Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

Samenvatting

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Samenvatting

Cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) is gebaseerd op de beeldvorming van biologische of organische monsters ingebed in hun oorspronkelijke waterige medium; Water wordt gestold in een glas (d.w.z. verglaasd) zonder kristallisatie. De cryo-EM-methode wordt veel gebruikt om de structuur van biologische macromoleculen te bepalen, onlangs met een bijna-atomaire resolutie. De benadering is uitgebreid tot de studie van organellen en cellen met behulp van tomografie, maar de conventionele modus van breedveldtransmissie EM-beeldvorming lijdt aan een ernstige beperking in de dikte van het monster. Dit heeft geleid tot een praktijk van het frezen van dunne lamellen met behulp van een gerichte ionenbundel; De hoge resolutie wordt verkregen door subtomogramgemiddelde van de reconstructies, maar driedimensionale relaties buiten de resterende laag gaan verloren. De diktebeperking kan worden omzeild door gescande sondebeeldvorming, vergelijkbaar met de scannende EM of de confocale laserscanmicroscoop. Terwijl scanning transmissie elektronenmicroscopie (STEM) in de materiaalkunde atomaire resolutie in afzonderlijke beelden biedt, vereist de gevoeligheid van cryogene biologische monsters voor elektronenbestraling speciale overwegingen. Dit protocol presenteert een opstelling voor cryotomografie met behulp van STEM. De actuele basisconfiguratie van de microscoop wordt beschreven voor zowel twee- als driecondensorsystemen, terwijl automatisering wordt geleverd door de niet-commerciële SerialEM-software. Verbeteringen voor batchacquisitie en correlatieve uitlijning met eerder verkregen fluorescentiekaarten worden ook beschreven. Als voorbeeld tonen we de reconstructie van een mitochondrion, wijzend op het binnenste en buitenste membraan en calciumfosfaatkorrels, evenals omliggende microtubuli, actinefilamenten en ribosomen. Cryo-STEM tomografie blinkt uit in het onthullen van het theater van organellen in het cytoplasma en, in sommige gevallen, zelfs de nucleaire periferie van aanhangende cellen in cultuur.

Inleiding

Driedimensionale (3D) visualisatie van organellen is een belangrijke taak in de moderne celbiologie. Gezien de schalen, variërend van tientallen nanometers voor secretoire blaasjes tot vele microns voor de celkern, is het een uitdaging om een enkele microscopietechniek te vinden die geschikt is voor alle toepassingen. Hoewel moderne fluorescentiemicroscopie een groot deel van het bereik kan beslaan in termen van resolutie, verschijnen alleen de gelabelde moleculen. Het cellulaire theater blijft het rijk van de elektronenmicroscopie. Conventionele methoden van chemische fixatie, plastic inbedding en kleuring met zware metalen zijn sterk invasief, dus de resultaten kunnen afhangen van de details van de monstervoorbereiding. Cryo-EM daarentegen wordt beperkt door de noodzaak om het waterige medium te verglazen; IJskristallen die de elektronenverlichting vormen, diffracteren de elektronenverlichting, waardoor contrastartefacten met een hoger contrast ontstaan dan het organische materiaal van belang.

Het afgelopen decennium is er een wildgroei aan EM-beeldvormingstechnieken ontwikkeld of aangepast voor cellulaire studies¹. Hogedrukbevriezing in combinatie met iteratief gefocusseerde ionenbundel (FIB) frezen en seriële oppervlaktebeeldvorming met behulp van de scanning elektronenmicroscoop (d.w.z. FIB-SEM) is momenteel de voorkeursmethode voor grote monsters². Cryogene zachte röntgentomografie (cryo-SXT) is geschikt voor monsters van meerdere microns groot, beperkt door de karakteristieke absorptielengte van de zachte röntgenstralen in water ^3,4,5. Deze schaal omvat veel intacte celtypen en de kwantitatieve aard van het röntgenabsorptiecontrast voegt een aspect toe van concentratiemeting⁶ of spectroscopie⁷. In combinatie met subtomogrammiddeling biedt cryotransmissie-elektronentomografie (cryo-ET), gebaseerd op fasecontrasttransmissie-elektronenmicroscopie (TEM), de hoogste resolutie voor macromoleculen of complexen ^8,9,10. Het is echter zeldzaam dat intacte organellen zo regelmatig zijn dat ze in hun geheel kunnen worden gemiddeld. Bovendien is de conventionele modus van breedveld-TEM voor monsterdikte beperkt tot een paar honderd nanometer door de combinatie van inelastische verstrooiing (met energieverlies) in het monster en chromatische aberratie in de magnetische objectieflens^11,12. De grote energiespreiding dicteert het gebruik van een energiefilter om de resulterende onscherpe waas te verwijderen, maar het gevoelige exemplaar lijdt nog steeds stralingsschade terwijl het beeldsignaal exponentieel zwakker wordt met toenemende dikte.

De alternatieve beeldvormingsmodus, scanning transmission EM (STEM), omzeilt de noodzaak van energiefiltering en behoudt de inelastisch verstrooide elektronen voor beeldvorming, zij het momenteel met een lagere resolutie dan voor TEM-tomografie (figuur 1). In feite wordt er geen echt beeld gevormd. In plaats daarvan worden, net als bij een scan-EM, metingen punt voor punt gedaan en wordt het beeld door de computer geassembleerd. De vergroting wordt alleen bepaald door de grootte van de scanstappen zonder de lensstromen te veranderen. Indien correct geconfigureerd, kan het bruikbare bereik van de monsterdikte voor cryo-STEM-tomografie (CSTET) 1,5 of zelfs 2 μm bereiken, hoewel de comfortzone, waar de nuttige signaalintensiteit een aanzienlijk deel van de verlichting blijft, ongeveer 600-900 nm^11,13 is. Dit is voldoende om een groot deel van het cytoplasma te zien, en af en toe een rand van de celkern. In de praktijk zien we dat vitrificatie door de standaardmethode van het duiken in cryogene vloeistof een ernstiger beperking van de dikte oplegt dan STEM-beeldvorming. Het doel van dit videoartikel is om de integratie van CSTET in de gereedschapskist voor cel- en organelbeeldvorming in onderzoekslaboratoria en microscopiefaciliteiten te vergemakkelijken.

De eerste uitdaging is dat microscoopbewerkingen in CSTET nog niet gestandaardiseerd zijn voor life science-toepassingen op de manier waarop ze dat zijn geweest voor cryo-TEM-tomografie. STEM-hardware is zelden (of nooit) gericht geweest op de cryo-EM-markt. Dit verandert echter met de nieuwste generatie microscopen en veel bestaande gereedschappen kunnen achteraf worden ingebouwd. STEM als techniek heeft een vlucht genomen en grotendeels overgenomen in de materiaalwetenschappen, waar er ook ontluikende interesse is in cryogene en laaggedoseerde methoden^14,15. De materiaalwetenschappelijke literatuur is rijk aan acroniemen BF-STEM, ADF-STEM, HAADF-STEM, 4D-STEM, DPC-STEM, enz., Die bijdragen aan de verwarring. We bieden hier een aanbevolen startpunt dat, in onze collectieve ervaring aan het Weizmann Institute of Science, het meest algemene protocol biedt voor nuttige resultaten op basis van bright field (BF) STEM-beeldvorming¹⁶. Op geen enkele manier put het uit of verkent het zelfs het scala aan mogelijkheden, maar het zal dienen als basis voor verdere verbeteringen. Hoewel we de nadruk leggen op cryo-STEM, is het grootste deel van het protocol even relevant voor stemtomografie bij kamertemperatuur van in plastic ingebedde secties.

De essentie van STEM is om het monster te scannen met een gefocusseerde elektronensonde (figuur 1), de verlichtingskegel, en om signalen van het diffractie (verstrooiing) vlak in transmissie te registreren, pixel voor pixel, om 2D-beelden te produceren^17,18. Amorfe exemplaren, waaronder de meeste cellulaire materialen, zullen een diffuus verstrooiingspatroon produceren in transmissie. De eenvoudigste praktische STEM-configuratie is om een cirkelvormige detector te plaatsen om de centrale schijf op te nemen (d.w.z. de sondeverlichting die zonder monster zou worden verzonden). Het monster verstrooit elektronen weg van deze verlichtingskegel in die mate dat het signaal afneemt. Dit levert een BF-beeld op - het exemplaar lijkt donker op een heldere achtergrond. Een ringvormige detector kan ook (of in plaats daarvan) worden gebruikt om de verstrooiing van het monster buiten de verlichtingskegel te detecteren. Met het monster verwijderd, is er geen signaal. Wanneer een exemplaar op zijn plaats is, worden objecten helder weergegeven op een donkere achtergrond in de afbeelding met het donkere veld (DF). De nomenclatuur voor STEM (BF, ringvormig donker veld [ADF], ringvormig donkerveld met hoge hoek [HAADF], enz.) verwijst voornamelijk naar de reeksen van verzamelhoeken voor de detectoren.

De convergentiehoek van de verlichting vertegenwoordigt een essentiële aanpassing van STEM aan cellulaire tomografie. Wanneer hoge resolutie de hoogste prioriteit heeft, moet de convergentiehoek zo groot mogelijk zijn. (Dit is vergelijkbaar met confocale laserscanmicroscopie; de resolutie wordt bepaald door de sondediameter, die schaalt als de golflengte gedeeld door het numerieke diafragma. Merk op dat we verwijzen naar de halve hoek of semi-convergentiehoek voor EM.) Wanneer de prioriteit daarentegen de scherptediepte is, biedt een compromis in resolutie een groot voordeel, omdat de scherpgestelde bundel ongeveer evenwijdig blijft voor een afstand gelijk aan tweemaal de golflengte gedeeld door een halve hoek in het kwadraat. Idealiter blijft het volledige celvolume in focus¹⁹. Bij 300 keV is de elektron deBroglie golflengte bijvoorbeeld 0,002 nm, dus een convergentie van 1 mrad levert een resolutie op van 2 nm en een scherptediepte van 4 micron. Onder deze omstandigheden kan tomografie zelfs zonder focus worden uitgevoerd tijdens het gegevensverzamelingsproces, maar slechts één keer aan het begin van de acquisitie. Een conventionele tomografie-compatibele STEM kan een semi-convergentiehoek van 7 of 8 mrad bereiken; Daarom zouden we in principe een resolutie in de orde van 0,25 nm kunnen bereiken, maar dan met een brandpuntsdiepte van slechts 62 nm. Dit is duidelijk te dun voor cellulaire beeldvorming. Meer geavanceerde microscopen met drie condensorlenzen bieden een continue aanpassing van de semi-convergentiehoek over een aanzienlijk bereik. Bij de meer traditionele configuratie met twee condensors wordt de convergentie discreet vastgesteld door het diafragma van de condensor (C2).

Voor robuuste, in plastic ingebedde monsters kan men bij elke kanteling een brandpuntsreeks opnemen en combineren voor een hoge resolutie²⁰, maar voor cryogene monsters is het stralingsbudget te ernstig beperkt. Ten slotte moet men bij het afwegen van de voordelen van BF- of DF-beeldvorming, voor dikke monsters, rekening houden met de effecten van meervoudige elastische verstrooiing in het monster. Het BF-signaal wordt minder beschadigd door meervoudige verstrooiing en toont een hogere resolutie voor dikke exemplaren^16,21.

Een handige vuistregel was om verzamelhoeken in te stellen die meerdere malen groter waren dan de convergentie. Hoe dikker het exemplaar, hoe groter de verzamelschijf moet zijn. Een te kleine schijf zorgt voor een lage signaalintensiteit; Een te grote schijf zal resulteren in een slecht beeldcontrast, omdat alleen de verstrooiing met de hoogste hoek zal bijdragen. De verzamelhoeken moeten worden geoptimaliseerd voor een bepaald monster. De detectorhoeken als functie van de (diffractie)cameralengte moeten onafhankelijk worden gekalibreerd. Ze kunnen gemakkelijk worden weergegeven door de microscoopsoftware. In de praktijk is een factor twee tot vijf in de verhouding tussen de halve hoeken van de verzameling en de verlichting, respectievelijk θ tot α (figuur 1), een aanbevolen uitgangspunt voor CSTET van cellulaire monsters.

Het volgende protocol beschrijft de werking van STEM-tomografie met behulp van de populaire SerialEM-software voor microscoopbesturing^22,23. SerialEM is niet gebonden aan een specifieke fabrikant en wordt veel gebruikt in TEM-tomografie. De meeste bewerkingen bij het instellen voor tomografie kunnen rechtstreeks van TEM worden overgedragen. De SerialEM-strategie is om het scansysteem te modelleren als een camera. Dit maakt de eenvoudige crossover van TEM naar STEM mogelijk. Men moet echter in gedachten houden dat parameters zoals vergroting en binning volledig kunstmatig zijn. De belangrijke parameters zijn het gezichtsveld in microns, het aantal pixels in het gezichtsveld en de belichtingstijd. De pixelafstand, of sampling, is het lineaire veld gedeeld door het aantal pixels, terwijl de verblijftijd het aantal pixels is gedeeld door de belichtingstijd.

De minimale configuratie voor STEM en CSTET omvat drie functies op de microscoop: een scangenerator, een STEM-detector en tomografiebesturingssoftware. Het protocol verwijst naar de nomenclatuur van FEI/Thermo Fisher Scientific (TFS), maar de begrippen zijn generiek. De propriëtaire software van TFS is beschreven in JoVE voor TEM²⁴, en de STEM-werking is zeer vergelijkbaar.

We gaan ervan uit dat de microscoop vooraf is uitgelijnd door het serviceteam of ervaren personeel en dat een kolomuitlijning kan worden opgeroepen door een bestand te laden. Kleine aanpassingen worden directe uitlijningen genoemd en kunnen worden opgeslagen in zogenaamde FEG-registers (TFS-microscopen). Directe uitlijningen omvatten rotatiecentrum, draaipunten, diffractie-uitlijning en compensatie voor condensastigmatisme. Aanpassingen moeten iteratief worden uitgevoerd. Merk op dat TFS-microscopen verschillende nanoprobe (nP) en microprobe (μP) modi implementeren; voor een gegeven condensoropening bieden deze een relatief smal of breed gezichtsveld met parallelle verlichting in TEM en een min of meer convergente (strak gefocusseerde) elektronenbundel in STEM, respectievelijk. Andere fabrikanten gebruiken verschillende schema's om het bereik van convergentiehoeken te dekken.

Voordat wordt begonnen, moeten het gezichtsveld L en de bemonstering (pixelbreedte) l worden gekozen, afhankelijk van het onderzochte monster. Voor l = 1 nm/pixel moet bijvoorbeeld een afbeelding van 4.000 x 4.000 pixels worden gekozen die een gezichtsveld van 4 μm² beslaat. De resolutie is in het beste geval tweemaal de ruimtelijke bemonstering, dus 2 nm, en de sondediameter, d, moet daarmee overeenkomen. Kalibratie van de sondehoek valt buiten het bestek van dit protocol, dus we gaan ervan uit dat er een tabel of een schermaflezing beschikbaar is. De diameter van de sonde is ongeveer de golflengte van het elektron gedeeld door de semi-convergentiehoek (in radialen): d = λ/θ. De golflengte, λ, is 0,002 nm voor 300 keV en 0,0025 nm voor 200 keV elektronen, dus θ van 1 mrad levert een spotdiameter op van respectievelijk 2 of 2,5 nm.

Het protocol wordt gepresenteerd in een progressie van toenemende complexiteit. De eerste taak is om een STEM-beeld te produceren, dat afhankelijk is van de software van de microscoopfabrikant, en vervolgens een kantelserie, waarvoor we SerialEM gebruiken. Veel lezers zullen ongetwijfeld bekend zijn met SerialEM, dus de meer gecompliceerde taken zullen vanzelf komen. Het is niet nodig om de procedures strikt te volgen. Ontwikkelingen met betrekking tot automatisering kunnen zowel voor STEM als voor TEM rechtstreeks worden geïmplementeerd. Ervaren gebruikers zullen het protocol waarschijnlijk omkeren, te beginnen met correlatieve registratie van fluorescentiekaarten en doorgaan met het instellen van batchtomografie. Verdere details zijn te vinden in de uitgebreide documentatie- en zelfstudiebibliotheken voor SerialEM zelf, waaronder een recent JoVE-artikel over de nieuwste ontwikkelingen in automatisering²⁵.

Protocol

1. STEM-opstelling

1. Voorlopige uitlijningen: Laad het kolomuitlijningsbestand en open vervolgens Kolomkleppen. Als u een cryohouder aan de zijkant gebruikt, opent u het Cryo-schild. Start in de TEM-modus. De straal moet op het scherm verschijnen. Zo niet, verlaag dan de vergroting.
2. Breng de microscoop naar eucentrische focus door op de knop op het bedieningspaneel te drukken.
3. Stel de spotgrootte in op een handige waarde (bijvoorbeeld 6) voor het visualiseren van het fluorescerende scherm, rechtstreeks of met de ingebouwde camera (afhankelijk van het microscoopmodel).
4. Zet de microscoop op STEM-modus en controleer of de scherpstelling de condensorlenzen (intensiteit) gebruikt in plaats van het objectief. Stel eucentrische focus. Ga vervolgens uit de diffractiemodus voor initiële aanpassingen.
5. Zorg ervoor dat de balk niet leeg is. Verklein de vergroting totdat de straal op het scherm verschijnt. Pas de bundelverschuiving naar het midden aan en verhoog de vergroting in stappen tot ongeveer 70 kx terwijl de bundel in het midden blijft.
6. Plaats de gewenste condensoropening, meestal 50 μm. Controleer de centrering van het diafragma. Wanneer je de scherpstelknop iets heen en weer draait, moet de spot uitzetten en samentrekken, maar op zijn plaats blijven, alsof een vlak een denkbeeldige verticale zandloper snijdt. Als het diafragma niet gecentreerd is, zal de verlichting zijdelings verschuiven, alsof de zandloper gekanteld is.
7. Breng de bundel naar focus en druk op Intensity List Focus (indien beschikbaar) op het tabblad Alignments, of keer terug naar eucentrische focus zoals in 1.2. Pas de positie van de balk aan naar het midden.
8. Pas het rotatiecentrum aan. Draai het focusstapwiel naar het minimum of één stap erboven, zodat de bundel zachtjes pulseert en zorg ervoor dat deze stationair blijft terwijl de focus op en neer beweegt.
9. Selecteer de draaipunten en breng de twee punten samen met X- en Y-aanpassingen.
   OPMERKING: Als een faseplaat op een TFS-instrument is geïnstalleerd, mag alleen de X-aanpassing worden gebruikt.
10. Verdraai de bundel iets en pas de condensorstigmators aan om de schijf rond te maken. Ga op en neer door focus om te optimaliseren; Er mag geen neiging zijn om in de ene of de andere richting te rekken bij het passeren van de focus.
11. Normaliseer de lenzen. Verhoog vervolgens de vergroting geleidelijk tot ongeveer 240 kx terwijl u de bundelverschuiving gebruikt om de plek gecentreerd te houden en herhaal de aanpassingen van het rotatiecentrum en het draaipunt (stappen 1.6-1.8).
12. Ga terug naar de diffractiemodus. De bundel moet als een uniforme schijf op het fluorescerende scherm verschijnen. De cameralengte (CL) regelt nu effectief de optische afstand tot de detector, zoals bij röntgenkristallografie. Wijzig het en kijk hoe de schijf samentrekt en vergroot, alsof de schermlocatie naar of van het monster zou bewegen. Deze kegel vertegenwoordigt de BF-verlichting.
    OPMERKING: Voor elke CL moet een diffractie-uitlijning worden aangepast om de geprojecteerde bundel naar de centrale as te brengen. Het is normaal gesproken niet nodig om ze allemaal te verfijnen, alleen de ene (of enkele) die voor detectie moet worden gebruikt.
13. Schakel de STEM-modus in bij hoge vergroting.
    1. Als er een BF STEM-detector beschikbaar is, begin daar dan mee. Breng het podium naar een gebied met een leeg gat en pas de diffractie-uitlijning aan om de balk te centreren met behulp van de gewenste CL.
    2. Veel microscopen zijn alleen uitgerust met een HAADF-detector; er is een truc om dit als BF-detector te gebruiken. Trek eerst de detector in, centreer de bundel zoals hierboven in de directe uitlijningen, plaats een objectief diafragma, meestal een kleine zoals 20 μm, en pas de positie aan om de bundel gelijkmatig te omringen. (De eenvoudigste manier om dit te doen is door een monster of een testraster in te voegen om een halo rond de verlichting te zien). Gebruik vervolgens de diffractie-uitlijning om de bundel van de as naar het detectorgebied te verplaatsen. Plaats de detector en trek deze in terwijl u naar de straal op het scherm kijkt om te bevestigen dat de straal door de detector wordt geblokkeerd.
    3. Start een scan in de microscoopsoftware en pas de helderheids- en contrastinstellingen (B / C) aan, zodat het signaal dicht bij 0 is wanneer de bundel leeg is en dicht bij verzadiging wanneer de volledige verlichting op de detector valt. Gebruik de scopeweergave om te helpen. De instellingen kunnen op onverwachte manieren worden gekoppeld, dus de aanpassing moet meerdere keren worden herhaald.
14. Breng de microscoop terug naar een relatief lage vergroting in het hoge vergrotingsregister (SA-modus), zonder in de lage mag (LM) -modus te gaan.
15. Noteer de schermstroom ter referentie later (zie stap 3.1.1). De stroom kan worden gewijzigd met de pistoollens en de spotgrootte-instellingen, zoals in TEM, met toenemende aantallen die overeenkomen met een verminderde stroom.
16. Sla op dit punt een FEG-register op om een terugkeer naar standaardwaarden te vergemakkelijken.
    OPMERKING: De faciliteit kan een standaardset FEG-registers voorbereiden, zodat gebruikers kunnen beginnen met een werkende configuratie.

2. Het plaatsen van het monster

1. Controleer in de LM TEM-modus of het raster niet ondoorzichtig is. Zoek een rastervierkant voor het maken van de eerste aanpassingen. Het is handig om een leeg gebied, een gat of een gescheurd rastervierkant te vinden. Noteer de podiumposities om er gemakkelijk naar terug te keren.
2. Breng het monster op eucentrische hoogte. Er zijn verschillende methoden om dit te doen. Gebruik bijvoorbeeld de werknaalwiebelaar om het raster te kantelen terwijl u de monsterhoogte langs de Z-as beweegt totdat de afbeelding niet meer zijdelings verschuift. U kunt ook enkele functies op het weergavescherm markeren en het podium tot 30° kantelen. De functie beweegt zijdelings. Pas de hoogte van het monster aan om het terug te brengen naar de oorspronkelijke positie. Vergroot de vergroting of het stadium kantelen om te verfijnen. Terug naar 0° kanteling.
3. Ga terug naar de STEM-modus en plaats de STEM-detector. Ga naar de laagste hoge vergrotingsmodus (SA). Zorg ervoor dat een afbeelding wordt waargenomen op het computerscherm. Scan snel om onnodige blootstelling te voorkomen; 1 μs/pixel of minder zou typisch zijn. Houd er rekening mee dat het beeld aan de linkerrand vervormd kan lijken wanneer de scan te snel is (zie figuur 2).
4. Druk op Eucentrische focus, verhoog de vergroting en verfijn de focus tijdens het scannen. Het is handig om de focus loep te gebruiken die door de microscoopsoftware wordt geleverd.
5. Stem het astigmatisme van de condensor af. Dit kan het meest nauwkeurig worden gedaan door de Ronchigram-methode. Stel met de bundel over een dun monstergebied scherp op het punt waar de uitgezonden bundel opblaast, tussen schaduwbeelden van het monster aan weerszijden. Pas vervolgens de afstemming van de condensor aan om de centrale schijf rond te maken. Dit vereist enige oefening, vooral voor cryogene monsters.
   OPMERKING: Een alternatief is om enkele gouddeeltjes te vinden (vaak gebruikt als fiduciale markers voor uitlijning in tomografie). Verhoog de vergroting en focus op en neer, stem het astigmatisme af zodat de deeltjes rond blijven zonder rek in beide richtingen.
6. Ga naar de LM STEM-modus en ga verder met scannen om een interessant gebied te vinden. Pas indien nodig de B/C-instellingen van de detector aan (stap 1.13.3), ongeveer op dit punt.

3. Een afbeelding opnemen

1. Schat de dosis voor opname. Streef als vuistregel naar 100-150 e^-/Ų voor het hele tomogram. Controleer de dosistolerantie per monster. De stroom in Ampère (A) gedeeld door de lading per elektron vertegenwoordigt een telling van e^-/s, die wordt vermenigvuldigd met de belichtingstijd, T, in seconden en gedeeld door het gezichtsveld in Ų. Druk voor het gemak de stroom uit in nanoampères (zoals gelezen van het scherm), de breedte van het gezichtsveld in micrometers en de belichtingstijd van het frame in seconden, met geschikte factoren:
   
   Dit aantal moet worden vermenigvuldigd met het aantal kantelingen om de totale belichting in de reeks te krijgen. Bijvoorbeeld, met een stroom I = 0,04 nA, een veld L = 4 μm en een belichtingstijd van 12 s, verkrijgen we 1,9 e-/Å 2 per kanteling, of ongeveer 110 e^-/Ų voor een reeks van 61 projecties.
2. Breng het podium terug naar een gat (of trek het raster in) en pas de straalstroom aan met behulp van spotgrootte en / of pistoollensinstellingen om de gewenste schermstroom te bereiken. Als de meting 0 is, plaatst u een groter C2-diafragma om de stroom te verhogen. Corrigeer vervolgens door de meting te delen door het kwadraat van de verhouding van diameters en keer ten slotte terug naar het kleinere diafragma.
3. Verfijn de B/C-instellingen volgens stap 1.13.3 en breng het podium ten slotte terug naar een interessegebied en controleer de directe uitlijningen en astigmatisme opnieuw onder de beeldvormingsomstandigheden.
4. Verkrijg een testafbeelding.

4. Tomografie met SerialEM

1. Start de SerialEM-server op de microscoopcomputer (SerialEM wordt normaal gesproken op een andere geïnstalleerd). Open vervolgens SerialEM. STEM verschijnt in SerialEM als een camera, met dezelfde interface. Zorg ervoor dat de communicatie op de juiste manier wordt uitgevoerd voor de installatie. Het microscooptabblad moet bijvoorbeeld de juiste vergroting weergeven. Als dit niet werkt, stop dan hier en los het probleem op.
2. Zoek het tabblad camera en script en open Setup. Zorg ervoor dat de STEM-camera is geselecteerd en kies voor elke modus geschikte binning- en verblijftijden. Zorg ervoor dat de juiste detector (of detectoren) wordt weergegeven in het vak "kanalen om te verkrijgen" linksonder. Druk onderaan op Verkrijgen om te testen. Nogmaals, ga niet verder als er niets gebeurt, of als de balk niet leeg is. Stop en controleer de communicatie.
   OPMERKING: De modi worden op dezelfde manier gebruikt als TEM-tomografie. Binning is een kunstgreep voor compatibiliteit met TEM. De belangrijke parameter is het aantal pixels; Verschillende microscoopsystemen gebruiken verschillende binning om hetzelfde aantal te bereiken.
   1. Bekijken en zoeken moeten snelle scans zijn met relatief weinig pixels (bijvoorbeeld 512 x 512 pixels op 1 s).
   2. Focus is over het algemeen een klein gebied met snelle opname. Kies daarom in de lage dosismodus Focus om een andere vergroting te hebben dan de opnamemodus, wat kan helpen bij de nauwkeurigheid. Laat de spotgrootte ongewijzigd.
   3. Gebruik voor de opnamemodus de hierboven gekozen parameters in de schatting van de belichting. Voeg, indien beschikbaar, ook Dynamische focus in, waarmee de scherpstelling regel voor regel in een gekantelde afbeelding wordt gecorrigeerd.
   4. Kies voor het gemak later de binning voor voorvertoning om identiek te zijn aan die voor Weergave (zie Verbetering #1, stap 5.5). De afbeeldingsgrootte (aantal pixels) hoeft niet hetzelfde te zijn.
   5. Gebruik de proefmodus om het recordgebied gecentreerd te houden tijdens het aanschaffen. Het kan vergelijkbaar zijn met View, maar zorg ervoor dat er geen scanvervormingen zichtbaar zijn aan de linkerkant van het frame (zie Figuur 2 voor een voorbeeld). Nogmaals, in de modus Lage dosis kan de proefversie een andere vergroting hebben dan in de opnamemodus.
   6. Gebruik de montagemodus onmiddellijk voor de rasterscan. Het moet voldoende pixeldicht zijn om interessegebieden te vinden; Aanbeveling: 512 x 512 of 1024 x 1024. Zorg ervoor dat het beeld goed is, met een behoorlijk dynamisch bereik (te zien in beeldweergavebedieningen), omdat deze modus wordt gebruikt voor het vinden van de monstergebieden.
   7. Sla het instellingenbestand op zodat deze keuzes als standaard worden behouden voor de volgende sessie (die binnenkort kan optreden als het programma crasht).
3. Test de beeldverschuivings- en faseverschuivingskalibraties. Klik in de microprobe-modus (of nanoprobe) op Afbeelding weergeven, beweeg er met de muis overheen, houd de knop ingedrukt en sleep diagonaal met ongeveer een kwart van het gezichtsveld. Neem vervolgens een andere weergave. De afbeeldingen moeten elkaar perfect overlappen. Herhaal dit door opnieuw te slepen terwijl u de Shift-toets ingedrukt houdt (om een werkgebiedbeweging af te dwingen). De beelden moeten elkaar goed overlappen, maar misschien minder precies.
4. Ga naar de LM-modus en test de faseverschuiving. Als deze tests mislukken, stopt u en lost u problemen op. De rest werkt niet.
5. Maak een montage LM-kaart van het hele raster. Dit kan ook in TEM.
   1. Ga naar de STEM-modus met laagste vergroting waarbij het beeld niet wordt geblokkeerd door diafragma's, meestal ongeveer 185x.
   2. Klik op het menu Navigator > Openen. Klik vervolgens op het menu Navigator > Navigatie. Opties > Schakel Kaarten converteren naar bytes uit.
   3. Selecteer het menu Navigator > Montaging & Grids > Volledige montage instellen. Er wordt een menu geopend. De opties die u moet controleren zijn: Fase verplaatsen in plaats van afbeelding verschuiven, Kaart maken van elke montage als Navigator is geopend en Montagetoewijzing gebruiken, geen recordparameters. Het afbeeldingsraster moet ongeveer 6 x 6 of 7 x 7 zijn. Zoek naar het totale gebied dat moet worden geregistreerd. Als er te veel afbeeldingen nodig zijn, wordt de vergroting mogelijk niet correct afgelezen van de microscoop (figuur 3). Stop en controleer.
   4. Als u de montage-acquisitie wilt starten, drukt u op Start op de montagebesturingselementen of op Montage onder Camera en script. Een ander menu wordt geopend om de bestandsparameters te kiezen: mrc, opslaan als gehele getallen en in weer een ander dialoogvenster de bestandsnaam voor opslag kiezen. Zorg ervoor dat u gegevens opslaat in het geschikte gegevensgebied en niet onder de eigen gebruikersinstellingen van SerialEM. Het wordt aanbevolen om geen grote gegevens op te slaan op de C-schijf waar het systeem zich bevindt.
   5. Wanneer de acquisitie is voltooid, verschijnt de montage in het hoofdvenster (figuur 4). Men kan nu rond het raster navigeren met behulp van de markering en punten op de Navigator, net als in TEM.
6. Controleer de correctie van het astigmatisme opnieuw. Meestal is het voldoende om een klein gebied snel te scannen en samen met de scherpstelling aan te passen, zodat puntachtige kenmerken zoals gouden nanodeeltjes volledig rond blijven als ze in en uit focus gaan (zoals op een SEM) bij hoge vergroting. Conservatiever kan men de directe uitlijningen van stappen 1.5-1.8 herhalen voordat astigmatisme wordt opgelost.
7. Lijn de hoge vergrotingsafbeelding uit op de LM-montage.
   1. Ga naar een positie op de LM-montage met een gemakkelijk herkenbare functie. Voeg een punt toe, klik op het venster Navigator > Punten toevoegen en klik op de functie. Druk nogmaals (stop met toevoegen) om te deactiveren.
   2. Maak een weergave- of proefafbeelding met de laagste hoge mag (HM) vergroting en zoek het aangegeven item. Plaats de markering daar (groen kruis) en met het bijbehorende punt gemarkeerd in het Navigator-venster, in het Navigator-menu > Shift to Marker..., in het dialoogvenster dat wordt geopend, kiest u Alle kaarten en Shift opslaan, zoals weergegeven in Afbeelding 5.
   3. Test door het werkgebied naar andere posities te verplaatsen en te controleren of de HM-afbeelding is gecentreerd op dezelfde locaties die zijn geselecteerd in de LM-montage. Als de functie niet zichtbaar is in de HM-afbeelding, is de verschuiving tussen LM- en HM-modi mogelijk te groot. Maak in dit geval een polygoonmontage over een groter gebied. Klik op Navigatorvenster > Polygoon toevoegen, kies enkele punten en klik nogmaals op Polygoon toevoegen om te sluiten. Klik op het menu Navigator > Montaging en Rasters > Besturingselementen voor polygoonmontage instellen en Montage instellen > Start. Zoek vervolgens de bijbehorende punten zoals hierboven en klik op Shift to Marker ....
8. Stel de modus voor lage doses in.
   1. Open het tabblad Low Dose Control (Lage dosisregeling ) en vink het vakje Low Dose Mode (Lage dosismodus ) aan.
   2. Vink Continue update aan en ga naar Weergave. Kies de microscoopvergroting voor deze modus, meestal de laagste of naast de laagste. Kies elk van de volgende modi en stel de juiste vergroting in. De opname moet worden ingesteld om de gewenste pixelgrootte te bereiken en de focusvergroting moet hoog genoeg zijn zodat fiduciale markeringen of andere functies met een hoog contrast voor scherpstellen duidelijk worden opgelost. Schakel vervolgens onmiddellijk Continue update uit.
      OPMERKING: De proefmodus kan op dezelfde manier worden ingesteld als Record, in welk geval het trackinggebied uit het recordgebied moet worden verplaatst om de blootstelling te minimaliseren, of naar een lage vergroting, die een groot deel van de omgeving omvat.
   3. Maak een weergaveafbeelding en stel de proefpositie in met Positie van gebied definiëren: Proefversie.
      OPMERKING: Aanbeveling #1: Gezien de verandering in het bemonsterde gebied en de tijd, kan de toegevoegde blootstelling voor een studie met een lage mag minimaal zijn. Zolang de rasterbalk niet in het gezichtsveld komt, is deze methode van volgen meestal betrouwbaarder. Aanbeveling #2: Het is ook mogelijk om de spotgrootte bij te werken om de dosis aan te passen voor verschillende modi, zoals Focus. Voor stabiliteit in de instellingen van de microscoopoptiek raden we aan dit niet te doen, maar de spotgrootte te laten zoals geschikt is voor Record en vervolgens de belichtingstijd indien nodig aan te passen voor de snellere scanmodi.
   4. Klik op het tabblad Low Dose Control > Ga naar: Rec., klik vervolgens op het menu Navigator > Open Imaging States > Add Current State. Geef het een naam zodat het gemakkelijk kan worden opgeroepen (bijv. μP STEM voor microprobe STEM). Verschillende toestanden kunnen worden gedefinieerd voor verschillende taken.
9. Verplaats het werkgebied naar een interessante locatie voor tomografie (meer over het gebruik van de Navigator hieronder).
   1. Voeg een punt toe in de Navigator door te klikken op Navigator-venster > Punten toevoegen.
   2. Verfijn de eucentrische hoogte door Taken > Eucentriciteit > Ruw te selecteren. Navigator-venster > Update Z.
   3. Stel de gebieden voor Focus en Trial in. Maak eerst een weergaveafbeelding. Selecteer vervolgens op het tabblad Controle van lage dosis onder Positie van gebied definiëren de optie Focus of Proefversie. Pas de posities aan voor de twee gebieden langs de kantelas. De focus mag het recordgebied niet overlappen.
      OPMERKING: Houd er rekening mee dat er enige overshoot is, met name aan de linkerkant, dus geen van beide moet direct naast het recordgebied worden ingesteld. De omvang van de overschrijding kan op een testgebied worden geëvalueerd door herhaaldelijk te scannen op de recordvergroting en vervolgens de vergroting te verkleinen om een breder beeld te krijgen.
10. Voor een goede meting (optioneel met ervaring), kantelt u het werkgebied naar +60° en vervolgens -60°, waarbij u telkens een weergave- of voorvertoningsafbeelding maakt om ervoor te zorgen dat de rasterbalk niet in het gezichtsveld van het recordgebied komt dat in het groen wordt weergegeven.
11. Stel de kantelserie in.
    1. Open een nieuw bestand om de gegevens op te slaan door op Bestand > Nieuw openen te klikken en een bestandsnaam te kiezen. Selecteer het menu Tilt-serie > Tilt-serie instellen (afbeelding 6). Probleemoplossing: als de knop Nieuw openen grijs is, controleert u of de vorige kantelreeks is beëindigd. Als dit niet het geval is, beëindigt u door op Tilt Series > Beëindigen te klikken.
    2. Stel de extreme kantelhoeken in de vakken Kantelen naar en Eindigen bij in, meestal respectievelijk -60° en +60°, evenals de verhoging, meestal 2°.
    3. Voor de dosissymmetrische modus (aanbevolen - zorg ervoor dat de modus Lage dosis nog steeds actief is), controleert u Run series in twee richtingen van ___. De blanco is normaal gesproken 0, maar kan worden gebruikt om voorgekantelde FIB-lamellen te compenseren (bijvoorbeeld bij 20°).
    4. Schakel voor de eenvoud het selectievakje Belichtingstijd constant houden in. Het veranderen hiervan vereist enige herwerking van de blootstellingsberekening en kan ook interfereren met algebraïsche reconstructies (bijv. ART/SART/SIRT), die geprojecteerde intensiteiten vergelijken met oorspronkelijke gegevens (zie stap 7.1).
    5. Vink Autofocus overslaan aan. Een kleine semi-convergentiehoek, zoals 1 mrad, impliceert zo'n lange scherptediepte dat het misschien niet nodig is om scherp te stellen. Stel als test scherp op 0°, kantel naar 60° of -60° en druk op Opnemen. Het behouden van de focus is vooral een kwestie van precieze eucentrische hoogte. Voor grotere convergentie kan het nodig zijn om tijdens de serie scherp te stellen. In dit geval kunt u een weergave maken en op het tabblad Regeling lage dosis de positie van het gebied en de focus definiëren en het scherpstelgebied aanpassen.
    6. Initiële en laatste acties: Als de eucentrische hoogteverstelling nauwkeurig is uitgevoerd, is het niet nodig om deze te herhalen. Schakel het selectievakje Kolomkleppen sluiten aan het einde van de serie uit, tenzij er een goede reden is om dit niet te doen.
    7. Voor het bijhouden van de besturingsparameters zijn er veel opties. Voor onbeheerde gegevensverzameling is de hoogste prioriteit om te voorkomen dat het programma stopt voor gebruikersinvoer. Gebruik de aanbevolen instellingen: herhaal Record als het percentage verloren velden meer dan 5 is. Volg vervolgens na en vink Uitlijnen met voorvertoning aan voordat u een nieuwe trackreferentie krijgt en Nieuwe trackreferentie ophalen als de recorduitlijning 2% verschilt. Pas voor het verzamelen van bijgewoonde gegevens strengere parameters toe om het risico te vermijden dat u uren instrumenttijd verliest.
    8. Wanneer u klaar bent om te beginnen, drukt u op GO onder aan het venster. Selecteer aan het einde Tilt Series > Terminate.

5. Batchacquisitie op meerdere punten met behulp van de Navigator (Enhancement #1)

OPMERKING: Het protocol is rudimentair omdat a) het identiek is aan TEM en b) er nieuwe tools beschikbaar komen die waarschijnlijk een volledige beschrijving overbodig zullen maken.

1. Laad de volledige rastermontage in het hoofdvenster.
2. Kies een aantal gebieden die er veelbelovend uitzien. Klik op Punten toevoegen en voeg toe aan de middelpunten van geselecteerde rastervierkanten. Klik nogmaals op Punten toevoegen om de modus uit te schakelen.
3. Terwijl de beeldstatus van de lage dosis is geactiveerd, selecteert u Navigator-venster > vinkt u Ophalen en Nieuw bestand bij item aan voor elk van de geselecteerde vakjes. Voor de eerste wordt een dialoogvenster geopend voor de bestandseigenschappen (afbeelding 7) en vervolgens de bestandsnaam. Kies Gemonitorde afbeeldingen en schakel vervolgens in het dialoogvenster Montage-instellingen (Afbeelding 8) Weergaveparameters gebruiken in de modus Lage dosis in en maak een raster dat groot genoeg is om het vierkant te bedekken (ongeveer 100 x 100 μm).
4. Klik op het menu Navigator > Verkrijgen bij items en selecteer de parameters voor toewijzing. Het belangrijkste is dat u in Primaire acties Navigatorkaart maken aanvinkt, vervolgens Ruwe eucentriciteit en fijne eucentriciteit en op Ga (afbeelding 9). Voor een raster van 200 mazen resulteert dit in een kaart van ongeveer het hele vierkant (figuur 10)
5. Bereid u voor op de positieselecties van het tomogram. Open een nieuw bestand door op Bestand > Nieuw openen te klikken. Geef het een bestandsnaam (bijvoorbeeld AnchorMaps.mrc).
   1. Terwijl de Low Dose-modus actief is, voert u Camera & Script > Setup in en zorgt u ervoor dat View en Preview zich in dezelfde opslagruimte bevinden (anders kunnen ze niet in hetzelfde bestand worden opgeslagen).
   2. Bezoek punten in de vierkante kaarten door te klikken op Navigator-venster > Ga naar XYZ.
   3. Kies een positie voor het eerste tomogram met de marker. Neem een voorbeeldafbeelding en verfijn de positie door te slepen met de rechtermuisknop. Selecteer vervolgens Navigator-venster > Nieuwe kaart en klik op ja in het dialoogvenster dat u wilt opslaan. Maak vervolgens een afbeelding van hetzelfde gebied bekijken en sla deze opnieuw op als een nieuwe kaart. Zorg ervoor dat de weergavekaart is gemarkeerd en controleer Op ankerstatus in het navigatorvenster rechtsboven.
   4. Kies de tweede positie, neem opnieuw een voorbeeld en verfijn de locatie zoals hierboven, en druk deze keer op Ankerkaart in het Navigator-venster. Hiermee worden zowel de Voorvertoning als de Weergave opgeslagen als nieuwe kaarten in de Navigator.
   5. Herhaal stap 5.5.4 voor alle gewenste locaties. Ga van het ene rastervierkant naar het andere door het punt te selecteren en op Ga naar XYZ te drukken in het venster Navigator.
6. Kies voor referentiefocus een duidelijk gebied van het raster en stel zorgvuldig scherp, met de hand of met autofocus. Druk op Reset onscherpte op het microscooppaneel. Maak een script in SerialEM door te klikken op Script > Bewerken > 15 bewerken (of een ander vrij nummer) en voer twee regels in: ScriptName SetDefocus en SetDefocus 0.
7. Markeer in het venster Navigator de eerste locatie (Voorvertoning of Weergave). Druk op Shift-T en markeer vervolgens de laatste locatie en druk nogmaals op Shift-T. Het dialoogvenster Bestandseigenschappen wordt geopend. Kies afbeeldingen en parameters met één frame om op te slaan, inclusief de bestandsnaam. Bewerk de bestandsnaam, maar laat het itemlabel aan het einde staan.
   OPMERKING: Bestandsnamen die eindigen op nummers worden automatisch bijgewerkt voor opeenvolgende tilt-series. Het is handig om de optie Navigator-menu > Nav. Opties > Itemlabels in bestandsnamen te gebruiken.
8. Vervolgens wordt het menu Instellingen van de Tilt-serie automatisch geopend. Vul in zoals voorheen (figuur 6), maar kies niet voor Eucentriciteit verfijnen. De voorbeeldpunten in de Navigator worden nu gemarkeerd als TS. Men kan terugkeren naar dit menu met behulp van de knop in het Navigator-venster boven de lijst met items.
9. Kies het menu Navigator > Verkrijgen bij items. Selecteer deze keer parameters voor Definitieve gegevens. Selecteer Primaire actie: Verkrijg tilt-serie en kies Dewars/Vacuum beheren, Opnieuw uitlijnen op item, Eucentriciteit fijnmaken en Script uitvoeren vóór actie, met Script om uit te voeren: SetDefocus. Selecteer algemene opties: geen berichtvak wanneer er een fout optreedt en sluit kolomkleppen aan het einde en druk vervolgens op GO (figuur 11). SerialEM zal nu alle ankerkaarten bezoeken en op elke positie een kantelreeks opnemen (figuur 12).

6. CLEM-kaartregistratie (Enhancement #2)

1. Als dit nog niet is gebeurd, laadt u de volledige rastermontage in het hoofdvenster en maakt u vervolgens een nieuw venster door op Venster > nieuw venster te klikken en het een naam te geven. Merk op dat de volledige rastermontage wordt weergegeven in Registratie 1.
2. Importeer de CLEM-kaartafbeelding door op het menu Navigator > Kaart importeren te klikken. Het zou in Registratie 2 moeten gaan. Het kan ook een nieuw venster worden toegewezen zoals hierboven.
3. Inspecteer de CLEM-kaart om de relatieve rotatie ten opzichte van de volledige rastermontage te bepalen. Het is het gemakkelijkst om dit te doen op een kaart waarin de rasterbalken verschijnen. Houd er rekening mee dat de kaart ook kan worden omgedraaid. Lijn het ongeveer uit met behulp van het Navigator-menu > Kaart roteren, indien nodig met Spiegelen.
   OPMERKING: De volgende stap is ook geschikt voor een salto, maar als u dit van tevoren doet, wordt het volgende veel eenvoudiger. Deze stap kan worden herhaald totdat de uitlijning er bevredigend uitziet, maar het is niet nodig om precies te zijn.
4. Introduceer registratiepunten voor een nauwkeurige uitlijning. Plaats een aantal corresponderende punten op het ene en vervolgens op het andere venster. Vink voor elk van deze punten registratiepunt helemaal bovenaan het navigatorvenster aan. Corresponderende punten worden gelabeld met een oplopende index, gevolgd door R1 of R2 voor respectievelijk de rastermontage of geïmporteerde kaart.
   OPMERKING: Het gebruik van finder-rasters maakt deze stap heel eenvoudig. Kies anders effen functies zoals de middelste markering of de hoeken van rastervierkanten. In principe zijn drie punten voldoende voor een ruwe uitlijning, maar meer punten helpen om kleine mismatches in de montageconstructies te compenseren.
5. Als meerdere kanalen van een CLEM-kaart gewenst zijn, bijvoorbeeld verschillende fluorescerende kleuren of fluorescentie zonder een heldere veldachtergrond, importeert u deze zoals in stap 6.2 hierboven en wijzigt u de registraties in 2. Op deze manier erven ze de registratiepunten van de eerste kaart.
6. Leg de registratie op via het menu Navigator > Items transformeren. De bijbehorende registratiepunten verschijnen nu op alle kaarten, die worden vermeld in Registratie 1. Als u visueel wilt uitlijnen, klikt u op het menu Navigator > Kaart roteren. Houd er rekening mee dat wanneer een kaart wordt geladen vanuit het Navigator-venster, deze niet automatisch wordt geroteerd, tenzij het selectievakje Roteren bij laden is ingeschakeld. Het kan altijd worden gedraaid vanuit het Navigator-venster.
7. Het zou nu mogelijk moeten zijn om de markering of een punt op de fluorescentiekaart te plaatsen en het podium naar de overeenkomstige locatie op het raster te verplaatsen (figuur 13).

7.3D wederopbouw

1. Dit omvat dezelfde basisstappen als TEM-tomografie: uitlijning van de kantelreeks gevolgd door meestal terugprojectie. Er zijn verschillende softwareplatforms beschikbaar en de gegevens kunnen op dezelfde manier worden behandeld als TEM-gegevens, met uitzondering van het feit dat CTF-correctie moet worden overgeslagen.
2. Pas intensiteitsnormalisaties toe om de bijdrage van hoge kantelprojecties te vergroten of om een verandering in verlichting tijdens de serie in evenwicht te brengen, met de kanttekening dat kwantitatieve informatie wordt beïnvloed. IMOD²⁶ werkt bijvoorbeeld goed, terwijl AreTomo²⁷ erg handig is voor fiduciele-loze uitlijning; waar fiduciale deeltjes aanwezig zijn, kan ClusterAlign²⁸ ze volgen als clusters in plaats van individuele vlekken; dit is met name handig voor STEM-gegevens waarbij vlekken verloren kunnen gaan of verborgen kunnen worden door functies met een hoog contrast.
3. Volg de reconstructie met 3D-deconvolutie²⁹ voor contrastverbetering en denoising. Eenmaal gereconstrueerd, vertegenwoordigt u de STEM-volumegegevens met een van de standaardmethoden, zoals orthoslices of isosurface-segmentatie. Met name de intensiteitsverdeling is unipolair, zonder contrastinversies of Fourierranden die voorkomen in conventionele fasecontrast-TEM. Een interessant middel om STEM-tomogrammen in het algemeen weer te geven, is het omkeren van het heldere veld (figuur 14). Het effect is dat van "röntgenogen", die de dichte objecten van belang zien door de geklaarde cel³⁰.

Resultaten

Een volledige rastermontage voorbereid in STEM toont de gebieden met cellen van belang (figuur 4). Merk op dat de afbeelding zich in een donker veld bevindt, dus lege gaten lijken donker. Cellen lijken gedeeltelijk helder, waar de elektronen worden verstrooid in de richting van de HAADF-detector. Op de dikste delen, meestal de middelpunten of in de buurt van de rasterbalken, wordt het contrast weer donker. Dit komt door meervoudige verstrooiing, waarbij de elektronen hoeken bereiken die niet door de detector worden opgevangen. In de praktijk zullen deze gebieden te dik zijn voor tomografie.

De volgende fase omvat kaarten van tussentijdse vergroting (figuur 10). Deze worden vaak middelgrote montagekaarten of vierkante kaarten genoemd, verwijzend naar de rastervierkanten in plaats van de vorm. Zelfs bij de laagste microprobe STEM-modus worden ze ook als montagebeelden verkregen. Als u op het item in het navigatorvenster klikt, wordt de kaartafbeelding in het hoofdvenster geladen. Binnen dit gebied worden specifieke punten voor tomogramacquisitie gekozen. Gebruik de voorbeeldmodus om het gebied bij de opnamevergroting te lokaliseren. Houd er rekening mee dat er een zijdelingse verschuiving kan zijn tussen Voorvertoning en Opnemen, afhankelijk van de scansnelheden. Een enkele kantelreeks kan hier worden opgenomen. Mitochondriën kunnen bijvoorbeeld vaak worden geïdentificeerd in de afbeelding Voorvertoning en Record (figuur 12).

Voor batchtomografie zal het podium rond het raster reizen en mogelijk niet terugkeren naar precies dezelfde locatie. Ankertoewijzingen worden gebruikt om ervoor te zorgen dat de gewenste recordgebieden op betrouwbare wijze opnieuw worden geïdentificeerd door de voorvertoningsafbeelding te koppelen aan een weergave met een lagere vergroting, zelfs als de beweging van het werkgebied is verschoven. PyEM^23,24 biedt een sneller alternatief dat zeker aan te raden is, maar nog geen deel uitmaakt van de standaard installatie.

In de CLEM-benadering kan een fluorescentiekaart worden gebruikt om de interessegebieden voor tomografie te identificeren. De fluorescentie wordt extern verkregen en moet worden geregistreerd op de volledige rastermontage. Het is handig om de rasterbalken en gaten zichtbaar te hebben, zodat een samengevoegde fluorescentie + heldere veldcomposiet kan worden voorbereid voordat deze wordt geïmporteerd, bijvoorbeeld in GIMP (https://www.gimp.org) of ImageJ^31-software (zorg ervoor dat ImageJ de verticale as omkeert). Wanneer het dynamisch bereik van de fluorescentie groot is, kan het moeilijk zijn om een dergelijke samensmelting te creëren zonder verzadiging. In dit geval kunnen de twee kaarten afzonderlijk worden geïmporteerd en vervolgens samen worden geregistreerd zoals beschreven (figuur 13). Op deze manier brengt een punt op de fluorescentiekaart in het Navigator-venster, gevolgd door "Go To XY", het werkgebied naar de overeenkomstige positie op het raster zoals gemonteerd in de TEM. Zorg ervoor dat kleine inconsistenties in het maken van de montage (of de fluorescentiekaart, als het ook een montage is) leiden tot kleine verplaatsingen; Daarom moet de fluorescentie voor optimale precisie specifiek op de vierkante kaart opnieuw worden geregistreerd. Het is vaak voldoende om deze registratie op het oog te doen, op basis van gaten in de steunfilm of kenmerken die worden gedeeld met het heldere veldlichtbeeld.

Reconstructie van de kantelreeks resulteert in een 3D-volume (figuur 14). Dit voorbeeld heeft een pixelgrootte van 2,042 nm, wat resulteert in een gezichtsveld van ~4 μm. Calciumfosfaatafzettingen (oranje pijlpunten) vallen op, vanwege het hogere atoomnummer in vergelijking met de omgeving. Microtubuli (rode pijlpunten) kunnen over het hele gezichtsveld worden getraceerd. Ook zijn de binnenste en buitenste mitochondriale membranen (groene pijlpunten) duidelijk te zien. Actine kan worden waargenomen als bundels of als individuele filamenten. Om een meer isotrope resolutie te bereiken, kan de reconstructie worden verwerkt door deconvolutie.

Figuur 1: Vergelijking van TEM versus STEM. In TEM wordt het gezichtsveld verlicht door een bijna parallelle bundel en vormt de objectieflens een vergroot beeld op de camera. Voor cryo-TEM wordt de objectieve opening geopend om de verstrooide elektronengolven (onderbroken rode lijn) te passeren, die met onscherpte fasecontrast produceren door interferentie met de niet-verspreide (groene) golven. STEM, aan de andere kant, rastert een gerichte straal over het monster en verzamelt de verstrooide elektronen op een pixel-voor-pixel manier. Meerdere detectoren kunnen elektronen verzamelen die onder verschillende hoeken zijn verspreid. Dit cijfer is gewijzigd van³⁰. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Voorbeeld van beeldvervorming aan de linkerkant door de hoge scansnelheid. Let op de vervorming gemarkeerd door gele pijlpunten, evenals de vervormde ovaalvormige gaten in de Quantifoil. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Montage setup dialoog voor de hele rastermontage. Kies de vergroting en het aantal stukken in X en Y, zodat het totale gebied ongeveer 2.000 μm bereikt om een kaart te krijgen voor het grootste deel van het raster. Kies ook Fase verplaatsen in plaats van afbeelding verschuiven en Montagetoewijzing gebruiken, geen recordparameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Volledige lage vergroting GridMap opgenomen in STEM-modus. Gebroken gebieden worden volledig zwart weergegeven in het donkere veldbeeld. Donkergrijze gebieden zijn waarschijnlijk te dik en slecht verglaasd. Goede kandidaat-gebieden voor tomografie zijn wit of lichtgrijs in deze scan. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Verschuiving naar markeringsproces. Een herkenbaar object is gemarkeerd in de kaart met lage resolutie door Punten toevoegen (38 in deze afbeelding). Let op de verschuiving tussen de kaart met lage resolutie (groene cirkel) en de kaart met gemiddelde resolutie (oranje cirkel). Vervolgens wordt het object gemarkeerd met de markering (groen kruis, rode cirkel) en wordt het dialoogvenster Verschuiven naar markering gestart. De gekozen optie verplaatst alle kaarten op 245x met dezelfde hoeveelheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Kantelserie setup dialoog voor een STEM tilt serie. Het dosissymmetrisch schema wordt gebruikt van -60° tot +60° in stappen van 2°. Autofocus wordt overgeslagen vanwege de hoge scherptediepte bij gebruik van een lage convergentiehoek. Het is niet nodig om eucentriciteit te verfijnen zoals dit eerder is gedaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Afbeelding 7: Dialoogvenster met bestandseigenschappen voor kaarten met een gemiddelde resolutie. Sla op als een MRC-stackbestand, kies gehele getallen en sla extra informatie op in een MDOC-metagegevensbestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Montage-instellingsdialoogvenster voor het opslaan van kaarten met een gemiddelde resolutie. Voor een vierkant op een rooster van 200 mazen, dat 90 μm breed is, is een totale oppervlakte van minimaal 90 μm x 90 μm aan te raden. Kies Werkgebied verplaatsen in plaats van afbeelding verschuiven en Weergaveparameters gebruiken in de modus Lage dose. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Opname medium resolutie kaart. Acquire at Items dialoog voor het opnemen van kaarten met een gemiddelde resolutie. Kies Toewijzing, Afbeelding of montage ophalen en opslaan en schakel het selectievakje Navigatorkaart maken in. Kies in de taken voor of na het jeugdwerk de optie Ruw en fijn eucentricisme. Als u geen hulp hebt, kiest u optioneel Geen berichtvak wanneer er een fout optreedt en Kolomkleppen sluiten aan het einde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Afbeelding van kaart met gemiddelde resolutie. Kaart met gemiddelde resolutie (vierkante kaart) opgenomen in STEM-modus door een montage van 3 x 3. De twee ankerkaarten met gemiddelde resolutie voor gegevensverzameling worden aangegeven door de blauwe vierkanten. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 11: Batch tilt serie data. Acquire at Items dialoogvenster voor het verzamelen van batch tilt series. Voor het verzamelen van gegevens uit de kantelreeks kiest u Definitieve gegevens en Kantelreeks ophalen. Schakel bij Taken voor of na primair het selectievakje Dewars/Vacuum beheren in (kies de juiste instellingen in het setup-menu), Opnieuw uitlijnen op item, Eucentriciteit fijn maken en Script uitvoeren vóór actie in. Schakel in de algemene opties het selectievakje Geen bericht in wanneer er een fout optreedt en kolomkleppen aan het einde sluiten (zie 5.14). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 12: 0° kanteling van een STEM-kantelreeks van een mitochondrion. Oranje pijlpunten wijzen op calciumfosfaatafzettingen (matrixkorrels), groene pijlpunten op cristae en rode pijlpunten op 15 nm gouden fiduciale markers. Schaalbalk = 500 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 13: Geregistreerde cryo-CLEM kaarten. (A) Stem-kaart met gemiddelde resolutie (vierkante kaart, 26-A) is geregistreerd op de (B) stemkaart met lage resolutie, (C) BF-kanaal cryo-FM-kaart en (D) GFP-kanaal cryo-FM-kaart. De negen registratiepunten (labels 4-21) worden weergegeven in de (E) Navigator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 14: Volume rendering. Volumeweergave van (A) 60 nm en een (B) 40 nm dikke secties door een SIRT-achtig (30 cycli) gefilterd tomogram op verschillende diepten. De pixelgrootte is 2,048 nm, wat resulteert in een gezichtsveld van ongeveer 4 μm. Let op de omgekeerde dichtheid in vergelijking met figuur 12, wat betekent dat functies met een hoge intensiteit helder zijn. Oranje, witte, rode, groene en lichtblauwe pijlpunten wijzen op respectievelijk calciumfosfaatafzettingen, ribosomen, microtubuli, het binnenste en buitenste mitochondriale membraan en actinefilamenten. Schaalbalk = 500 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het protocol moet biowetenschappelijke microscopisten helpen die geïnteresseerd zijn in het verkrijgen van een 3D-beeld van intracellulaire organellen in regio's van de cel die niet toegankelijk zijn voor conventionele TEM-tomografie. Hetzelfde protocol kan ook worden gebruikt voor STEM-tomografie van plastic secties, met versoepelde beperkingen op de blootstelling. Het protocol moet worden beschouwd als een uitgangspunt in plaats van een reeks harde regels. De kracht van STEM is inderdaad de flexibiliteit ervan; Er is niet één juiste manier om het te bedienen.

We benadrukken dat STEM op zich alleen verwijst naar de gescande sonde en niet de beeldvorming definieert. Het contrast hangt voornamelijk af van de configuratie van detectoren. De meer eenvoudige methoden maken gebruik van detectoren met axiale symmetrie, ofwel een schijf gecentreerd op de optische as of een annulus eromheen. In het algemeen, wanneer de verlichting direct op de detector inwerkt, nemen we een BF-beeld op waarbij het (elektronenverstrooiende) monster donker lijkt; omgekeerd, wanneer de detector alleen verstrooide elektronen verzamelt, nemen we een DF-beeld op waarbij het dichte monster helder lijkt. Wanneer geschikte hardware beschikbaar is, kan SerialEM beide signalen tegelijkertijd verwerven en opnemen. Er zijn nog geavanceerdere configuraties beschikbaar, variërend van detectoren met meerdere segmenten tot volledig gepixelde camera's. Fasecontrastbeeldvorming kan bijvoorbeeld worden bereikt door het verschil tussen off-axis detectorelementen^{te evalueren 32,33}. Het verzamelen van het volledige 2D-verstrooiingspatroon (diffractie) per pixel definieert de methode die bekend staat als 4D STEM³⁴, waarmee meerdere beeldcontrasten uit dezelfde oorspronkelijke gegevens kunnen worden gereconstrueerd. Vierdimensionale STEM maakt elektronenptychografie mogelijk, wat een ander middel biedt om fasecontrast³⁵ te verkrijgen.

We hebben ons gericht op de specifieke STEM-modaliteit die we het meest nuttig achten voor de studie van organellen en intacte cellen of micron-dikke celsecties. Dit omvat specifiek het gebruik van BF-beeldvorming met een kleine semi-convergentiehoek in de verlichting en een relatief grote opvanghoek bij de detector. De kleine convergentie zorgt voor een grote scherptediepte, zodat het hele monster gedurende de hele kantelreeks¹⁹ scherp blijft. In de praktijk kan het met een goede microscoopfase ook de noodzaak van focusaanpassing tijdens de acquisitie elimineren. De prijs is een compromis in resolutie, zoals beschreven in sectie 3 van het protocol. We hebben 4k-beelden voorgesteld met een sonde van ~ 2 nm, die met 1 nm pixelafstand een gezichtsveld van 4 μm bereikt. De lezer wordt echter sterk aangemoedigd om te experimenteren. De tweede overweging bevindt zich aan de zijkant van de detector. Wanneer de verlichtingsschijf de on-axis BF-detector ondervult, wordt het fasecontrast onderdrukt en domineert het verstrooiingscontrast (amplitude); Deze aandoening wordt incoherent helder veldcontrast³⁶ genoemd. De vraag is met welke fractie te ondervullen, en het antwoord hangt af van de steekproef. Een zeer dun monster zal het beste contrast vertonen met de detector volledig gevuld (d.w.z. de verzamelhoek komt overeen met die van de verlichting), maar een dikker monster zal alle intensiteit wegstrooien, waardoor een luidruchtig signaal met een slecht contrast achterblijft. Een handige vuistregel is dat hoe dikker het monster, hoe groter de buitenste afkaphoek van de BF-detector²¹ moet zijn. De grootte en positie van de detector zijn uiteraard vast, dus de grootte van de diffractieschijf wordt aangepast met behulp van de cameralengte, zoals beschreven in sectie 1. Als de instellingen van de detectorversterker zodanig zijn dat het signaal het dynamische bereik vult maar niet verzadigt onder directe verlichting (1.12.3), kan de cameralengte worden vergroot totdat een redelijke signaalintensiteit en contrast zijn bereikt. Opnieuw wordt de lezer aangemoedigd om te experimenteren. De kunst zit als het ware in de hoeken.

Een andere parameter, niet besproken in het protocol, is de microscoopversnellingsspanning. De interactie van de oplichtende elektronen met het monster zal sterker zijn bij een lagere spanning. Met al het andere gelijk, kunnen we een hoger contrast verwachten bij een lagere spanning. Aan de andere kant is het het begin van meervoudige verstrooiing in het monster dat de bruikbare monsterdikte beperkt, dus een hogere spanning maakt het gebruik van dikkere monsters mogelijk. Deze effecten zijn echter vrij subtiel. Onze ervaringen tot nu toe met 200 kV en 300 kV versnellingen zijn vergelijkbaar.

Gezien wat er van STEM verwacht mag worden qua resolutie, hangt dit weer af van het monster en de detectorconfiguratie. Met behulp van een enkele deeltjesanalysebenadering konden metaalionen op ferritine worden gelokaliseerd door ringvormige donkere veld-STEM met een precisie van enkele angstrom³⁷. Meer recent werd sub-nanometerresolutie bereikt voor virus- en eiwitmonsters met behulp van beelden verkregen door geïntegreerd differentiaalfasecontrast (iDPC) STEM³² en ptychografie³⁵. Voor unieke objecten in dikke cellulaire exemplaren, en met de hier beschreven methoden, is een dergelijke hoge resolutie niet realistisch. De optimale resolutie is de sondediameter, die betrekking heeft op de semi-convergentiehoek zoals beschreven. Andere factoren zullen de resolutie verminderen, met name een grove pixelbemonstering om een groot gezichtsveld te bereiken, verkeerde uitlijningen in de kantelreeks en verspreiding van de sondebundel tijdens de transmissie. Afbeeldingen zijn goed te vergelijken met plastic sectietomografie. Met de hier beschreven opstelling moet het bijvoorbeeld gemakkelijk zijn om de holle kern van de microtubuli te zien, maar niet de individuele protofilamenten.

Kortom, STEM-methoden en hardware bevinden zich beide in een ontwikkelingsfase. We kunnen verwachten dat innovaties in beeldvorming ook van invloed zullen zijn op tomografie, waardoor STEM in domeinen terechtkomt die niet toegankelijk zijn geweest met andere technieken. We verwachten dat een convergentie met correlatieve cryogene fluorescentiebeeldvorming op basis van moderne optische superresolutiemethoden bijzonder vruchtbaar zal zijn. De schaal van organellen, 100-1.000 nm, is een ideaal doelwit voor deze opkomende methoden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SerialEM	University of Colorado	Veriosn 4.0	SerialEM is een gratis softwareplatform voor microscoopbesturing en gegevensverwerving.
STEM-capable transmissie-elektronenmicroscoop			Het protocol is geschreven op basis van ervaring met verschillende microscopen van Thermo Fisher Scientific: Titan Krios, Talos Arctica en Tecnai T20-F. In principe zou het ook toepasbaar moeten zijn op andere fabrikanten.