Method Article

Huidige methoden in ALS-onderzoek

DOI:

10.3791/65016

⸱

March 3rd, 2023

 ,  , 
1Experimental Neurology and Leuven Brain Institute (LBI), Department of Neurosciences, KU Leuven - University of Leuven, 2Laboratory of Neurobiology, Center for Brain & Disease Research, Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB), 3VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, Department of Neurosciences, KU Leuven, Leuven Brain Institute

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BESPREKTE ARTIKELEN:

Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetische faseovergang van TDP-43 in spinale motorneuronen van zebravislarven. Journal of Visualized Experiments. (180), e62932 (2022).

Coyne, A. N., Rothstein, J. D. Isolatie van kernen en superresolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie voor het onderzoeken van nucleoporine-veranderingen bij menselijke neurodegeneratie. (175), e62789 (2021).

Currey, H. N., Liachko, N. F. Evaluatie van motorische beperking in C. elegans modellen van amyotrofe laterale sclerose. (175), e62699 (2021).

Hayes, L. R., Duan, L., Vidensky, S., Kalab, P. Kerntransportassays in gepermeabiliseerde muis corticale neuronen. (173), e62710 (2021).

Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-time fluorescent metingen van synaptische functies in modellen van amyotrofe laterale sclerose. (173), e62813 (2021).

Loganathan, S., Ball H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Meting van glucoseopname in Drosophila modellen van TDP-43 proteïnopathie. (174), e62936 (2021).

Stilwell, G., Agudelo, A. Dissectie en immunohistochemie van het Drosophila volwassen been om veranderingen te detecteren bij de neuromusculaire junctie voor een geïdentificeerde motorneuron. (180), e62844 (2022)

Taga, A. et al. Oprichting van een elektrofysiologisch platform voor het modelleren van ALS met regionaal-specifieke humane pluripotente stamcel-afgeleide astrocyten en neuronen. (174), e62726 (2021).

Stoklund Dittlau, K. et al., Generatie van humane motorische eenheden met functionele neuromusculaire juncties in microfluïdische apparaten. (175), e62959 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die ongeveer 1 op de 400 mensen in hun leven treft. De ziekte manifesteert zich aanvankelijk als beschadiging van de bovenste en onderste motorische neuronen en vordert uiteindelijk tot verlamming en overlijden als gevolg van ademhalingsfalen binnen 2–5 jaar na het begin van de symptomen1. ALS kan erfelijk zijn, met meer dan 30 verschillende genetische mutaties, maar slechts 4 genvarianten (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) zijn verantwoordelijk voor ongeveer 55% van familiaire ALS. De meerderheid van de ALS-gevallen, ongeveer 90%, vertegenwoordigt sporadische ALS, waarvan de belangrijkste oorzaken nog niet volledig begrepen worden2. Er is een dringende behoefte om de mechanismen van ALS te ontrafelen door gebruik te maken van de juiste tools en modelorganismen. In deze methodencollectie bieden we een overzicht van de recente onderzoeksvoortgang in termen van het nabootsen van deze ziekte en, hopelijk, uiteindelijk het vinden van behandelingsopties. Bijvoorbeeld, de toepassing van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) die kunnen worden gedifferentieerd in motorische neuronen of astrocyten biedt een gehumaniseerd modelsysteem3,4,5. Daarnaast worden in deze methodencollectie diermodellen gepresenteerd, zoals Drosophila om glucoseopname en de neuromusculaire junctie (NMJ) in vivo te bestuderen6,7, muizen om corticale neuronen te bestuderen8, en C. elegans of zeebaars om motorische beperkingen9,10 en post-mortem patiëntenweefsel11 te onderzoeken.

Zebravislarven zijn transparant en hun motorische neuronen zijn direct zichtbaar, waardoor ze een perfect hulpmiddel zijn voor niet-invasieve in vivo studies. Asakawa et al. laten de faseovergang zien van optogenetisch tot uitgedrukt TDP-43 in enkele spinale motorneuronen9. Na bestraling kan de cytoplasmatische verplaatsing van TDP-43 worden waargenomen en geanalyseerd. De aggregatie van cytoplasmatisch TDP-43 is een kenmerk van degenererende motorneuronen bij ALS. Deze methode maakt de functionele studie en analyse van ALS-geassocieerde eiwitten mogelijk op een subcellulair, tijdelijk niveau.

Met behulp van superresolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) beschrijven Coyne en Rothstein een protocol dat de kernen isoleert en beschrijven hoe nucleoporinecomplexen kunnen worden onderzocht11. Nucleoporinecomplexen bestaan uit meerdere kopieën van ongeveer 30 verschillende nucleoporine-eiwitten (Nups). Nucleocytoplasmatisch transport (NCT)-beperking en Nup-alteraties zijn aangetoond als vroege kenmerken van veel neurodegeneratieve ziekten, waaronder ALS. Door de kernen te extraheren, is het mogelijk om de individuele Nup-eiwitten binnen het NPC en nucleoplasma in 3D te onderzoeken. Interessant is dat dit niet alleen kan worden toegepast op iPSC-afgeleide cellen, maar ook op post-mortem weefsel.

Currey en Liachko beschrijven twee assays om te onderscheiden tussen milde, matige en ernstige motorische beperking in C. elegans modellen van ALS10. In de radiale locomotieve assay wordt het kruipen op een oppervlak gemeten, waardoor dit een gemakkelijke en kosteneffectieve assay is. In hun tweede methode, de zwemtest, kunnen kronkelende bewegingen worden gemeten met behulp van een computergebaseerde volgmethode. De auteurs gebruiken dit om TDP-43 en tau te bestuderen.

Hayes et al. beschrijven ook een methode om NCT te bestuderen8. Ze passen een permeabilisatiemethode toe op neuronale culturen. Met behulp van primaire muiscorticale neuronen beschrijven ze een methode die de integriteit van de nucleaire membraan behoudt door gebruik te maken van hypotone lysis gecombineerd met een bovien serumalbumine kussen. Hierdoor functioneert de nucleaire import nog steeds op een energieafhankelijke manier, waardoor een platform voor hoogwaardige microscopie en analyse wordt geboden. Dit platform zal in de toekomst brede toepasbaarheid hebben voor het bestuderen van passief en actief nucleair transport in primaire neuronen.

De snelle beoordeling van hoe manipulatie, ziektegerelateerde eiwitten of RNA synaptische processen beïnvloeden en of therapeutische geneesmiddelen deze functies kunnen herstellen, is essentieel voor ALS-onderzoek. Met behulp van iPSC-afgeleide motorische neuronen en primaire neuronen van muizen presenteren Krishnamurthy et al. een protocol dat de real-time monitoring van presynaptische calciuminfluxdynamiek en synaptische blaasjesmembraanfusie mogelijk maakt3. De auteurs tonen aan dat C9orf72-(GA)50 transfectie de synaptische transmissie beïnvloedt, waardoor de geschiktheid van deze methoden voor het detecteren van op mutatie gebaseerde verschillen in synaptische functie wordt benadrukt.

Veranderde glucoseopname is een van de pathobiologische kenmerken van ALS. In dit Drosophila model beschrijven Loganathan et al. een FRET-gebaseerde methode om intracellulaire veranderingen in glucoseopname in specifieke cellen te meten6. Met behulp van een genetisch gecodeerde glucose FRET-sensor valideren ze hun methode met TDP-43 expressie neuronen, die een hogere glucoseopname vertonen. In de TDP-43G298S mutante lijn is verhoogde glucoseopname alleen detecteerbaar bij glucosestimulatie. Deze method

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken alle auteurs voor hun bijdragen aan deze collectie en onze collega's voor de vooruitgang op dit gebied. We willen ook het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO-Vlaanderen) bedanken. Y.E.K. is een FWO PhD-fellow SB (#1S50320N). We willen ook VIB, KU Leuven (C1 en “Opening the Future” Fonds), het “Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen” (FWO-Vlaanderen), de Thierry Latran Foundation, de “Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires – aide à la recherché ASBL” (ABMM), de Muscular Dystrophy Association (MDA), de ALS Liga België (A Cure for ALS), Target ALS en de ALS Association (ALSA) erkennen.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martin, S., Al Khleifat, A., Al-Chalabi, A. What causes amyotrophic lateral sclerosis. F1000Res. 6, 317(2017).
  2. Talbott, E. O., Malek, A. M., Lacomis, D. The epidemiology of amyotrophic lateral sclerosis. Handbook of Clinical Neurology. 138, 225-238 (2016).
  3. Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P., Jensen, B. Real-time fluorescent measurements of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Visualized Experiments. (173), e62813(2021).
  4. Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (175), e62959(2021).
  5. Taga, A., et al. Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons. Journal of Visualized Experiments. (174), e62726(2021).
  6. Loganathan, S., Ball, H. E., Manzo, E., Zarnescu, D. C. Measuring glucose uptake in Drosophila. models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).
  7. Stilwell, G., Agudelo, A. Dissection and immunohistochemistry of the Drosophila. adult leg to detect changes at the neuromuscular junction for an identified motor neuron. Journal of Visualized Experiments. (180), e62844(2022).
  8. Hayes, L. R., Duan, L., Vidensky, S., Kalab, P. Nuclear transport assays in permeabilized mouse cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (173), e62710(2021).
  9. Asakawa, K., Handa, H., Kawakami, K. Optogenetic phase transition of TDP-43 in spinal motor neurons of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (180), e62932(2022).
  10. Currey, H. N., Liachko, N. F. Evaluation of motor impairment in C. elegans. models of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Visualized Experiments. (175), e62699(2021).
  11. Coyne, A. N., Rothstein, J. D. Nuclei isolation and super-resolution structured illumination microscopy for examining nucleoporin alterations in human neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (175), e62789(2021).
  12. Al-Chalabi, A., Hardiman, O. The epidemiology of ALS: A conspiracy of genes, environment and time. Nature Reviews Neurology. 9 (11), 617-628 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ALS ResearchTDP 43Spinal Motor NeuronsZebrafish LarvaeNucleoporinsNeurodegenerationC Elegans ModelsMotor ImpairmentNuclear Transport AssaysSynaptic FunctionsDrosophila ModelsGlucose UptakeNeuromuscular JunctionHuman Pluripotent Stem CellsMicrofluidic Devices

Related Articles