$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Glycogeen, een vertakkende glucosepolymeer, speelt een belangrijke rol in energiemetabolisme bij prokaryoten en eukaryoten. Onder omstandigheden van voedingsbeperking, gebruiken bacteriën en gist glycogeen voor celoverleving1. Bij zoogdieren heeft glycogeen weefselspecifieke functies, inclusief lokaal gebruik in de spieren om samentrekking te stimuleren en in de lever om bloedglucoseniveaus te reguleren2. De synthese van glycogeen wordt gekatalyseerd door glycogeensynthase, dat glucoseresiduen verbindt via alfa 1,4-bindingen, en vertakkingsenzym, dat alfa 1,6-bindingen vormt, waardoor takken in het glycogeenmacromolecuul ontstaan. De gebruik van deze energievoorraad wordt gefaciliteerd door glycogeenfosforylase in combinatie met het ontvertakkingsenzym, resulterend in de remodellering van glycogeen en de afgifte van glucose-1-P. De structuur van glycogeen, inclusief de deeltjesgrootte en vertakking, is gedeeltelijk van belang omdat de vertakking de oplosbaarheid van glycogeen beïnvloedt, de grootte van de glycogeendeeltjes beïnvloedt hun afbraaksnelheid, en glycogeenstructurele instabiliteit is geassocieerd met diabetes. Bovendien is het onderzoeken van de subcellulaire lokalisatie van glycogeen belangrijk in weefsels zoals spieren om informatie te verkrijgen over de rol van deze brandstof tijdens het oefenen.
De ophoping van glycogeen wordt gecontroleerd door de relatieve activiteiten van de glycogeensynthetiseringsenzyms en die welke het macromolecuul afbreken. Wilson3 beschrijft technieken om de enzymatische activiteit van glycogeensynthase, glycogeenfosforylase, vertakkingsenzym en ontvertakkingsenzym te meten. Deze biochemische methoden meten de productie of consumptie van NADH/NADPH of colorimetrische verandering met een spectrofotometer. Dit zijn schaalbare benaderingen die de hoge kosten, gespecialiseerde apparatuur en regelgevende last geassocieerd met de gevoeligere methode die radio-isotopen gebruikt, omzeilen. De beschreven methoden zijn het meest geschikt voor het meten van enzymactiviteit met gezuiverde enzymen, hoewel met voldoende homogenaatverdunning en de juiste controles, ze zijn gebruikt met weefselmonsters. Wilson3 beschrijft ook een eenvoudige colorimetrische assay voor het meten van glycogeenvertakking. Hoewel deze methode minder informatie oplevert over de fijne structuur van glycogeen dan meer bewerkelijk scheidingstechnieken, biedt het wel een eenvoudige en snelle maat voor de relatieve graden van vertakking.
Fermont et al.4 beschrijven het gebruik van fluorofoor-geassisteerde koolhydraatelektroforese (FACE), een methode voor het bepalen van de ketenlengteverdeling (CLD), die een weerspiegeling is van de glycogeendeeltjesgrootte en het percentage vertakking. De structuur van glycogeen beïnvloedt het vermogen van bacteriën om honger te overleven, en abnormaal glycogeen hoopt zich op in verschillende glycogeenopslagziekten, waardoor de belangrijkheid van methoden voor het bestuderen van de grootte en vertakking van deze brandstofbron wordt benadrukt. FACE omvat de reductieve aminering van een hemiacetaalgroep met 8-amino 1,3,6 pyrene trisulfonzuur (APTS). Naast het verschaffen van informatie over de CLD, is FACE nuttig voor het meten van de katalytische eigenschappen van vertakkingsenzyms uit verschillende bronnen. De primaire concurrerende techniek, HPAEC-PAD, heeft het voordeel dat niet-reducerende uiteinden nodig zijn, maar deze techniek heeft een massabiasprobleem.
De mate van vertakking en de grootte van glycogeendeeltjes zijn beide belangrijke kenmerken van het glucosepolymeer. Het is waargenomen met elektronenmicroscopie dat glycogeen bestaat uit drie structuren: sferische beta-deeltjes (~20 nm), die verschillende gammadeeltjes (3 nm) omvatten, en grotere roosvormige alfadeeltjes (~300 nm) die zijn samengesteld uit betadeeltjes5. Traditionele methoden voor het isoleren van glycogeen zijn voldoende voor het meten van de glycogeenconcentratie, maar ze compromitteren de fijne structuur van het glycogeen, wat betekent dat de ontwikkeling van een mildere techniek vereist is. Een koudewaterextractie met sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugering wordt beschreven voor gebruik in bacteriën door Wang, Wang et al.6. Deze techniek is superieur aan andere methoden in het behouden van zowel grotere glycogeendeeltjes, zoals gemeten door fractiechromatografie (SEC), als langere ketens, zoals gemeten door fluorofoor-geassisteerde capillaire elektroforese (FACE)6. Wang, Liu et al.7 passen ook een vergelijkbare methode toe op de lever. De belangrijkheid van het begrijpen van de glycogeenstructuur wordt gedemonstreerd door een recent rapport dat toont dat, bij diabetes, leverglycogeen alfadeeltjes "fragiel" zijn, wat resulteert in snellere afbraak in vergelijking met stabiele alfadeeltjes, wat mogelijk een impact heeft op de bloedglucosecontrole. De beperkingen van deze sucrosegradiënt-gebaseerde isolatiemethoden omvatten het verlies van glycogeen in het supernatant, wat mogelijk wordt gecompenseerd door een lagere sucroseconcentratie, en de enzymatische afbraak van een deel van het glycogeen als gevolg van de milde omstandigheden die worden gebruikt. Het laatste wordt gecompenseerd door een korte kookstap, hoewel dit de geassocieerde eiwitten verstoort.
Ten slotte beschrijven Jensen et al.8 het gebruik van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om de subcellulaire verdeling en deeltjesgrootte van glycogeen in enkele skeletspiervezels te beeldhouwen. Deze methode is de enige beschikbare voor het onderzoeken van subsarcolemmale, intermyofibrillaire en intramyofibrillaire glycogeenpools en is gebruikt op spierweefsels van een verscheidenheid aan dieren. Aangezien sommige subcellulaire processen glycogeen preferentieel als brandstof gebruiken, is het belangrijk om de locatie van deze brandstofvoorraden te karakteriseren. Bovendien biedt