Method Article

CryoEM-statusupdate en innovatieve ontwikkelingen

DOI:

10.3791/65021

⸱

March 3rd, 2023

 ,  , 
1Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BESPROKEN ARTIKELEN:

Truong, C. D. et al. Voorbereiding van monsters met behulp van een lipide-monolayermethode voor elektronenkristallografische studies. Journal of Visualized Experiments. (177), e63015 (2021).

Johnson, M. C., Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. De peel-blot techniek: een cryo-EM monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters. Journal of Visualized Experiments. (184), e64099 (2022).

Chang, Y.-C., Chen, C.-Y., Tsai, M.-D. Voorbereiding van monsters in hoge temperatuur voor cryo-EM. Journal of Visualized Experiments. (173), e62772 (2021).

Kang, M.-H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabricage van een micro-gepatterreerde chip met gecontroleerde dikte voor high-throughput cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (182), e63739 (2022).

Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. Voorbereiding van monsters door middel van 3D-correlatie gefocust ionenstraal frezen voor high-resolutie cryo-elektron tomografie. Journal of Visualized Experiments. (176), e62886 (2021).

DiCecco, L.-A. et al. Geavanceerde high-resolutie beeldvorming van virusassemblages in vloeistof en ijs. Journal of Visualized Experiments. (185), e63856 (2022).

Kumar, A., P, S., Gulati, S., Dutta, S. Gebruiksvriendelijk, high-throughput en volledig geautomatiseerd data acquisitie software voor single-particle cryo-elektron microscopie. Journal of Visualized Experiments. (173), e62832 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nog voordat de Nobelprijs van 2017 werd toegekend voor de cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) van biologische moleculen, zorgde het vakgebied al voor enthousiasme. De resolutierevolutie was al goed op gang en de structurele biologie keek naar cryoEM als een karakteriseringsmethode die het gouden standaard van röntgenkristallografie benaderde1. Al vroeg omvatte het vakgebied van cryoEM voornamelijk gegevens gegenereerd door cryo transmissie-elektronenmicroscopen (cryoTEMs). Nu, naarmate microscoop, monstervoorbereidingsinstrumenten en monstervoorbereidingsmethoden zijn gevorderd, zijn de gegenereerde soorten gegevens diverser geworden. CryoEM is niet langer gereserveerd voor eiwitkarakterisering door cryoTEM. Het vakgebied is gegroeid en omvat nu gegevens gegenereerd door cryo-scannen-elektronenmicroscopen en gefocuste ionenbundel (cryoSEM/FIB). De impact wordt breder gevoeld in meerdere disciplines, inclusief beeldvormingsonderzoek op moleculen, cellen, weefsels en synthetische materialen zoals hydrogels.

Vooruitgang in beeldvormingscapaciteiten is een drijvende kracht geweest in de ontwikkeling van cryoEM. Verbeteringen in camera's, detectoren en beeldverwerking hebben de weg geëffend voor beeldvorming met minder energie-input, waardoor delicate biologische monsters de beeldvormingsprocedure kunnen overleven. In TEM's heeft de lage dosisstralingsblootstelling geresulteerd in de toepassing van tomografie waarbij een enkel monster herhaaldelijk onder meerdere hoeken wordt afgebeeld om een 3D-reconstructie te genereren2,3. Vooruitgang in SEM/FIB's heeft ook geresulteerd in betere resolutie bij gebruik van minder energie. Belangrijk is dat dit heeft geleid tot betere beeldvorming van niet-geleidende monsters, wat zich vertaalt in betere volumebeeldvorming in SEM/FIB's4,5. Deze verbeteringen hebben alle biologische elektronenmicroscopie beeldvorming gevorderd, maar ze hebben vooral cryo-beeldvorming verbeterd, waarbij monsters delicaat zijn en geen extra zware metalen zijn toegevoegd om het contrast te verbeteren.

Naarmate de beeldvormingscapaciteiten zijn gevorderd, zijn ook de monstervoorbereidingsinstrumenten dat gedaan. Bij cryoEM monstervoorbereiding is de eerste stap het succesvolle glasvorming van de monsters. Gehydrateerde monsters worden bevroren om amorf ijs te vormen, waardoor de schade veroorzaakt door de vorming van ijskristallen wordt vermeden. De toonaangevende strategieën zijn dompelvriezen in vloeibaar ethaan voor moleculen en kleine cellen of hogedrukvriezen (HPF) voor grotere monsters tot enkele honderdduizendste van een meter dik. Vooruitgang in dompelvriestechnologie maakt het beter mogelijk om moleculen in alle oriëntaties vast te leggen door de zelfassemblage langs het lucht/water-interface te verminderen6. Bovendien maakt vooruitgang in HPF-technologie het mogelijk om monsters licht en elektrisch te stimuleren momenten voor het vriezen7. Meest recent is er een nieuwe HPF-technologie ontwikkeld die kan worden aangesloten op een fluorescentiemicroscoop, waardoor er een korte tijdsvertraging (< 2 s) is tussen de fluorescentiebeeldvorming van levende cellen en HPF-vriezen8.

De bovenstaande vooruitgang heeft het vakgebied van cryoEM geënergeerd en de ontwikkeling van nieuwe methoden geïnspireerd. Er is ook een hernieuwde inspanning geweest voor gevestigde technieken. Hier presenteren we een verzameling methoden gericht op het bevorderen van cryoEM met als doel deze strategieën te verspreiden naar het snel uitbreidende onderzoeksgebied.

Terwijl de verbeteringen in beeldvormingscapaciteiten en monstervoorbereidingsinstrumenten een grote drijvende kracht zijn geweest achter de vooruitgang in het vakgebied van cryoEM, blijft een grote hindernis in dit onderzoek de praktische voorbereiding van monsters. Truong et al.9 presenteren een methode die gebruikmaakt van de vorming van een lipidenmonolaag aan het lucht/water-interface. Een lipidenlaag vormt zich op het TEM raster en fungeert als een schaal voor de membraaneiwitten van belang. Voor multilamellaire of gestapelde membraanmonsters presenteren Johnson et al.10 een strategie om de overtollige lagen te'schillen', waardoor er een enkele laag op het raster achterblijft die geschikt is voor TEM-beeldvorming. In een ander artikel herkennen Chang et al.11 dat sommige eiwitten temperatuurafhankelijk zijn en dat de relevante structuur wordt waargenomen bij verhoogde temperaturen. Ze beschrijven een aangepaste dompelvriesmethode die het mogelijk maakt om monsters op het raster aan te brengen bij verhoogde temperaturen terwijl nog steeds glasachtig ijs wordt bereikt na dompelvriezen. Om het proces van cryo rastervoorbereiding verder te controleren, presenteren Kang et al.12 een hoog-doorvoer methode om microgepatternde chips voor TEM rasters te produceren waarbij de poriën een controleerbare diepte hebben. Deze methode kan een andere variabele bieden om de dikte van amorf ijs tijdens rastervoorbereiding te controleren.

De correlatie van meerdere beeldvormingsmodaliteiten is invloedrijk. Bieber et al.13 beschrijven een cryo workflow waarbij een bevroren raster wordt afgebeeld in een cryofluorescentiemicroscoop om een fluorescente regio van belang te lokaliseren. Het raster wordt vervolgens overgebracht naar een cryoSEM/FIB, waarbij fiducials worden gebruikt om het fluorescentiebeeld te aligneren met het SEM-beeld, waardoor de fluorescente regio kan worden gericht voor FIB-frezen. Het doelgebied wordt verdund tot enkele honderdduizendstede van een meter, en vervolgens wordt het raster overgebracht naar een cryoTEM voor tomografie op de verdunde doellocatie. DiCecco et al.14 demonstreren een correlatie tussen vloeibare TEM en cryoTEM, waardoor ze dichter bij het doel komen om hoge resolutie cryoTEM-gegevens te koppelen aan de TEM-gegevens van moleculen in dynamische beweging.

De geautomatiseerde acquisitie van grote gegeven

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken alle auteurs voor hun bijdragen aan deze collectie en onze collega's voor de voortdurende vooruitgang op dit gebied. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Koch Institute Support (core) Grant P30-CA14051 van het National Cancer Institute. We danken het Koch Institute's Robert A. Swanson (1969) Biotechnology Center voor technische ondersteuning, met name de Peterson (1957) Nanotechnology Materials Core Facility.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. McEwen, B. F., Marko, M. The emergence of electron tomography as an important tool for investigating cellular ultrastructure. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (5), 553-563 (2001).
  3. Dover, S. D., Elliott, A., Kernaghan, A. K. Three-dimensional reconstruction from images of tilted specimens: the paramyosin filament. Journal of Microscopy. 122, 23-33 (1981).
  4. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. Journal of Structural Biology. 184 (2), 355-360 (2013).
  5. Wu, G. H., et al. Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells. Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).
  6. Darrow, M. C., Moore, J. P., Walker, R. J., Doering, K., King, R. S. Chameloen: Next generation sample preparation for cryoEM based on Spotiton. Microscopy and Microanalysis. 25, 994-995 (2019).
  7. Watanabe, S., et al. Ultrafast endocytosis at Caenorhabditis elegans neuromuscular junctions. Life. 2, 00723(2013).
  8. Heiligenstein, X., et al. HPM live μ for a full CLEM workflow. Methods in Cell Biology. 162, 115-149 (2021).
  9. Truong, C. D., et al. Sample preparation using a lipid monolayer method for electron crystallographic studies. Journal of Visualized Experiments. (177), e63015(2021).
  10. Johnson, M. C., Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. The peel-blot technique: A cryo-EM sample preparation method to separate single layers from multi-layered or concentrated biological samples. Journal of Visualized Experiments. (184), e64099(2022).
  11. Chang, Y. -C., Chen, C. -Y., Tsai, M. -D. Preparation of high-temperature sample grids for cryo-EM. Journal of Visualized Experiments. (173), e62772(2021).
  12. Kang, M. -H., Lee, M., Kang, S., Park, J. Fabrication of micro-patterned chip with controlled thickness for high-throughput cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (182), e63739(2022).
  13. Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. Sample preparation by 3D-correlative focused ion beam milling for high-resolution cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (176), e62886(2021).
  14. DiCecco, L. -A., et al. Advancing high-resolution imaging of virus assemblies in liquid and ice. Journal of Visualized Experiments. (185), e63856(2022).
  15. Kumar, A., P, S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, high-throughput, and fully automated data acquisition software for single-particle cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (173), e62832(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CryoEMSample PreparationLipid Monolayer MethodElectron CrystallographyPeel blot TechniqueHigh temperature Sample GridsMicro patterned ChipHigh throughput Cryogenic Electron Microscopy3D correlative Focused Ion Beam MillingCryo electron TomographyVirus Assemblies ImagingAutomated Data Acquisition SoftwareSingle particle Cryo electron Microscopy

Related Articles