Methodenartikel

Adipocyt-specifieke ATAC-Seq met vetweefsels met behulp van fluorescentie-geactiveerde kernsortering

DOI:

10.3791/65033

⸱

17 maart 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een protocol voor assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing (ATAC-seq) specifiek op adipocyten met behulp van kernsortering met vetweefsels geïsoleerd uit transgene reportermuizen met nucleaire fluorescentielabeling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een robuuste techniek die genoombrede chromatinetoegankelijkheidsprofilering mogelijk maakt. Deze techniek is nuttig geweest voor het begrijpen van de regulerende mechanismen van genexpressie in een reeks biologische processen. Hoewel ATAC-seq is aangepast voor verschillende soorten monsters, zijn er geen effectieve wijzigingen geweest van ATAC-seq-methoden voor vetweefsels. Uitdagingen met vetweefsels zijn de complexe cellulaire heterogeniteit, het grote lipidegehalte en de hoge mitochondriale besmetting. Om deze problemen op te lossen, hebben we een protocol ontwikkeld dat adipocyt-specifieke ATAC-seq mogelijk maakt door gebruik te maken van fluorescentie-geactiveerde kernsortering met vetweefsels van de transgene reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) muis. Dit protocol produceert gegevens van hoge kwaliteit met minimale verspilde sequencing-reads, terwijl de hoeveelheid nucleusinvoer en reagentia wordt verminderd. Dit artikel bevat gedetailleerde stapsgewijze instructies voor de ATAC-seq-methode die is gevalideerd voor het gebruik van adipocytkernen geïsoleerd uit vetweefsel van muizen. Dit protocol zal helpen bij het onderzoek naar chromatinedynamica in adipocyten op verschillende biologische stimulaties, wat nieuwe biologische inzichten mogelijk zal maken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetweefsel, dat gespecialiseerd is voor het opslaan van overtollige energie in de vorm van lipidemoleculen, is een belangrijk orgaan voor metabole regulatie. De strikte controle van de vorming en het onderhoud van adipocyten is van vitaal belang voor de vetweefselfunctie en de energiehomeostase van het hele lichaam1. Veel transcriptionele regulatoren spelen een cruciale rol bij de controle van adipocytendifferentiatie, plasticiteit en functie; Sommige van deze regulatoren zijn betrokken bij metabole stoornissen bij de mens 2,3. Recente ontwikkelingen in high-throughput sequencingtechnieken voor genexpressie en epigenomische analyse hebben de ontdekking van de moleculaire regulatoren van adipocytenbiologie verder vergemakkelijkt4. Moleculaire profileringsstudies met behulp van vetweefsels zijn een uitdaging om uit te voeren vanwege de heterogeniteit van deze weefsels. Vetweefsel bestaat voornamelijk uit adipocyten, die verantwoordelijk zijn voor vetopslag, maar bevat ook verschillende andere celtypen, zoals fibroblasten, endotheelcellen en immuuncellen5. Bovendien is de cellulaire samenstelling van vetweefsel dramatisch veranderd als reactie op pathofysiologische veranderingen zoals temperatuur en voedingsstatus6. Om deze problemen te overwinnen, hebben we eerder een transgene reportermuis ontwikkeld, genaamd Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP), die GFP-gelabelde ribosomen en mCherry-gelabelde biotinyleerde kernen produceert op een Cre-recombinase-afhankelijke manier7. Het dual-labeling systeem maakt het mogelijk om celtype-specifieke transcriptomische en epigenomische analyse uit te voeren met weefsels. Met behulp van NuTRAP-muizen gekruist met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-NuTRAP), hebben we eerder genexpressieprofielen en chromatinetoestanden van pure adipocytenpopulaties in vivo gekarakteriseerd en bepaald hoe ze worden veranderd tijdens obesitas 7,8. Eerder stelden NuTRAP-muizen gekruist met bruine en beige adipocyt-specifieke Ucp1-Cre-lijnen (Ucp1-NuTRAP) ons in staat om de epigenomische remodellering van de zeldzame thermogene adipocytenpopulatie, beige adipocyten, te karakteriseren als reactie op temperatuurveranderingen9.

ATAC-seq is een veelgebruikte analysemethode om de toegankelijkheid van genoombrede chromatine te beoordelen. De hyperreactieve Tn5-transposase die in ATAC-seq wordt gebruikt, maakt de identificatie van open chromatinegebieden mogelijk door sequencingadapters te taggen in het chromatine-toegankelijke gebied vankernen 10. ATAC-seq is een eenvoudige methode, maar biedt robuuste resultaten en is zeer efficiënt, zelfs met monsters met een lage invoer. Het is dus een van de meest populaire epigenomische profileringsmethoden geworden en heeft bijgedragen aan het begrip van de regulerende mechanismen van genexpressie binnen diverse biologische contexten. Sinds het oorspronkelijke ATAC-seq protocol is gemaakt, zijn er verschillende ATAC-seq-afgeleide technieken verder ontwikkeld om het protocol voor verschillende soorten samples aan te passen en te optimaliseren. Fast-ATAC is bijvoorbeeld ontworpen voor het analyseren van bloedcelmonsters11, Omni-ATAC is een geoptimaliseerd protocol voor ingevroren weefselmonsters 12 en MiniATAC-seq is effectief voor embryo-analyse in een vroeg stadium13. Het toepassen van de ATAC-seq-methode op adipocyten, vooral uit weefselmonsters, is echter nog steeds een uitdaging. Naast de heterogeniteit van vetweefsel kan het hoge lipidegehalte interfereren met efficiënte recombinatiereacties door Tn5-transposase, zelfs na kernisolatie. Bovendien veroorzaakt het hoge mitochondriale gehalte in adipocyten, met name in bruine en beige adipocyten, een hoge mitochondriale DNA-contaminatie en verspilde sequencing-reads. Dit artikel beschrijft een protocol voor adipocyt-specifieke ATAC-seq met behulp van Adipoq-NuTRAP-muizen (figuur 1). Door gebruik te maken van fluorescentie-gelabelde kernsortering, maakt dit protocol het mogelijk om zuivere populaties van adipocytenkernen weg te verzamelen van andere verstorende celtypen en de efficiënte verwijdering van lipiden, mitochondriën en weefselresten. Daarom kan dit protocol celtypespecifieke gegevens van hoge kwaliteit genereren en verspilling van mitochondriale metingen minimaliseren, terwijl een verminderde hoeveelheid invoer en reagentia wordt gebruikt in vergelijking met het standaardprotocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University School of Medicine.

1. Voorbereidingen voor het begin van het experiment

  1. Weefselvoorbereiding
    1. Voor het labelen van adipocytenkernen kruist u NuTRAP-muizen met adipocyt-specifieke adiponectine-Cre-lijnen (Adipoq-Cre) om Adipoq-NuTRAP-muizen te genereren, die hemizygoot zijn voor zowel Adipoq-Cre als NuTRAP.
    2. Ontleed de vetweefsels van belang van de Adipoq-NuTRAP-muizen zoals eerder beschreven14.
    3. Vries de weefsels in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij −80 °C tot gebruik.
      OPMERKING: Elk vetkussen kan als geheel worden opgeslagen en de bevroren weefsels kunnen later op droogijs in kleinere stukjes (~ 50 mg) worden gesneden voor experimenten. Als alternatief kunnen de vetweefsels worden gesneden, gealiquoteerd en ingevroren in buizen voor opslag (~ 50 mg per buis). Bevroren monsters mogen na het invriezen nooit ontdooien tot gebruik.
  2. Buffervoorbereiding
    OPMERKING: Houd de buffers gedurende het hele experiment op ijs.
    1. Bereid kernvoorbereidingsbuffer (NPB) voor: 250 mM sucrose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 en 0,1% NP40. Bereid 7 ml NPB per monster. Voeg voor gebruik verse 100x proteaseremmercocktail (laatste 1x), DTT (laatste 1 mM) en Hoechst (laatste 1 μg/ml) toe aan de NPB.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om verse NPB te bereiden, maar het kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
    2. Bereid 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% NP-40 (PBS-N).

2. Kernisolatie

  1. Koel glas Dounce homogenisatoren, met één glas Dounce per monster, op ijs. Voeg vervolgens 7 ml van de NPB-mix toe aan elk glas Dounce.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om maximaal acht monsters in elk experiment te gebruiken. Het werken met meer dan acht monsters zou alle stappen aanzienlijk vertragen en het kan vooral de kernkwaliteit tijdens het sorteren verlagen.
  2. Doe het bevroren vetweefsel (50-100 mg) in de glazen Dounce en knip het onmiddellijk in een paar kleinere stukjes met een lange schaar. Streel 10x met een losse stamper voor alle monsters, en dan 10x met een strakke stamper.
    OPMERKING: Vetweefsels zijn zacht, dus het snijden in een paar kleine stukjes zou voldoende moeten zijn. Voor zeldzame monsters kunnen kleinere stukken (10-20 mg) worden gebruikt, hoewel het aantal verzamelde adipocytenkernen kan variëren.
  3. Filtreer door een zeef van 100 μm in een nieuwe buis van 50 ml. Verplaats de gefilterde homogenaten naar een nieuwe buis van 15 ml door te gieten. Draai gedurende 10 minuten bij 200 × g bij 4 °C in een centrifuge met zwenkemmer. Verwijder het supernatant zoveel mogelijk.
    OPMERKING: Zuig eerst een vacuüm en verwijder vervolgens het resterende volume met behulp van een micropipette.
  4. Resuspendeerde de pellet in 500 μL PBS-N door zachtjes maar grondig met de vinger te tikken.
    OPMERKING: Vermijd pipetteren, omdat dit de kernen kan beschadigen.
  5. Filtreer door een zeef van 40 μm in een nieuwe buis van 50 ml met behulp van voorzichtig pipetteren. Spoel de zeef af met 250 μL PBS-N. Breng de gefilterde nucleaire resuspensie over naar een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuis (FACS) met behulp van een micropipette.
    OPMERKING: Indien beschikbaar kunnen buizen en celzeven worden gebruikt voor kleinere volumes om monsterverlies te minimaliseren.

3. Kernsortering

  1. Voorbereiding van de opvangbuis
    1. Voeg 500 μL PBS-N toe aan nieuwe buizen van 1,5 ml en keer een paar keer om om alle binnenoppervlakken nat te maken met de buffer.
    2. Draai de buizen kort om alle vloeistof naar beneden te brengen en koel ze vervolgens op ijs totdat ze zijn gesorteerd.
  2. FACS (figuur 2)
    1. Gebruik de FSC-A/FSC-H gating voor singlets en FSC-A/SSC-A voor het verwijderen van klein of groot vuil.
    2. Poort voor de mCherry/GFP-positieve adipocytenkernpopulatie.
    3. Verzamel 10.000 kernen in elk van de verzamelbuizen die in stap 3.1 zijn voorbereid.
  3. Nasorteerkernvoorbereiding
    1. Voeg 500 μL PBS-N toe aan elke verzamelbuis en keer een paar keer om om te mengen.
    2. Draai de opvangbuizen gedurende 10 minuten bij 4 °C op 200 × g in een centrifuge met zwenkemmer. Verwijder het supernatant volledig.
      OPMERKING: Gebruik eerst een vacuüm om bubbels te verwijderen, giet het supernatant af en gebruik papieren doekjes om de resterende vloeistof volledig te verwijderen. De pellet is op dit punt onzichtbaar. Bereid het Tn5-hoofdmengsel voor tijdens de centrifugatiestap zoals hieronder beschreven.

4. Tn5 Tagmentatie (tabel 1)

  1. Om 25 μL Tn5-hoofdmengsel te bereiden, mengt u 12,5 μL 2x tagmentatie-DNA-buffer (TD-buffer), 1,25 μL Tn5-transposase (TDE I-enzym) en 11,25 μL nucleasevrij water.
  2. Voeg 25 μL Tn5-hoofdmengsel toe aan elke kernpellet en resuspensie door voorzichtig pipetteren. Incubeer bij 600 tpm gedurende 30 minuten bij 37 °C met behulp van een thermomixer.

5. DNA-zuivering

OPMERKING: De volgende procedure maakt gebruik van de PCR-zuiveringskit die wordt vermeld in de materiaaltabel. Alle andere soortgelijke DNA-zuiveringsmethoden kunnen worden gebruikt.

  1. Voeg 25 μl nucleasevrij water toe aan de 25 μl van het mengsel van Tn5-kernresuspensie verkregen na stap 4.2. Het uiteindelijke volume is 50 μL per monster.
  2. Voeg 250 μL buffer PB toe.
  3. Voeg 5 μL 3 M natriumacetaat (NaOAc) (pH 5,2) toe.
  4. Breng het mengsel over in een kolom (meegeleverd met de referentiekit) en centrifugeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) bij 17.900 × g .
  5. Gooi de doorstroming weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis. Voeg 750 μL buffer PE met absolute ethanol (EtOH) toe en centrifugeer gedurende 1 min bij RT bij 17.900 × g .
  6. Gooi de doorstroming weg en plaats de spinkolom terug in dezelfde opvangbuis. Centrifugeer bij 17.900 × g gedurende 1 minuut bij RT en gooi de opvangbuis met de doorstroming weg.
  7. Om de DNA-fragmenten te elueren, rust u de kolom uit met een nieuwe buis van 1,5 ml, voegt u 10 μL buffer EB toe en laat u 3 minuten op RT staan. Centrifugeer bij 17.900 × g gedurende 1 min bij RT.
    OPMERKING: De monsters kunnen dagenlang bij 4 °C of wekenlang bij −20 °C worden bewaard.

6. PCR-versterking (tabel 2)

OPMERKING: De primers die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn vermeld in tabel 3.

  1. Om getransponeerde DNA-fragmenten te versterken, bereidt u PCR-mastermengsel voor zonder een unieke Ad2.n-barcodeprimer (primer # 2) toe te voegen. Gebruik 38 μL van het PCR-mastermengsel per monster: 11 μL nucleasevrij water, 2 μL van 25 μM Ad1_noMX primer (primer #1) en 25 μL van 2x PCR Master Mix.
  2. Voeg 38 μL van het PCR-mastermengsel toe aan een PCR-buis van 0,2 ml.
  3. Voeg 10 μL van de geëlueerde DNA-fragmenten uit stap 5.7 toe.
  4. Voeg 2 μL van 25 μM primer #2 toe, die specifiek moet zijn voor elk monster.
  5. Voer de PCR uit volgens de fietsomstandigheden die zijn aangegeven in tabel 2.

7. Real-time kwantitatieve PCR-test (qPCR) (tabel 4)

OPMERKING: Deze stap is bedoeld om de extra cycli te bepalen die nodig zijn om het DNA te versterken. Het is optioneel maar sterk aanbevolen, vooral voor nieuwe experimenten.

  1. Bereid qPCR master mengsel zonder primer #2 toe te voegen. Gebruik 9,975 μL van het qPCR-mastermengsel per monster: 4,41 μL nucleasevrij water, 0,25 μL 25 μM primer #1, 5 μL 2x PCR Master Mix en 0,09 μL 100x SYBR Green I.
    OPMERKING: Om 100x SYBR Green I te bereiden, verdunt u de 10.000x bouillon met nucleasevrij water. Omdat het volume van 100x SYBR Green dat ik gebruikte voor het qPCR-mastermengsel verwaarloosbaar is, is het gemakkelijker om een extra mastermengsel van verdund 100x SYBR Green I te maken (bijvoorbeeld voor 8-10 monsters).
  2. Voeg 9,975 μL van het qPCR-mastermengsel toe aan elke put van een qPCR-plaat.
  3. Voeg 0,25 μL van 25 μM primer #2 toe aan elke put.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u dezelfde primer #2 toevoegt om overeen te komen met wat er in stap 6.4 aan elk specifiek monster is toegevoegd.
  4. Voeg 5 μL van de PCR-reactie verkregen na de PCR-amplificatie in stap 6.5 toe en meng door pipetteren.
    OPMERKING: De resterende 45 μL van de PCR-reactie zal worden gebruikt voor de tweede PCR-amplificatie.
  5. Voer de qPCR uit volgens de fietsomstandigheden die zijn aangegeven in tabel 5.
  6. Controleer de versterkingscurven en identificeer het aantal extra PCR-cycli dat nodig is door het aantal cycli te schatten dat ~ 35% van het maximum bereikte (figuur 3A).
    OPMERKING: Doorgaans vereisen 10.000 kernen vijf tot acht extra PCR-cycli.

8. Extra PCR-versterking

  1. Voer de PCR uit met alle resterende 45 μL van de PCR-reactie volgens de berekeningen van stap 7.6 (tabel 6).
    OPMERKING: Elk monster kan een ander aantal versterkingscycli vereisen.

9. Tweede DNA-zuivering met behulp van de PCR-zuiveringskit

  1. Gebruik dezelfde procedures als in rubriek 5, maar elueer de versterkte DNA-fragmenten met 20 μL buffer EB.

10. Selectie van DNA-fragmentgrootte

OPMERKING: Gebruik vaste fase omkeerbare immobilisatiekralen, zoals hieronder beschreven. Alle andere soortgelijke DNA-zuiveringskralen kunnen worden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. De SPRI kraalsuspensie moet volledig worden geresuspendeerd en in evenwicht worden gebracht bij RT met rotatie vóór gebruik.

  1. Breng het geëlueerde DNA over naar een nieuwe PCR-buis en voeg 80 μL buffer EB toe om een eindvolume van 100 μL te maken.
  2. Voeg 55 μL SPRI-kralen (0,55x monstervolume) toe en meng door pipetteren. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en scheid vervolgens gedurende 5 minuten op een mini-magnetische standaard voor PCR 8-buisstrips.
  3. Breng 150 μL van het supernatant over in een nieuwe PCR-buis. Voeg 95 μL SPRI-kralen toe en meng door te pipetteren.
    OPMERKING: Het supernatant bevat DNA van ongeveer 500 bp of kleiner.
  4. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT en scheid vervolgens gedurende 5 minuten op de mini-magnetische standaard. Gooi het supernatant voorzichtig weg.
  5. Was de kralen gedurende 1 minuut met 200 μL van 70% EtOH. Herhaal dit twee keer voor drie wasbeurten in totaal.
    OPMERKING: Verplaats PCR-buizen niet van de magnetische standaard tijdens de wasbeurten.
  6. Draai na de laatste wasbeurt de buizen gedurende 1 minuut op 1.000 × g naar beneden en pipetteer de resterende EtOH eruit. Droog de pellet met het deksel open bij 37 °C gedurende 2 minuten op een PCR-machine.
    OPMERKING: De kralenkorrels mogen na droging slechts enkele kleine scheurtjes vertonen. Vermijd overdroging.
  7. Resuspendeer de pellet met 20 μL buffer EB door pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten bij RT. Scheid gedurende 5 minuten op de minimagnetische standaard en breng vervolgens 18 μL van het supernatant met de uiteindelijke bibliotheek over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    OPMERKING: De bibliotheek kan worden opgeslagen bij −20 °C tijdens het uitvoeren van een kwaliteitscontrole.

11. DNA-kwantificering met behulp van een fluorometer

  1. Om het hoofdmengsel te bereiden, verdunt u 200x dsDNA High Sensitivity (HS) reagens met dsDNA HS-buffer tot een eindconcentratie van 1x.
  2. Voeg voor normen 190 μL van het 1x mastermengsel en 10 μL van standaard 1 of standaard 2 toe aan een fluorometerbuis.
    OPMERKING: Breng de normen bij RT in het donker in evenwicht voordat u met de kwantificering begint.
  3. Voeg voor de bibliotheekmonsters 198 μL van het 1x mastermengsel en 2 μL van elk monster toe aan een afzonderlijke fluorometerbuis.
    OPMERKING: Als de monsterhoeveelheden beperkt zijn, kan het monstervolume worden teruggebracht tot 1 μl en kan het volume van het hoofdmengsel van 1x worden verhoogd tot 199 μl.
  4. Vortex of schud de fluorometerbuizen en laat ze 5 minuten bij RT in het donker zitten. Meet de DNA-concentratie met behulp van de dsDNA HS-test van de fluorometer.

12. Kwaliteitscontrole van de bibliotheek door hooggevoelige elektroforesesystemen

  1. Neem de ATAC-seq-bibliotheek en verdun met nucleasevrij water tot een uiteindelijke concentratie van 1-5 ng / μL.
  2. Analyseer de grootteverdeling van de ATAC-seq-bibliotheken met behulp van zeer gevoelige, geautomatiseerde elektroforesesystemen volgens de protocollen van de fabrikant.

13. Kwaliteitscontrole van de ATAC-seq bibliotheek door gebruik te maken van gerichte qPCR

  1. Neem 5-10 ng van de ATAC-seq-bibliotheek en verdun met 50 μL nucleasevrij water.
  2. Voer de qPCR uit met behulp van primers gericht op de promotors en versterkers waarvan bekend is dat ze actief zijn in adipocyten volgens de cyclusomstandigheden die zijn aangegeven in tabel 7.
  3. Gebruik negatieve controleprimers gericht op gesloten/stille genomische regio's (tabel 7).
  4. Bereken de verrijking van de promotor/versterkers ten opzichte van de negatieve controles (tabel 8).
    OPMERKING: Er wordt verwacht dat het ≥10-20-voudige verrijkingen zal zien met succesvolle monsters.

14. Sequencing

  1. Dien de ATAC-seq-bibliotheken in voor sequencing. Gebruik paired-end sequencing (2 x 34 bp, 2 x 50 bp of langer) met gemiddelde leesgetallen van 10-30 miljoen reads per sample.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om vetweefsel te analyseren met behulp van dit ATAC-seq-protocol, genereerden we Adipoq-NuTRAP-muizen die chow-diëten kregen; Vervolgens isoleerden we adipocytkernen uit epididymaal wit vetweefsel (eWAT), inguinaal wit vetweefsel (iWAT) en bruin vetweefsel (BAT) met behulp van flowcytometrie. De geïsoleerde kernen werden gebruikt voor tagmentatie, gevolgd door DNA-zuivering, PCR-amplificatie, kwaliteitscontrolestappen, sequencing en data-analyse, zoals hierboven beschreven. Het doel van dit representatieve experiment was...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel hebben we een geoptimaliseerd ATAC-seq-protocol gepresenteerd om de toegankelijkheid van adipocytspecifiek chromatine in vivo te beoordelen. Dit ATAC-seq-protocol met behulp van de Adipoq-NuTRAP-muis heeft met succes adipocyt-specifieke chromatine-toegankelijkheidsprofielen gegenereerd. De meest kritische factor voor succesvolle en reproduceerbare ATAC-seq experimenten is de kwaliteit van de kern. Het is van cruciaal belang om de ontleedde vetweefsels onmiddellijk in te vriezen in vloeibare stikst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen relevante of materiële financiële belangen hebben met betrekking tot het onderzoek dat in dit artikel wordt beschreven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het IUSM Showalter Research Trust Fund (naar H.C.R.), een IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases Pilot and Feasibility grant (naar H.C.R.), het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 naar H.C.R.), en de American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 naar H.C.R.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dieren
Adiponectin-Cre muisThe Jackson Laboratory28020
NuTRAP muisThe Jackson Laboratory29899
Reagentia & Materialen
1,5 mL DNA-LoBind buizenEppendorf86-923
100 µm celfilterFalcon352-360
15 mL buizenVWR525-1071
2x TD bufferIllumina15027866
384-well PCR plaatApplied biosystem4483285
40 µm celfilterFalcon352-340
50 mL buizenVWR525-1077
AMPure XP reagens (SPRI kralen)Beckman CoulterA63881
Bioanalyzer High Sensitivity DNA kitAgilent Technologies5067-4626
Klare zelfklevende filmApplied biosystem4306311
DNase/RNase-vrij gedistilleerd waterInvitrogen10977015
Dounce weefselmolenDWK Life Sciences357542
DTTSigmaD9779
DynaMag-96 zijkant magneetThermo Fishers12027
FACS buizenFalcon 28719128
HEPESBoston BioProductsBBH-75
Hoechst 33342Invitrogen2134015
KCl (2 M)Boston BioProductsMT-252
Magneetseparatierak voor PCR 8-buisjesstripsEpiCypher10-0008
MgCl2 (1 M)Boston BioProductsMT-200
MinElute PCR-zuiveringskitQiagen28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR-mastermixBioLabsM0541S
NP40Thermo Fishers28324
PCR 8-buisjesstripUSA scientific1402-4708
Protease-remmercocktail (100x)Thermo Fishers78439
Qubit dsDNA HS-assaykitInvitrogenQ32851
SucroseSigmaS0389-1KG
SYBR Green I (10.000x)InvitrogenS7563
TDE I enzymIllumina15027865
Instrumenten
Flow cytometerBD BiosciencesFACSAria Fusion
Qubit fluorometerInvitrogenQ33226
Real-Time PCR systeemThermo FishersQuantStudio?5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  2. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  3. Bielczyk-Maczynska, E. White adipocyte plasticity in physiology and disease. Cells. 8 (12), 1507(2019).
  4. Basu, U., Romao, J. M., Guan, L. L. Adipogenic transcriptome profiling using high throughput technologies. Journal of Genomics. 1, 22-28 (2013).
  5. Esteve Rafols, M. Adipose tissue: Cell heterogeneity and functional diversity. Endocrinologia y Nutricion. 61 (2), 100-112 (2014).
  6. Kwok, K. H., Lam, K. S., Xu, A. Heterogeneity of white adipose tissue: Molecular basis and clinical implications. Experimental and Molecular Medicine. 48, e215(2016).
  7. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  8. Roh, H. C., et al. Adipocytes fail to maintain cellular identity during obesity due to reduced PPARγ activity and elevated TGFβ-SMAD signaling. Molecular Metabolism. 42, 101086(2020).
  9. Roh, H. C., et al. Warming induces significant reprogramming of beige, but not brown, adipocyte cellular identity. Cellular Metabolism. 27 (5), 1121.e5-1137.e5 (2018).
  10. Buenrostro, J. D., et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  11. Corces, M. R., et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution. Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).
  12. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  13. Wu, J., et al. Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA. Nature. 557 (7704), 256-260 (2018).
  14. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499(2019).
  15. So, J., et al. Chronic cAMP activation induces adipocyte browning through discordant biphasic remodeling of transcriptome and chromatin accessibility. Molecular Metabolism. 66, 101619(2022).
  16. Loft, A., Herzig, S., Schmidt, S. F. Purification of GFP-tagged nuclei from frozen livers of INTACT mice for RNA- and ATAC-sequencing. STAR Protocols. 2 (3), 100805(2021).
  17. Heyward, F. D., et al. Integrated genomic analysis of AgRP neurons reveals that IRF3 regulates leptin's hunger-suppressing effects. bioRxiv. , (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Adipocyte NucleiAdipose TissueChromatin AccessibilityNucleus IsolationFluorescence Activated SortingTransgenic Reporter MiceMitochondrial ContaminationAdipocyte Marker GenesNucleosome Profiling

Gerelateerde artikelen