale oppervlakte van de aorta en een andere binaire afbeelding met een masker van het verkalkte gebied van de aorta. De waarden van deze gemaskeerde beelden worden vervolgens gebruikt om het totale verkalkte gebied, de totale oppervlakte van de aorta, het percentage positieve verkalkingsgebieden en de gemiddelde intensiteit van het verkalkte gebied te bepalen.
      3. Als u een aorta wilt selecteren, maakt u een vak rond de aorta van belang op de meest recente afbeelding op het scherm door vier hoeken te selecteren met één linkerklik en een vak rond de afbeelding te maken. Om het vak te sluiten, dubbelklikt u op de eerste hoek.
         OPMERKING: De drempel kan verschillen, afhankelijk van het gebruikte verkalkingsmodel. Het is aan de gebruiker om te bepalen welke waarde een positief signaal voor vasculaire verkalking bepaalt. Zodra de drempel voor een experiment is ingesteld, moet deze gedurende de gehele duur van het experiment hetzelfde blijven.
   6. Zodra de kwantitatieve gegevens zijn geëxtraheerd, voert u een eenrichtings-ANOVA uit met de post-hoctest van Tukey om de significantie tussen de groepen aan te tonen.

2. Isoleren en extraheren van EV's uit aorta's

OPMERKING: Zodra de aorta's zijn geïsoleerd en verwijderd, kunnen EV's uit het weefsel worden geëxtraheerd. Met behulp van een spijsverteringsoplossing en meerdere centrifugecycli kunnen EV's worden verzameld en gebruikt voor veel verschillende technieken, waaronder verkalkingstests, gel-elektroforese en immunoblotting¹³. Het protocol voor het isoleren en extraheren van EV's is als volgt:

1. Onmiddellijk na het scannen van de aorta's, pool twee tot drie aorta's om een voldoende eiwitconcentratie te verkrijgen.
2. Bereid een spijsverteringsoplossing met 0,25 M sucrose, 0,12 M natriumchloride (NaCl), 0,01 M kaliumchloride (KCl), 0,02 M Trishydrochloride en 600 E/ml collagenase¹³.
3. Incubeer twee tot drie gepoolde aorta's in 1,5 ml spijsverteringsoplossing gedurende 2 uur bij 37 °C. Verzamel de oplossing. Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 1.000 × g om celresten te verwijderen.
4. Centrifugeer het supernatant gedurende nog eens 30 minuten bij 33.000 × g om microvesicles te verwijderen. Verzamel en beoordeel het supernatant op verkalkingspotentieel (zie rubriek 3).
   OPMERKING: Volg de volgende stappen als gel-elektroforese en eiwitimmunoblotting van de EV's moeten worden uitgevoerd.
5. Ultracentrifugeer het supernatant gedurende 1 uur op 100.000 × g om de interessante EV's te isoleren.
6. Terwijl het supernatant ultracentrifugatie ondergaat, bereidt u RIPA-lysis en extractiebuffer voor (zie de tabel met materialen) door de proteaseremmer en vortexing toe te voegen totdat deze is opgelost.
7. Zodra de ultracentrifugatie is voltooid, zuigt u het supernatant op en laat u de pellet achter, die de EV's bevat. Suspensie van de pellet in het bereide RIPA-lysis- en proteaseremmermengsel. De monsters zijn klaar voor gel-elektroforese en western blotting.

3. Beoordeling van het verkalkingspotentieel van extracellulaire blaasjes met lichtverstrooiingsabsorptie

OPMERKING: Om de real-time minerale vorming van EV's te meten, gebruikten we een test die oorspronkelijk was ontwikkeld om de vorming van mineralen uit groeischijfkraakbeen EV's uit celcultuur¹⁴ te bestuderen. Aangezien calciumfosfaatdepositie het kenmerk is van verkalking, is een toename van de lichtverstrooiingsabsorptie als gevolg van de vorming van calciumfosfaatverbindingen indicatief voor het verkalkingspotentieel¹⁴. In vitro VSMC-modellen zijn handig voor het meten van het verkalkingspotentieel van EV's. Bij deze techniek kan een plaatlezer met een filter met een korte golflengte de in vitro verkalking van EV's kwantificeren. De absorptievermogensmeting wordt geregistreerd bij 340 nm en een hogere absorptie is indicatief voor meer calciumfosfaatmineraalvorming. Het protocol voor de lichtverstrooiingsabsorptietest is als volgt:

1. Centrifugeer het geconditioneerde verzamelde medium van VSMC's bij 1.000 × g gedurende 5 minuten om celresten te verwijderen¹⁴.
2. Centrifugeer het supernatant gedurende 30 minuten op 33.000 × g , verzamel het supernatant en breng het over in een nieuwe buis.
   OPMERKING: De aanwezigheid van EV's in het verzamelde supernatant kan worden bevestigd door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS) of nanodeeltjesvolganalyse (NTA)
3. Bereid een 300 mM natriumfosfaat monobasisch (NaH₂PO₄) steriele oplossing. Filter de oplossing indien nodig om steriele omstandigheden te garanderen.
4. Voeg 1% (v/v) 300 mM NaH₂PO₄ toe aan de EV-monsters en pipetteer voorzichtig de oplossing om goed te mengen. Breng 200 μL van de mengseloplossing over in een plaat met 96 putten. Incubeer de 96-putplaat in de microplaatlezer bij 37 °C.
5. Stel de plaatlezer in om de absorptie elke 1 minuut op te nemen bij een golflengte van 340 nm.

4. Beoordeling van de verkalkingsmineraalvorming van extracellulaire blaasjes met collageenhydrogels

OPMERKING: De aggregatie van EV's en de vorming van microcalcificaties worden waargenomen door collageenhydrogels. Deze hydrogels fungeren als een steiger die de collageendichtheid nabootst die in vivo^{is waargenomen 15}. Dit toont het effect van collageen op de groei van verkalking. Het protocol voor het beoordelen van de minerale vorming van EV's in hydrogels is als volgt:

1. Dag 1
   1. Bereid een collageenoplossing van 2,5 mg/ml in DMEM. Voeg langzaam 5 M natriumhydroxide toe aan het collageen/DMEM-mengsel totdat de kleur rood wordt. Controleer of de pH van de oplossing ongeveer 7 is.
      OPMERKING: Als de oplossing paars wordt en te eenvoudig wordt, start u het proces opnieuw.
   2. Pipetteer 300 μL van de 2,5 mg/ml collageenoplossing met een pH van 7 in elke put van een 8-well kamerglas. Incubeer bij 37 °C en 5% CO₂ gecontroleerde vochtigheid gedurende 72 uur.
2. Dag 4
   1. Voeg 300 μL DMEM als controle toe aan de putten.
   2. Voeg 300 μL van de eerder verzamelde EV-mediummonsters toe aan de resterende putten.
   3. Incubeer bij 37 °C en 5% CO₂ gecontroleerde luchtvochtigheid gedurende 6 dagen.
3. Dag 10
   1. Bereid 2,5 μL Osteosense 680EX met 22,5 μL DMEM.
   2. Pipetteer 2,5 μL van het Osteosense en DMEM mengsel in elk putje. Incubeer bij 37 °C en 5% CO₂ gecontroleerde vochtigheid gedurende 24 uur.
4. Dag 11
   1. Stel de hydrogels voor met filters die geschikt zijn voor Osteosense fluorescentie. Beeld ze af via de onderkant van een afdekglaskamer met behulp van een omgekeerde microscoop of vanaf de bovenkant met een lange werkafstandsobjectief.
   2. Beoordeel het aantal verkalkingen en de verkalkingsgrootte in de verzamelde afbeeldingen met behulp van de deeltjesanalyse-opties die beschikbaar zijn in ImageJ.
      1. Gebruik de afbeelding | Aanpassen | Threshold-opdracht om de afbeeldingen zodanig te binariseren dat alleen het Osteosense-signaal wit lijkt. Gebruik de Analyze | Analyseer deeltjes opdracht om informatie te verkrijgen voor elke verkalking in de afbeelding. Zorg ervoor dat u dezelfde drempelparameters gebruikt voor elke afbeelding die is geanalyseerd op consistentie.

Resultaten

Zodra de aorta's zijn geëxtraheerd, toont beeldvorming met behulp van een nabij-infrarode optische scanner een visuele weergave van de aorta en de vasculaire verkalking (figuur 1). De pixelintensiteitswaarden in de gescande fluorescerende afbeelding vertegenwoordigen de verdeling van verkalking en worden hier weergegeven met behulp van een gekleurde heatmap. Kwantificeringsmethoden omvatten het identificeren van een positieve drempel en het rapporteren van het procentuele gebied van de aorta...

Discussie

Bij het uitvoeren van het protocol is het belangrijk om de kritieke stappen voor het verkrijgen van succesvolle resultaten te noteren. Tijdens de isolatie van de murine aorta is het van vitaal belang dat de perfusie goed wordt uitgevoerd. Bij het injecteren van de PBS moet ervoor worden gezorgd dat de rechterkamer niet wordt doorboord. Dit zou ervoor zorgen dat de vloeistof rechtstreeks uit de ventrikel lekt en niet door de longen circuleert, waardoor bloed in de aorta achterblijft. Zodra de perfusie goed is uitgevoerd e...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
8-well chambered coverglass	Thermo Scientific	155409PK
10 mL Syringe	BD	302995
20 G 1 inch Needle	BD	305175
Collagen, High Concentraion, Rat Tail	Corning	354249
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004174
Curved Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-8254
Dissection Dish	Living Systems Instrumentation	DD-90-S
Dissection Pan and Wax	United Scientific Supplies	DSPA01-W
DMEM	Cytiva	SH30022.FS
Isoflurane	Sigma-Aldrich	26675-46-7
LI-COR Odyssey	LI-COR	DLx
Micro Dissecting Curved Scissors (24 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5913
Micro Dissecting Spring Scissors (13 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5677
Micro Dissecting Spring Scissors (5 mm Blade)	Roboz Surgical Instrument	RS-5600
Micro Dissecting Tweezers (0.10 x 0.06 mm Tip)	Roboz Surgical Instrument	RS-4976
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	B11229
OsteoSense 680EX	Perkin Elmer	NEV10020EX
Pierce Protease Inhibitor	Thermo Scientific	A32963
Potassium Chloride	Fischer Chemical	P217
RIPA Lysis and Extraction Buffer	G Biosciences	786-489
Sodium Chloride	Fischer Chemical	BP358
Sodium Hydroxide	Thermo Scientific	A4782602
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S0751
Sucrose	Sigma	S7903
Synergy HTX Multimode Reader	Agilent
Tissue culture plate, 96-well	Thermo Fisher	167008
T-Pins	United Scientific Supplies	TPIN02-PK/100
Tris Hydrochloride	Fischer Chemical	BP153