Methodenartikel

Celvrije expressiesystemen: productiemethoden en gebruik

393 weergaven

⸱

28 juli 2023

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

In dit artikel

Samenvatting

BESPREKTE ARTIKELEN:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE celvrij systeem. Journal of Visualized Experiments. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. Van cellen tot celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van een celvrije auto-inductieworkflow. Journal of Visualized Experiments. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacterieel celvrij lysaat. Journal of Visualized Experiments. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire templates voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen. Journal of Visualized Experiments. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Snelle karakterisering van genetische onderdelen met celvrije systemen. Journal of Visualized Experiments. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Een hoogrentabel Streptomyces transcriptie-translatie toolkit voor synthetische biologie en natuurlijke productapplicaties. Journal of Visualized Experiments. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in lysate-gebaseerde celvrije systemen. Journal of Visualized Experiments. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Bereiding van multifunctionele zijde-gebaseerde microcapsules geladen met DNA-plasmiden die RNA-aptameren en riboswitches coderen. Journal of Visualized Experiments. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Ontwerp tot implementatiestudie voor ontwikkeling en patiëntvalidatie van papiergebaseerde toehold switch diagnostica. Journal of Visualized Experiments. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

Redactioneel

Celvrije expressie (CFE)-systemen zijn een reeks hulpmiddelen die de belangrijkste cellulaire processen van transcriptie, translatie en metabolisme reconstitueren buiten de grenzen van de cel1. Dergelijke methoden zijn snel in populariteit gegroeid door het aanbieden van vereenvoudigde experimenten via het verwijderen van celmembranen en verminderde complexiteit via het verwijderen van genomisch DNA en de bijbehorende complexiteit van interacties tussen een genetisch construct en de gastheer. CFE-systemen worden nu gebruikt voor fundamenteel onderzoek, sensing, biofabricage en onderwijs. Deze methodencollectie presenteert negen voorbeelden van nieuwe manieren om celvrije systemen te produceren en te gebruiken.

Drie van de methoden richten zich op het gemakkelijker maken van de productie van celvrije systemen. Grasemann et al. beschrijven een eenvoudiger manier om het PURE-systeem te maken, een CFE-systeem dat alle componenten herstelt die nodig zijn voor transcriptie en translatie, in plaats van cellulaire lysaten te gebruiken2. In plaats van elk van de 36 eiwitcomponenten tot expressie te brengen en te zuiveren, poolen de auteurs de expressiestammen, wat resulteert in de productie van een functioneel PURE-systeem binnen een week. Smith et al. bieden een vereenvoudigd proces voor de productie van lysate-gebaseerde CFE-systemen met behulp van een gestroomlijnde kweekbenadering die de totale workflow terugbrengt tot 24 uur, wat binnen normale werkuren te realiseren is3. Cooper et al. beschrijven een methode met behulp van een gemodificeerde E. coli-stam die cellyse door bevriezen-ontdooien mogelijk maakt, waardoor de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur die door andere methoden vereist is, wordt geëlimineerd4. Al deze methoden dragen bij aan een trend van inspanningen om de productie van celvrije systemen bereikbaar te maken voor laboratoria met minder infrastructuur en expertise in de ingewikkelde traditionele protocollen. Met de beschikbaarheid van concurrerende commerciële kits, kunnen steeds meer laboratoria de voordelen van CFE-systemen onderzoeken met weinig risico. Met methoden zoals die hier gepresenteerd, kunnen deze laboratoria ervoor kiezen om hun eigen CFE-systemen te maken die zijn afgestemd op hun behoeften zonder een grote investering in apparatuur of tijd.

Twee methoden richten zich op de voordelen van de snelle en hoogdoorvoerige experimenten die mogelijk zijn met CFE-systemen. Dopp et al. presenteren een methode om lineaire DNA-sjablonen te versterken voor snelle screening van genetische constructen5. Met hun aanpak kunnen genetische ontwerpen worden besteld bij DNA-synthesebedrijven en vervolgens binnen 24 uur worden versterkt en gescreend. McManus et al. beschrijven een vergelijkbare aanpak waarbij een reporter-gen wordt versterkt met verschillende primers die coderen voor verschillende regulatoire componenten6. De lage kosten van oligo's gecombineerd met CFE-systemen maakt snelle, kosteneffectieve screening van componenten zoals promotoren mogelijk. Beide methoden benadrukken het potentieel van CFE-systemen voor snelle experimenten, waardoor de tijdlijnen voor het ontwerpen en testen van een construct worden teruggebracht van weken met traditionele klonen naar dagen of zelfs uren.

De volgende drie methoden bieden hulpmiddelen voor gespecialiseerde toepassingen van CFE-systemen. Toh et al. bieden een methode voor het creëren van CFE-systemen van Streptomyces venezuelae7. Een meerderheid van CFE-protocollen is gebaseerd op E. coli, inclusief alle andere methoden in deze collectie. Deze nieuwe methode voor S. venezuelae brengt de voordelen van CFE-systemen naar een organisme van breed belang voor de productie van natuurlijke producten. Dinglasan et al. bieden een manier om metabolietenconcentraties te meten in celvrije reacties8. Dergelijke metingen zijn cruciaal voor toepassingen in celvrije metabole engineering, waarbij het intacte metabolisme van CFE-systemen wordt gebruikt om niet-eiwit producten van belang te produceren. Ten derde presenteren Drachuk et al. micro-incapsulatie van DNA voor toevoeging aan CFE-reacties9. Deze aanpak is representatief voor een reeks technieken die de voordelen van compartimentalisatie rationeel opnieuw introduceren in CFE-systemen na de verwijdering van natuurlijke membranen tijdens de productie van CFE-systemen. Elke methode diversifieert het scala aan toepassingen waarvoor CFE-systemen kunnen worden toegepast.

Ten slotte beschrijven Jaenes et al. methoden voor het produceren van een reëel diagnostisch middel voor het Zika-virus op basis van CFE-systemen10. De tests en instrumentatie zijn laag in kosten in vergelijking met concurrerende technologieën zoals PCR, en de auteurs hebben hun diagnostiek met succes getest met patiëntenmonsters in meerdere landen. Dit werk is een sterk voorbeeld van toepassingen voor sensing op locatie, wat misschien het gebied is waar CFE-systemen klaarstaat om de meest directe reële impact te maken.

Als collectie vangen deze methoden een representatief deel van de belangrijkste actieve onderzoeksgebieden in CFE-systemen van de afgelopen jaren. De methoden die de productie van CFE-systemen verbeteren en hoogdoorvoerige experimenten mogelijk maken, zijn goed vertegenwoordigd, en voorbeelden van de talrijke specifiekere toepassingen van CFE-systemen zijn aanwezig. Andere gebieden van belang omvatten de productie van complexe eiwitten voor medische toepassingen, incorporatie van niet-canonieke aminozuren, optimalisatie voor langdurige opslag en ontwikkeling van kunstmatige cellen. We verwachten dat de adoptie van CFE-systemen zal blijven versnellen gezien de verlaagde toegangsdrempel, potentieel voor snelle experimenten en breder scala aan mogelijkheden, allemaal mogelijk gemaakt door methoden zoals die gepresenteerd in deze collectie. De resterende uitdagingen zijn afhankelijk van het toepassingsgebied. Voor biofabricage zal vermindering van kosten op schaal door overschakelen naar goedkopere substrate

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen het Office of the Secretary of Defense’s Applied Research for the Advancement of S&T Priorities programma voor het ondersteunen van de samenwerking die tot deze verzameling heeft geleid.

Referenties

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

Gerelateerde artikelen