Methodenartikel

On-chip octanol-geassisteerde liposoomassemblage voor bio-engineering

DOI:

10.3791/65032

⸱

17 maart 2023

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische techniek om biocompatibele liposomen te genereren. OLA produceert monodisperse, micron-sized liposomen met efficiënte inkapseling, waardoor onmiddellijke experimenten op de chip mogelijk zijn. Dit protocol is naar verwachting bijzonder geschikt voor synthetische biologie en synthetisch celonderzoek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microfluidics is een veelgebruikt hulpmiddel om druppels en blaasjes van verschillende soorten te genereren op een gecontroleerde en high-throughput manier. Liposomen zijn simplistische cellulaire nabootsingen die bestaan uit een waterig inwendige omgeven door een lipide dubbellaag; Ze zijn waardevol bij het ontwerpen van synthetische cellen en het begrijpen van de fundamenten van biologische cellen op een in vitro manier en zijn belangrijk voor toegepaste wetenschappen, zoals vrachtlevering voor therapeutische toepassingen. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd werkprotocol voor een microfluïdische techniek op de chip, octanol-assisted liposome assembly (OLA), om monodisperse, micron-formaat, biocompatibele liposomen te produceren. OLA functioneert op dezelfde manier als bellenblazen, waarbij een binnenste waterige (IA) fase en een omringende lipidedragende 1-octanolfase worden afgeknepen door oppervlakteactieve buitenvloeistofstromen. Dit genereert gemakkelijk dubbele emulsiedruppels met uitstekende octanolzakken. Terwijl de lipide bilayer zich assembleert op de druppelinterface, maakt de pocket spontaan los om een unilamellair liposoom te creëren dat klaar is voor verdere manipulatie en experimenten. OLA biedt verschillende voordelen, zoals gestage liposoomgeneratie (>10 Hz), efficiënte inkapseling van biomaterialen en monodispersed liposoompopulaties, en vereist zeer kleine monstervolumes (~ 50 μL), wat cruciaal kan zijn bij het werken met kostbare biologicals. De studie bevat details over microfabricage, zachte lithografie en oppervlaktepassivering, die nodig zijn om OLA-technologie in het laboratorium te vestigen. Een proof-of-principle synthetische biologie toepassing wordt ook aangetoond door het induceren van de vorming van biomoleculaire condensaten in de liposomen via transmembraan proton flux. Verwacht wordt dat dit bijbehorende videoprotocol de lezers zal helpen om OLA in hun laboratoria op te zetten en problemen op te lossen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle cellen hebben een plasmamembraan als hun fysieke grens, en dit membraan is in wezen een steiger in de vorm van een lipide bilaag gevormd door de zelfassemblage van amfifiele lipidemoleculen. Liposomen zijn de minimale synthetische tegenhangers van biologische cellen; Ze hebben een waterig lumen omgeven door fosfolipiden, die een lipide dubbellaag vormen met de hydrofiele kopgroepen naar de waterige fase gericht en de hydrofobe staarten naar binnen begraven. De stabiliteit van liposomen wordt bepaald door het hydrofobe effect, evenals de hydrofilie tussen de polaire groepen, van der Waalskrachten tussen de hydrofobe koolstofstaarten en de waterstofbinding tussen watermoleculen en de hydrofiele koppen 1,2. Afhankelijk van het aantal lipide bilayers, kunnen liposomen worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën, namelijk unilamellaire blaasjes bestaande uit een enkele bilayer en multilamellaire blaasjes opgebouwd uit meerdere bilayers. Unilamellaire blaasjes worden verder geclassificeerd op basis van hun grootte. Typisch bolvormig, kunnen ze in verschillende maten worden geproduceerd, waaronder kleine unilamellaire blaasjes (SUV, 30-100 nm diameter), grote unilamellaire blaasjes (LUV, 100-1.000 nm diameter) en ten slotte gigantische unilamellaire blaasjes (GUV, >1.000 nm diameter)3,4. Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om liposomen te produceren, en deze kunnen grofweg worden onderverdeeld in bulktechnieken5 en microfluïdische technieken6. Veelgebruikte bulktechnieken omvatten lipidefilmrehydratie, elektrovorming, omgekeerde emulsieoverdracht en extrusie 7,8,9,10. Deze technieken zijn relatief eenvoudig en effectief, en dit zijn de belangrijkste redenen voor hun wijdverbreide gebruik in de synthetische biologiegemeenschap. Tegelijkertijd hebben ze echter grote nadelen met betrekking tot de polydispersiteit in grootte, het gebrek aan controle over de lamellariteit en de lage inkapselingsefficiëntie 7,11. Technieken zoals continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE)12 en droplet shooting and size filtration (DSSF)13 overwinnen deze beperkingen tot op zekere hoogte.

Microfluïdische benaderingen zijn het afgelopen decennium prominent geworden. Microfluïdische technologie biedt een controleerbare omgeving voor het manipuleren van vloeistofstromen binnen door de gebruiker gedefinieerde microkanalen vanwege de karakteristieke laminaire stroming en diffusie-gedomineerde massaoverdracht. De resulterende lab-on-a-chip-apparaten bieden unieke mogelijkheden voor de spatiotemporele controle van moleculen, met aanzienlijk verminderde monstervolumes en multiplexingmogelijkheden14. Er zijn talrijke microfluïdische methoden ontwikkeld om liposomen te maken, waaronder gepulseerde jetting 15, dubbele emulsietemplating 16, transiënte membraanuitwerping 17, druppelemulsieoverdracht 18 en hydrodynamische focus 19. Deze technieken produceren monodisperse, unilamellaire, celgrote liposomen met een hoge inkapselingsefficiëntie en een hoge doorvoer.

Dit artikel beschrijft de procedure voor octanol-assisted liposome assembly (OLA), een microfluïdische methode op de chip op basis van het hydrodynamische pinch-off en het daaropvolgende oplosmiddelontvochtigingsmechanisme20 (figuur 1). Men kan de werking van OLA relateren aan een bellenblaasproces. Een zeswegovergang concentreert de binnenste waterige (IA) fase, twee lipidedragende organische (LO) stromen en twee oppervlakteactieve stoffen bevattende buitenste waterige (OA) stromen op één plek. Dit resulteert in water-in-(lipiden + octanol)-in-water dubbele emulsiedruppels. Naarmate deze druppels stroomafwaarts stromen, leiden interfaciale energieminimalisatie, externe schuifstroom en interactie met de kanaalwanden tot de vorming van een lipide bilaag op het grensvlak als de oplosmiddelzak losraakt, waardoor unilamellaire liposomen worden gevormd. Afhankelijk van de grootte van de octanolzak kan het ontvochtigingsproces tientallen seconden tot een paar minuten duren. Aan het einde van het uitgangskanaal drijven de minder dichte octanoldruppels naar het oppervlak, terwijl de zwaardere liposomen (als gevolg van een dichtere ingekapselde oplossing) naar de bodem van de visualisatiekamer zinken, klaar voor experiment. Als een representatief experiment wordt het proces van vloeistof-vloeistof fasescheiding (LLPS) in liposomen aangetoond. Daarvoor worden de vereiste componenten ingekapseld in liposomen met een zure pH die LLPS voorkomt. Door extern een pH-verandering en dus een transmembraanprotonflux te veroorzaken, worden fasegescheiden condensaatdruppeltjes gevormd in de liposomen. Dit benadrukt de effectieve inkapselings- en manipulatiemogelijkheden van het OLA-systeem.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Het fabriceren van de master wafer

  1. Neem een schone siliconen wafer met een diameter van 4 inch (10 cm) (zie materiaaltabel). Reinig het verder met lucht onder druk om stofdeeltjes te verwijderen.
  2. Monteer de wafer op een spincoater en doseer voorzichtig ~ 5 ml van een negatieve fotoresist (zie materiaaltabel) in het midden van de wafer. Probeer luchtbellen te vermijden, omdat deze het stroomafwaartse afdrukproces van de wafer kunnen verstoren.
  3. Om een 10 μm dikke fotoresistlaag te verkrijgen, spin-coat de wafer op 500 tpm gedurende 30 s met een versnelling van 100 tpm / s voor initiële spreiding, gevolgd door een 60 s spin bij 3.000 tpm met een versnelling van 500 tpm / s. Als een andere dikte gewenst is, wijzigt u de spinparameters volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Bak de wafel op een verwarmingsplaat gedurende 2 minuten op 65 °C en vervolgens gedurende 5 minuten op 95 °C.
  5. Zodra de wafer is afgekoeld, monteert u de wafer in de afdrukkamer van de direct-write optische lithografiemachine (zie Materiaaltabel) en voert u het OLA-ontwerp (Figuur 2A, Aanvullend coderingsbestand 1) in de software in.
    OPMERKING: Het OLA-ontwerp bestaat in wezen uit twee OA-kanalen, twee LO-kanalen en één IA-kanaal, die samensmelten tot een zeswegknooppunt dat doorgaat als een postproductiekanaal en eindigt in de experimentele put (EW).
  6. Print de OLA-ontwerpen op de gecoate wafer met een UV-laser (zie Materiaaltabel) met een dosis van 300 mJ/cm2.
  7. Zodra het ontwerp is afgedrukt, bakt u de wafel gedurende 1 minuut op 65 °C, gevolgd door 95 °C gedurende 3 minuten.
  8. Zorg er op dit punt voor dat de omtrek van het afgedrukte apparaat op de wafer verschijnt en zichtbaar is voor het blote oog. Om de niet-uitgeharde fotoresist af te wassen, dompelt u de wafer in een glazen bekerglas met de ontwikkelaarsoplossing (zie Materiaaltabel) totdat de niet-uitgeharde fotoresist volledig is verwijderd.
    OPMERKING: Een overmatige behandeling van ontwikkelaars kan van invloed zijn op de ontwerpresolutie.
  9. Was de wafer achtereenvolgens met aceton, isopropanol en gedeïoniseerd (DI) water en ten slotte met lucht onder druk / N2 met behulp van een blaaspistool.
  10. Bak de wafer gedurende 30 minuten hard op 150 °C om ervoor te zorgen dat het afgedrukte ontwerp stevig aan het waferoppervlak is bevestigd en niet loskomt in het stroomafwaartse fabricageproces. De master wafer is dan klaar voor verder gebruik (figuur 2B).

2. Het microfluïdische apparaat voorbereiden

  1. Plaats de hoofdwafer op een vierkant stuk aluminium en wikkel de aluminiumfolie rond de wafer en vorm een goed lijkende structuur (figuur 2C).
  2. Meet 40 g polydimethylsiloxaan (PDMS) en 4 g uithardingsmiddel (10:1, gewichtsverhouding, zie materiaaltabel) in een centrifugebuis van 50 ml en meng krachtig met een spatel of een pipetpunt gedurende 2-3 minuten.
  3. Het krachtig mengen van het PDMS en het uithardingsmiddel vangt luchtbellen in het mengsel op. Draai de buis op 100 x g gedurende 2-3 minuten om de meeste grote luchtbellen te verwijderen.
  4. Giet ongeveer 15-20 g van het in stap 2.3 bereide mengsel over de hoofdwafer en ontgast met behulp van een exsiccator. Bewaar het overtollige mengsel om PDMS-gecoate glasplaten te maken (stap 3).
  5. Incubeer de assemblage in een oven bij 70 °C gedurende ten minste 2 uur.
  6. Haal de master wafer uit de oven en laat afkoelen. Om het gestold PDMS-blok te verwijderen, verwijdert u de aluminiumfolie en verwijdert u het PDMS-blok voorzichtig van de rand van de wafer.
    OPMERKING: De wafer is kwetsbaar en kan breken, dus het is belangrijk om dit proces zorgvuldig uit te voeren.
  7. Zodra het PDMS-blok is verwijderd, houdt u de patroonstructuur naar boven gericht en snijdt u met een scherp mes of een scalpel afzonderlijke PDMS-blokken, die elk een enkel microfluïdisch apparaat bevatten.
  8. Plaats het PDMS-blok op een donker oppervlak en pas de lichtrichting aan (een tafellamp is hiervoor handig) zodat de gegraveerde kanalen glanzend en daardoor zichtbaar zijn. Maak gaten in de inlaten en het uitgangskanaal met behulp van biopsieponsen van respectievelijk 0,5 mm en 3 mm diameter (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Gebruik een scherpe biopsiepons om scheuren in het PDMS te voorkomen, die later lekkage kunnen veroorzaken. Duw de biopsiepons voorzichtig door het PDMS-blok en zorg ervoor dat deze er volledig doorheen gaat. Om de biopsiepons te verwijderen, trekt u deze voorzichtig in terwijl u deze in verschillende richtingen draait. Het PDMS-blok met het gegraveerde OLA-ontwerp is nu klaar om te binden aan een PDMS-gecoate glasplaat.

3. Het maken van de PDMS-gecoate glasplaat

  1. Neem een transparante glazen afdekplaat, giet ongeveer 0,5 ml PDMS (in overmaat bereid in stap 2.4) op het midden van de glasplaat en verspreid deze over de dekplaat door de glasplaat voorzichtig te kantelen, waardoor de glasplaat volledig wordt bedekt met PDMS.
  2. Monteer de glasschuif op de spincoater, zorg ervoor dat deze centraal is geplaatst (zodat het midden van de schuif overlapt met het midden van de drukas) en draai de glasschuif bij 500 tpm gedurende 15 s (bij een toename van 100 tpm / s) en vervolgens bij 1.000 tpm gedurende 30 s (bij een toename van 500 tpm / s).
  3. Plaats de met PDMS gecoate glasplaat (gecoate kant naar boven gericht) op een verhoogd platform als een blok PDMS (1 cm x 1 cm) in een afgedekte petrischaal en bak deze gedurende 2 uur op 70 °C.

4. Verlijming van het microfluïdische apparaat

  1. Reinig het PDMS-blok (voorbereid in stap 2) door in de handel verkrijgbare plakband (zie materiaaltabel) twee keer te plakken en te verwijderen. Zorg ervoor dat u de gereinigde kant naar boven gericht houdt tot gebruik.
  2. Reinig de met PDMS gecoate glasplaat met lucht onder druk/N2 met een blaaspistool en houd de schone kant naar boven gericht.
  3. Plaats het PDMS-blok (gegraveerde kanalen naar boven gericht) en de met PDMS gecoate glasplaat (gecoate kant naar boven) in de vacuümkamer van de plasmareiniger (zie materiaaltabel).
  4. Schakel het vacuüm in en stel de inhoud bloot aan luchtplasma met een radiofrequentie van 12 MHz (RF-modus hoog) gedurende 15 s om de oppervlakken te activeren. Zuurstofplasma is te zien in de vorm van een roze tint.
  5. Plaats onmiddellijk na de plasmabehandeling de met PDMS gecoate glasplaat op een schoon oppervlak met de PDMS-zijde naar boven gericht. Plaats het PDMS-blok voorzichtig met het microfluïdische patroon nu naar de PDMS-gecoate glasplaat, zodat ze kunnen hechten (figuur 2D).
    OPMERKING: Het verwijderen van de lucht die in het apparaat is opgesloten, is cruciaal om een grondige hechting te garanderen.
  6. Bak de gebonden apparaten gedurende 2 uur op 70 °C.

5. Oppervlaktefunctionalisatie van het microfluïdische apparaat

OPMERKING: Voorafgaand aan de functionalisering van het oppervlak is het belangrijk om de drukpomp te kalibreren volgens het protocol van de fabrikant (zie materiaaltabel) en de slang te monteren om deze aan te sluiten op het microfluïdische apparaat.

  1. Het microfluïdische apparaat aansluiten op de drukpompen
    1. Sluit de drukgestuurde flowregelaar aan op een externe drukbron (tot 6 bar). Ten minste vier onafhankelijke luchtdrukkanalen zijn vereist: drie afzonderlijke modules van 0-2 bar en één module van −0,9-4 bar.
    2. Kalibreer de drukpomp volgens het protocol van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
    3. Snijd de slang (1/16 in OD x 0,02 in ID) in vier stukken van gelijke grootte van ongeveer 20 cm lang.
    4. Plaats 23 G roestvrijstalen 90° gebogen connectoren (zie materiaaltabel) aan het ene uiteinde van elk stuk. Dit uiteinde wordt later ingebracht in de drie inlaten (OA, LO en IA) van het microfluïdische apparaat en het vierde wordt gebruikt om overtollige oplossing te verwijderen (stap 5.2.5).
    5. Steek het andere uiteinde van de slang in de microfluïdische reservoirstandaard en sluit deze af met microfluïdische fittingen, zodat de slang lang genoeg is om de bodem van het reservoir te raken (buizen van 1,5 ml, zie materiaaltabel). Dit voorkomt dat ongewenste luchtbellen het microfluïdische apparaat binnendringen tijdens de PVA-behandeling / liposoomproductie.
  2. PVA-behandeling van het uitgangskanaal
    OPMERKING: Voorafgaand aan het genereren van liposoomen is het van cruciaal belang om het apparaat gedeeltelijk hydrofiel te maken stroomafwaarts van het productieknooppunt. Dit wordt gedaan door deze kanalen te behandelen met 5% (w / v) polyvinylalcohol (PVA) oplossing. De PVA-oplossing wordt bereid door het PVA-poeder (zie materiaaltabel) gedurende 3 uur op te lossen in water bij 80 °C onder constant roeren met behulp van een magneetroerder. Filter de oplossing voordat u deze gebruikt voor oppervlaktebehandeling. Onmiddellijk na de binding van het apparaat zijn de microfluïdische kanalen hydrofiel vanwege de door plasma geïnduceerde oppervlakteactivering en zullen ze geleidelijk weer hydrofoob worden. Het wordt aanbevolen om 2 uur na het bakken te wachten (stap 4.6) voordat u met de PVA-behandeling begint.
    1. Doseer 200 μL 5% w/v PVA-oplossing in een buis van 1,5 ml en sluit deze aan op de microfluïdische reservoirstandaard. Plaats de slang (de in stap 5.1.3 genoemde) zodanig dat het ene uiteinde in de PVA-oplossing wordt ondergedompeld en het andere uiteinde is aangesloten op de inlaat van het OA-kanaal van het microfluïdische apparaat.
      OPMERKING: Een lagere PVA-concentratie kan leiden tot sub-standaard oppervlaktefunctionalisatie.
    2. Herhaal de bovenstaande stap zonder PVA (lege buis van 1,5 ml) en sluit deze aan op de LO- en IA-kanalen.
    3. Verhoog de druk van de OA-fase tot 100 mbar om de PVA-oplossing in de OA-kanalen te laten stromen. Verhoog de druk van de IA- en LO-fasen tot 120 mbar om de terugstroom van PVA-oplossing in deze kanalen te voorkomen (figuur 2E).
      OPMERKING: Pas indien nodig de druk van de afzonderlijke kanalen aan om de meniscus stabiel te houden op de productiekruising.
    4. Laat de PVA-oplossing op deze manier gedurende ongeveer 5 minuten stromen, zodat het uitgangskanaal volledig functioneert.
    5. Om de PVA-oplossing te verwijderen, maakt u de slang los van de OA-inlaat en verhoogt u onmiddellijk de druk in de LO- en IA-kanalen tot 2 bar. Gebruik tegelijkertijd een slang die is aangesloten op een onderdrukkanaal (−900 mbar) verwijder overtollige PVA eerst uit het uitgangskanaal en vervolgens uit de OA-inlaat (figuur 2F).
    6. Bak het apparaat gedurende 15 minuten op 120 °C en laat het voor gebruik afkoelen. Het apparaat kan ten minste 1 maand onder omgevingsomstandigheden worden bewaard.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 1 dag te wachten (bij kamertemperatuur) voordat u doorgaat met OLA om ervoor te zorgen dat het onbehandelde PDMS zijn hydrofobiciteit terugkrijgt na de plasmabehandeling.

6. Octanol-geassisteerde liposoomassemblage (OLA)

  1. Voorbereiding van de lipidenbouillon
    OPMERKING: Hier wordt een mengsel van 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Liss Rhod PE) lipiden (zie materiaaltabel) als voorbeeld gebruikt; Gebruikers moeten de lipidensamenstelling die ze nodig hebben op een vergelijkbare manier voorbereiden.
    1. Doseer 76 μL DOPC (25 mg/ml) en 16,6 μl Liss Rhod PE (1 mg/ml) in een kolf met ronde bodem met behulp van afzonderlijke glazen spuiten.
    2. Houd de kolf met ronde bodem rechtop en gebruik een samengeperst N 2-blaaspistool om een zachte stroom stikstof te geven om de chloroform te verdampen en een gedroogde lipidefilm op de bodem van de kolf te vormen.
    3. Plaats de kolf gedurende ten minste 2 uur in de exsiccator onder een continu vacuüm om het resterende chloroform te verwijderen.
    4. Voeg 100 μL ethanol toe aan de kolf met ronde bodem, gevolgd door zacht pipetteren of schudden om ervoor te zorgen dat de lipiden worden opgelost om een lipidevoorraad van 10% (g/v) te vormen.
      OPMERKING: Als een bepaalde lipidesamenstelling niet volledig oplosbaar is in ethanol, gebruik dan een mengsel van ethanol en chloroform, waarbij het volume chloroform zo klein mogelijk wordt gehouden.
    5. Pipetteer de oplossing in een donkere glazen injectieflacon. Spoel de injectieflacon voorzichtig met stikstof met behulp van een blaaspistool om de lucht te vervangen door een inerte atmosfeer. Sluit het deksel af met paraffinefolie en bewaar bij −20 °C.
      OPMERKING: De voorraadoplossing kan tot enkele maanden worden gebruikt. Telkens wanneer de injectieflacon wordt geopend, vervangt u de lucht voorzichtig door stikstof en sluit u de lucht opnieuw met deksel met paraffinefilm.
  2. Voorbereiden van de OLA-oplossingen
    1. Maak voorraadoplossingen van de onmisbare componenten: 20 mM dextran (Mw 6.000); 60% (v/v) glycerol; een buffer naar keuze. In dit geval werd 5x fosfaat gebufferde zoutoplossing (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mM Na 2 HPO 4,9 mM KH2PO 4; pH 7,4) bereid (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: Omdat pure glycerol zeer viskeus is, wordt aanbevolen om een klein stukje aan het einde van de pipetpunt schuin uit te snijden voor effectief pipetteren.
    2. Bereid 100 μL IA-, OA- en exit-oplossing (ES, de gewenste oplossing om de EW te vullen) monsters. Voor het gemak van visualisatie werd in dit specifieke geval geel fluorescerend eiwit (YFP) toegevoegd aan de IA-oplossing. Controleer de osmotische balans tussen de IA en artrose door de osmolariteit van de ingekapselde componenten te berekenen en indien nodig een geschikte hoeveelheid suiker of zout aan de artrose toe te voegen. Dit wordt gedaan om het barsten of krimpen van de liposomen tijdens de productie te voorkomen.
      OPMERKING: De uiteindelijke samenstellingen van de drie fasen zijn als volgt:
      IA: 15% glycerol, 5 mM dextran (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glycerol, 5% F68 oppervlakteactieve stof, 1x PBS
      ES: 15% glycerol, 1x PBS
      Een lagere concentratie F68-oppervlakteactieve stof heeft een negatieve invloed op het genereren van dubbele emulsies.
    3. Bereid 80 μL van de LO-fase door 4 μL stocklipide te pipetteren in 76 μL 1-octanol (zie Tabel met materialen). De uiteindelijke concentratie van DOPC is 5 mg / ml.
    4. Centrifugeer de monsters op 700 x g gedurende 60 s om eventuele grote aggregaten te verwijderen voordat u doorgaat met de microfluïdische experimenten. Dit voorkomt dat duidelijke verstoppingsfactoren de microfluïdische chip binnendringen.
  3. Liposoom productie
    1. Doseer de oplossingen (IA, LO, OA) in drie buizen van 1,5 ml, monteer ze (zoals vermeld in stap 5.1) en sluit ze aan op de met PVA behandelde microfluïdische chip (stap 5.2.6).
    2. Oefen een positieve druk uit op de drie kanalen: ~100 mbar op de IA- en LO-kanalen en ~200 mbar op het OA-kanaal.
      OPMERKING: Aangezien de OA-druk hoger is dan de andere, zal de OA-oplossing als eerste bij EW aankomen; Dit is een echte aanrader.
    3. Zodra de OA-oplossing EW bereikt, verlaagt u de OA-druk tot 100 mbar en verhoogt u de LO tot 200 mbar.  De LO-oplossing die bij het productieknooppunt aankomt, zal waarschijnlijk leiden tot luchtbellen vanwege lucht die uit de LO-kanalen wordt verplaatst. Zodra de luchtbellen in de EW zijn gedoseerd, stelt u de LO-druk in op 100 mbar. Verhoog ten slotte de IA-druk tot 200 mbar en wacht tot alle lucht in het IA-kanaal is verwijderd. De ideale volgorde van aankomst op de kruising van de drie fasen is dus OA, LO en IA.
    4. Nadat u de lucht uit de drie kanalen hebt verwijderd, stelt u alle kanaaldrukken in op 50 mbar en pipet u 10 μL ES in de uitgangskamer. Na het pipetteren van de ES, plaatst u een afdekschuif op het uitgangsgat om verdamping te voorkomen. In het geval dat de LO wordt teruggeduwd, verhoogt u geleidelijk de LO-druk in stappen van 1 mbar totdat deze naar de kruising begint te stromen.
    5. Zodra alle drie de fasen beginnen samen te stromen op de kruising, zorgt u ervoor dat de dubbele emulsieproductie begint en past u zich aan volgens de kwaliteit ervan (figuur 3A-C). Verander de druk geleidelijk (stappen van 0,1-1 mbar) in plaats van abrupt, tenzij de druk wordt gewijzigd om een ongewenste verstopping in het kanaal te elimineren.
      OPMERKING: De kanalen die moeten worden aangepast, zijn afhankelijk van wat er op het kruispunt gebeurt. De IA moet bijvoorbeeld worden verlaagd als de emulsies te groot zijn; de artrose moet worden verhoogd als zich dubbele emulsies vormen maar barsten in plaats van te worden afgeknepen; en de LO moet worden verlaagd als de octanolzak te groot is.
    6. Controleer of de druppels met dubbele emulsie stroomafwaarts naar EW stromen. Naarmate ze stromen, worden octanolzakken steeds prominenter en worden ze uiteindelijk afgeknepen, waardoor liposomen worden gevormd (figuur 3D-F). Zorg ervoor dat het postproductiekanaal lang genoeg is en dat de migratie van de dubbele emulsies langzaam genoeg is om te ontvochtigen.
      OPMERKING: Binnen enkele minuten na fatsoenlijke productie zullen liposomen en octanoldruppels het postproductiekanaal verlaten en in de EW gaan. Als gevolg hiervan, minder dicht dan water, drijven de octanoldruppels naar het oppervlak van de ES. Door de toevoeging van dextran in de IA zijn de liposomen zwaarder dan hun omgeving en gaan ze naar de bodem van de kamer, klaar voor observatie en verdere manipulatie.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie toont de vorming van membraanloze condensaten via het proces van vloeistof-vloeistof fasescheiding (LLPS) in liposomen als een representatief experiment.

Monstervoorbereiding
De IA, OA, ES en toevoeroplossing (FS) worden als volgt bereid:

IA: 12% glycerol, 5 mM dextran, 150 mM KCl, 5 mg/ml poly-L-lysine (PLL), 0,05 mg/ml poly-L-lysine-FITC gelabeld (PLL-FITC), 8 mM adenosinetrifosfaat (ATP), 15 mM citraat-HCl (pH 4)

OA: 12% v/v glycerol, 5% m/v F68, 150 mM KCl, 15 mM citraat-HCl (pH 4)

ES: 12% glycerol, 150 mM KCl, 15 mM citraat-HCl (pH 4)

FS: 12% glycerol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Condensaatvorming in liposomen
Een eenvoudige test van pH-gevoelige complexe coacervatie van positief geladen poly-L-lysine (PLL) en negatief geladen multivalent adenosinetrifosfaat (ATP) werd geselecteerd om de verschijnselen van LLPS in liposomen aan te tonen. Om fasescheiding van polylysine en ATP tijdens inkapseling te voorkomen, werd de pH van de oplossing op 4 gehouden, waarbij ATP neutraal is. Het verhogen van de pH van de ES door toevoeging van FS (een buffer van pH 9) verhoogde uiteindelijk de pH in de liposomen als gevolg van transmembrane protonflux, waardoor ATP negatief geladen werd en de fasescheiding werd geactiveerd met positief geladen PLL21 (figuur 4A). Na ongeveer 2 uur liposoomgeneratie werden de IA- en LO-drukken uitgeschakeld. De OA-kanaaldruk werd op 100 mbar gehouden om de resterende liposomen langzaam in de observatiekamer te laten stromen. Nadat alle liposomen in het kanaal in de EW waren teruggevonden, werd de druk uitgeschakeld om de stroom te stoppen en te voorkomen dat de liposomen zouden bewegen. De liposomen gegenereerd bij een lagere pH vertoonden een homogene fluorescentie (van de ingekapselde fluorescerende PLL-FITC) in hun lumen (figuur 4B,D). Octanoldruppeltjes die aan het oppervlak dreven, werden verwijderd door voorzichtig 5 μL oplossing van de bovenkant te pipetteren om te voorkomen dat ze verdere pipetteerstappen zouden beïnvloeden. Vervolgens werd 10 μL FS-buffer aan de EW toegevoegd, wat fasescheiding van de ingekapselde PLL en ATP induceerde. De homogene FITC-fluorescentie van elk liposoom transformeerde geleidelijk in verschillende fluorescerende condensaatdruppels. Uiteindelijk versmolten de afzonderlijke druppels tot één grotere condensaatdruppel die vrij verspreidde in de liposomen (figuur 4C, E-G).

figure-results-1
Figuur 1: Schema met de assemblage en werking van OLA. De drukregelaar is verbonden met de reservoirs die buitenste waterige, lipide-in-octanol en binnenste waterige oplossingen bevatten. De buizen die in de reservoirs worden gestoken, zijn verbonden met de respectieve inlaten van het OLA-apparaat. Geschikte stromingen in de drie kanalen leiden tot de vorming van water-in-(lipide-in-octanol)-in-water dubbele emulsies. De gevormde dubbele emulsies migreren naar de uitgangsput, waarbij de octanolpockets loskomen om liposomen te vormen. De gevormde liposomen worden verzameld op de bodem van de put voor visualisatie en verdere experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbereiding van de OLA-chip (fotolithografie, microfabricage, oppervlaktebehandeling). (A) Digitaal ontwerp met de belangrijkste kenmerken van het OLA-ontwerp, waaronder drie inlaten, een uitlaat en een zesweg productieknooppunt. (B) Een schema van de hoofdwafer met meerdere OLA-ontwerpen die zijn geproduceerd met behulp van UV-lithografie. (C) Een PDMS-elastomeer gegoten op de hoofdwafer, geplaatst in een put gemaakt van aluminiumfolie, en uitgehard door te bakken bij 70 °C gedurende 2 uur. (D) Een microfluïdisch apparaat gebonden met behulp van zuurstofplasmabehandeling, waarbij het PDMS-blok met het OLA-ontwerp is bevestigd aan een PDMS-gecoate glasplaat. (E) Oppervlaktefunctionalisatie van de gefabriceerde chip om het apparaat gedeeltelijk hydrofiel te maken. Dit wordt gedaan door 5% w / v PVA gedurende 5 minuten van het buitenste waterige kanaal naar het uitgangskanaal te stromen. Positieve luchtdruk in de andere kanalen voorkomt dat de PVA-oplossing deze kanalen binnendringt. (F) PVA wordt verwijderd door een vacuüm in het uitgangskanaal aan te brengen. Het apparaat wordt gedurende 15 minuten op 120 °C gebakken en is daarna klaar voor gebruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Demonstratie van OLA die efficiënt monodisperse dubbele emulsies en uiteindelijk liposomen met uitstekende inkapseling produceert. (A) Een helderveldbeeld met een snelle generatie van dubbele emulsiedruppels. (B) Het fluorescerende lipidenkanaal vertoont de vorming van een octanolzak als gevolg van gedeeltelijke ontvochtiging. De lipide-in-octanolfase bevatte een mengsel van DOPC (5 mg/ml) en Lis Rhod PE in een verhouding van 1.000:1. (C) Het binnenste waterige kanaal met inkapseling van geel fluorescerend eiwit (YFP). De inzetstukken in (A-C) tonen representatieve ingezoomde weergaven van de respectieve panelen (schaalbalken = 10 μm). (D-F) Ontvochtiging van de octanolzak in het uitgangskanaal, die een liposoom vormt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: pH-getriggerde vloeistof-vloeistoffasescheiding van pLL/ATP in liposomen. (A) Schema van de pH-afhankelijke overgang van de homogene oplossing van pLL en ATP ingekapseld in het liposoom (links) naar fasegescheiden pLL/ATP-coacervaten (rechts). De initiële zure omgeving in het liposoom maakt de moleculaire lading van ATP neutraal, waardoor coacervatie wordt geremd. Wanneer de pH in de liposomen in evenwicht is met de extern aangebrachte pH-verhoging, krijgt ATP een negatieve lading, waardoor coacervatie wordt geactiveerd. (B-C) Lijngrafieken (overeenkomend met de stippellijnen in respectievelijk panelen [D] en [G]) die de ruimtelijke verdeling van pLL (groen kanaal) en het membraan (rood kanaal) weergeven. (D-G) Time-lapse beelden van de vorming van pLL/ATP coacervaten in de liposomen. De externe toevoeging van een basisbuffer verhoogt de pH-waarde in de liposomen in de loop van minuten en initieert coacervatie. t = 0 min verwijst naar de tijd vlak voor het optreden van de eerste coacervatiegebeurtenis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend coderingsbestand 1: CAD-bestand van het OLA-ontwerp. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire complexiteit maakt het uiterst moeilijk om levende cellen te begrijpen wanneer ze als geheel worden bestudeerd. Het verminderen van de redundantie en interconnectiviteit van cellen door de belangrijkste componenten in vitro te reconstitueren is noodzakelijk om ons begrip van biologische systemen te vergroten en kunstmatige cellulaire nabootsingen te creëren voor biotechnologische toepassingen22,23,24. Liposomen dienen als een uitstekend minimaal systeem om cellulaire verschijnselen te begrijpen. Een niet-uitputtende lijst van deze verschijnselen omvat cytoskeletdynamica en resulterende membraanvervormingen 25,26, spatiotemporele regulatie van biomoleculaire condensaten 27,28 en hun interactie met het membraan 29, inkapseling van een breed scala aan biomoleculen, waaronder celvrije transcriptie-translatiesystemen 30, celvrije lipidesynthese 31 en evolutie van eiwitten 32,33,34. Liposomen zijn ook op grote schaal gebruikt als dragers voor medicijnafgifte en zijn goedgekeurd door de Food and Drug Administration (FDA) en het Europees Geneesmiddelenbureau (EMA) voor klinisch gebruik11. Liposomen en op lipiden gebaseerde nanodeeltjes worden gebruikt als dragers voor medicijnafgifte, waaronder mRNA-vaccins zoals het recente COVID-19-vaccin35.

Deze studie beschrijft een gedetailleerd protocol over fotolithografie, microfluïdische assemblage en oppervlaktefunctionalisatie om de OLA-techniek uit te voeren om liposomen op de chip te genereren (figuur 1 en figuur 3). De liposomen geproduceerd met behulp van OLA zijn monodispersed (variatiecoëfficiënt: 4% -11% van het gemiddelde) en in het biologische celgroottebereik (meestal tussen 5-50 μm in diameter), en ze kunnen worden afgestemd met behulp van de juiste stroomsnelheden van de binnenste en buitenste waterige kanalen36. De liposoompopulatie in figuur 1 heeft bijvoorbeeld een grootteverdeling van 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Bij typische productiesnelheden van 10-30 Hz zijn de gevormde liposomen unilamellar, zoals eerder werd bevestigd door een enkel dubbellaags specifiek transmembraaneiwit, alfa-hemolysine36, in het membraan in te brengen, evenals door de dithionaat-bleektest37 te gebruiken. OLA is ook compatibel met een breed scala aan lipidensamenstellingen en biedt de gebruiker flexibiliteit bij de keuze van lipiden. Belangrijk is dat de aanvankelijk gebruikte lipidensamenstelling wordt weerspiegeld in de uiteindelijke liposoomsamenstelling38.

Omdat het een relatief nieuwe technologie is, is er nog meer ruimte voor verbetering van OLA. Oppervlaktefunctionalisatie met behulp van PVA is bijvoorbeeld cruciaal, maar vervelend om uit te voeren. Een eenvoudigere en eenvoudigere manier om het apparaat te functionaliseren zou de fabricagetijd van de chip en de variabiliteit van chip tot chip aanzienlijk verminderen. Pluronic F68 oppervlakteactieve stof is een belangrijk onderdeel in de buitenste waterige fase om de dubbele emulsies in eerste instantie te stabiliseren; niettemin kan het gebruik ervan in bepaalde gevallen beperkend zijn. Het vervangen van Pluronic F68 door een meer biocompatibele oppervlakteactieve stof of volledige verwijdering van oppervlakteactieve stoffen kan de veelzijdigheid van het systeem verbeteren. Tijdens de migratie van gegenereerde dubbele emulsies in het uitgangskanaal kunnen ze barsten als gevolg van afschuiving. Het upgraden van het OLA-ontwerp om de dubbele emulsiestabiliteit en octanolzakscheiding te verbeteren, zou dus de doorvoer kunnen verhogen. Niettemin heeft OLA verschillende voordelen, waaronder voornamelijk de efficiënte inkapseling, monodisperse en unilamellaire liposomen en gecontroleerde experimenten op de chip.

OLA is gebruikt en aangepast in een breed scala van studies, waaronder groei en deling van liposomen39, het bestuderen van het proces van vloeistof-vloeistof fasescheiding27 en de interactie met het membraan21, en het begrijpen van bacteriële groei bioproductvorming in liposomen40. OLA-gebaseerde high-throughput assays worden ook gebruikt om ionentransport over het membraan41 en de permeabiliteit van geneesmiddelen over de lipide bilayer37 te begrijpen, als een medicijnafgiftesysteem voor therapeutische doeleinden 42, om het effect van antimicrobiële stoffen op membraan43 te bestuderen en als een hulpmiddel om vloeibare kristallen in te kapselen44. Naast het brede scala aan toepassingen van OLA-technologie, worden aangepaste versies van OLA ontwikkelddie geschikt zijn voor bepaalde doeleinden 45,46,47,48,49,50. Over het algemeen, gezien de voor- en nadelen, zijn we ervan overtuigd dat OLA een veelzijdig platform is voor synthetische biologie.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Dolf Weijers, Vera Gorelova en Mark Roosjen bedanken voor het feit dat ze ons YFP hebben verstrekt. S.D. erkent financiële steun van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (subsidienummer: OCENW. KLEIN.465).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-OctanolSigma-AldrichNr. 297887
1.5 mL tubesFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATPSigma-AldrichNr. A2383
Biopsy punchDarwin microfluidicsPT-T983-050.5 mm en 3 mm diameter
Citrate-baseSigma-AldrichNr. 71405
DextranSigma-AldrichNr. 31388Mr~6.000
Direct-write optical lithography machineDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Babyopstelling en software
DOPC lipidAvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNr. 24040032
Glass cover slipCorning#1, 24 x 40 mm
GlycerolSigma-AldrichNr. G2025
Hydrochloric acidThermo Scientific AcrosNr. 124630010
Liss Rhod PE lipidAvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNr. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Photoresist developermicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Plasma cleanerHarrick plasmaPDC-32G
PolydimethylsiloxaneDowSylgard 184PDMS en curing agent
Poly-L-lysineSigma-AldrichNr. P7890
Poly-L-lysine–FITC LabeledSigma-AldrichNr. P3543
Polyvinyl alcoholSigma-Aldrichnr. P8136molecuulgewicht 30.000–70.000, 87%–90% gehydrolyseerd
Pressure controllerElveflow OBK1 Mk3+Flow controller
Scotch tapeMagic Tape Invisible Matt Tape
Silicon waferSilicon Materials0620R16002
Spin coater Laurell Technologies CorporationModel WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS CouplersDarwin microfluidicsPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNr. 252859
Tygon tubingDarwin microfluidics1/16" OD x 0.02" ID
UV laser 365 nm golflengte

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459(2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543(2022).
  8. Zhang, H. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. D’Souza, G. G. M. , Humana. New York, NY. 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851(2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876(2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188(2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459(2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800(2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317(2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969(2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447(2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359(2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48(2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100(2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005(2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169(2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281(2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -X., Niederholtmeyer, H. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. Karim, A. S., Jewett, M. C. , Humana. New York, NY. 237-255 (2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfluidische liposoomgeneratiesynthetische biologielipide dubbellaagdubbele emulsiedruppelsbiomoleculaire condensatenoppervlaktepassiveringzachte lithografieinkapselingseffici ntiecelnabootsingen

Gerelateerde artikelen