Methodenartikel

Gestandaardiseerde identificatie van de samengestelde structuur in de Tibetaanse geneeskunde met behulp van ionenval massaspectrometrie en meertraps fragmentatieanalyse

DOI:

10.3791/65054

⸱

17 maart 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een algemeen protocol en ontwerp dat kan worden toegepast om sporenhoeveelheden en minder belangrijke bestanddelen te identificeren in de complexe natuurlijke productformuleringen (matrixen) in de Tibetaanse geneeskunde.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tibetaanse medicijnen zijn complex en bevatten tal van onbekende verbindingen, waardoor diepgaand onderzoek naar hun moleculaire structuren cruciaal is. Vloeistofchromatografie-elektrospray ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (LC-ESI-TOF-MS) wordt vaak gebruikt om Tibetaanse geneeskunde te extraheren; Er blijven echter veel onvoorspelbare onbekende verbindingen over na het gebruik van de spectrumdatabase. Dit artikel ontwikkelde een universele methode voor het identificeren van componenten in de Tibetaanse geneeskunde met behulp van ionenval massaspectrometrie (IT-MS). De methode omvat gestandaardiseerde en geprogrammeerde protocollen voor monstervoorbereiding, MS-instelling, LC-prerun, methode-instelling, MS-acquisitie, meertraps MS-bewerking en handmatige gegevensanalyse. Twee representatieve verbindingen in de Tibetaanse geneeskunde Abelmoschus manihot zaden werden geïdentificeerd met behulp van meervoudige fase fragmentatie, met een gedetailleerde analyse van typische samengestelde structuren. Daarnaast bespreekt het artikel aspecten zoals ionmodusselectie, mobiele faseaanpassing, optimalisatie van het scanbereik, botsingsenergieregeling, omschakeling van botsingsmodus, fragmentatiefactoren en beperkingen van de methode. De ontwikkelde gestandaardiseerde analysemethode is universeel en kan worden toegepast op onbekende verbindingen in de Tibetaanse geneeskunde.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kwalitatieve analyse van sporencomponenten in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is een cruciaal onderwerp geworden in het onderzoek. Vanwege het grote aantal verbindingen in TCM is het moeilijk om ze te isoleren voor analyse van nucleaire magnetische resonantiespectrometer (NMR) of röntgendiffractometer (XRD), waardoor op massaspectrometrie (MS) gebaseerde methoden die alleen lage monstervolumes vereisen steeds populairder worden. Bovendien is vloeistofchromatografie (LC) in combinatie met MS de afgelopen jaren veel gebruikt in TCM-onderzoek voor de verbeterde scheiding van complexe monsters en kwalitatieve analyse van chemische verbindingen1. Een veelgebruikte methode is vloeistofchromatografie-elektrospray ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (LC-ESI-TOF-MS), die veel wordt gebruikt in kwalitatief onderzoek naar Tibetaanse geneeskunde2. Met deze methode worden complexe componenten verrijkt en gescheiden in een LC-kolom en wordt de massa-ladingsverhouding (m/z) van de adductionen waargenomen met behulp van een MS-detector. Het doorzoeken van tandem MS (MS/MS of MS2) databases is momenteel de snelste aanpak voor betrouwbare samengestelde annotaties in small molecule analyse met behulp van quadrupole time-of-flight (Q-TOF) MS en Orbitrap MS3. De slechte kwaliteit van databases en de aanwezigheid van verschillende isomeren belemmeren echter de identificatie van onbekende verbindingen. Bovendien is de informatie die door de MS/MS-database wordt verstrekt, beperkt 4,5,6,7. Het is belangrijk om de chemische verbindingen in elke TCM te onderzoeken met behulp van een algemeen protocol dat op grote schaal kan worden toegepast op andere TCM.

IT-MS vangt een breed scala aan ionen op door verschillende radiofrequentie (RF) spanningen toe te passen op de ringelektroden8. IT-MS kan tijdreeksen meertraps MS-scans uitvoeren in verschillende chronologische volgordes, waarbij fragmentatie van ingrediënten meervoudige fase MS (MS n) wordt verkregen, waarbijn het aantal productionstadia9 is. Lineaire IT-MS wordt beschouwd als het beste voor structuuridentificatie omdat het kan worden gebruikt voor sequentiële MSn-experimenten 10. Gerichte ionen kunnen worden geïsoleerd en geaccumuleerd in lineaire IT-MS1. De MS n (n ≥ 3) in IT-MS biedt meer fragmentinformatie dan MS/MS in Q-TOF-MS. Omdat IT-MS het doelion en zijn fragmentionen niet kan vergrendelen, is het een krachtig hulpmiddel voor de structuuropheldering van onbekende verbindingen, waaronder isomeren1. MSn-technologie is op grote schaal toegepast op de structurele analyse van onbekende eiwitten, peptiden en polysacchariden11,12. Het abundantieniveau van fragmentionen in MSn biedt meer moleculaire fragmentinformatie over gerichte verbindingen in complexe monsters dan MS / MS in Q-TOF-MS. Daarom is het toepassen van MSn-technologie op structurele identificatie in TCM essentieel.

Tibetaanse geneeskunde is een belangrijk onderdeel van TCM13, en deze geneesmiddelen zijn voornamelijk afgeleid van dieren, planten en mineralen gevonden in het plateaugebied14. Het Tibetaanse medicijn Abelmoschus manihot zaden (AMS) is het zaad van Abelmoschus manihot (linn.) medicus. AMS is een traditioneel kruidengeneesmiddel dat wordt gebruikt voor de behandeling van aandoeningen zoals atopische dermatitis, reuma en lepra. Het bevat chalcone, dat antibacteriële, schimmelwerende, antikanker-, antioxidatieve en ontstekingsremmende effecten bezit15. In de huidige studie werden MS n-procedures verbeterd en werd een gedetailleerde methode ontwikkeld om samengestelde structuren in de Tibetaanse geneeskunde AMS te identificeren met behulp van IT-MS en MSn. Bepaalde MS-parameters, waaronder de ionenmodus, het scanbereik en de botsingsmodus, werden geoptimaliseerd om problemen bij het identificeren van sporenverbindingen te overwinnen. Deze studie heeft tot doel de gestandaardiseerde structuuridentificatie van sporenverbindingen in TCM te bevorderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monstervoorbereiding

  1. Weeg 1 g van het AMS-monster nauwkeurig af en plaats het in een erlenmeyer met 30 ml 80% methanol. Breng het mengsel over naar een ultrasone badsonicator gedurende 30 minuten extractie bij 25 °C. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten op 14.000 x g .
    OPMERKING: De frequentie van de ultrasone badsonicator is 40 KHz.
  2. Bereid een injectiespuit en een microporeus membraanfilter (0,22 μm, alleen biologisch). Filtreer het supernatant in een monsterfles van 2 ml.

2. MS-instelling

  1. Zet de schakelaar van de vacuümpomp aan. Open de hoofdklep van de argoncilinder en het partiële drukventiel en stel de druk in op ongeveer 0,3 MPa. Open de stikstofklep.
    OPMERKING: Wacht ten minste 8 uur om ervoor te zorgen dat er voldoende vacuümgraad is voor de experimentele omstandigheden. Controleer vóór de analyse of de gasdruk van argon en stikstof hoog genoeg is.
  2. Start de MS-besturingssoftware. Klik op Verwarmde SEI-bron in het softwarepaneel en voer de MS-parameters in, waaronder de verwarmingstemperatuur (350 °C), het mantelgasdebiet (35 arb), het aux-gasdebiet (15 arb), de sproeispanning (3,8 KV voor de positieve modus, −2,5 KV voor de negatieve modus) en de capillaire temperatuur (275 °C). Klik op de knop Toepassen om de ionenbron te activeren.

3. LC-prerun, methode-instelling en MS-acquisitie

  1. Bereid mobiele fase A en mobiele fase B met respectievelijk 0,1% mierenzuur waterige oplossing en zuiver acetonitril. Ontgast ze in een ultrasone badsonicator gedurende ten minste 15 minuten. Verbind de oplossingen met respectievelijk de A- en B-vloeistofpassages (figuur 1A). Bereid een methanol-water (1:9 v/v) oplossing en vul deze vervolgens met de hand in de reinigingsvloeistofflessen van de pomp en injector.
    OPMERKING: De frequentie van de ultrasone badsonicator is 40 KHz.
  2. Start de LC-MS-besturingssoftware.
    1. Klik op de knop Direct Control om het LC-bedieningspaneel te openen. Open de spoelklep tegen de klok in op de pompmodule (figuur 1B).
    2. Klik op de knop Meer optie om de pompinstelling te openen en stel de spoelparameters gedurende 3 minuten in op 5 mlmin−1 . Klik op de knop Leegmaken om het verwijderen van de bubbel te starten. Sluit vervolgens de spoelklep.
  3. Klik op de knoppen Prime Syringe, Wash Buffer Loop en Wash Needle Externally om de spuit gedurende drie cycli, de lus voor één cyclus en de naald voor één cyclus te spoelen. Plaats de monsterfles in de monsternemer (figuur 1C).
  4. Klik op de knop Instrument instellen om het venster voor het bewerken van methoden te openen. Klik op de knop Nieuw om een nieuwe LC-MS-instrumentmethode te maken.
  5. Stel een totale uitvoeringstijd vast voor de LC-methode. Voer vervolgens waarden in om de druklimiet, het totale debiet, de stroomgradiënt, de monstertemperatuur, de kolomtemperatuur en de gereedstaande temperatuurdelta in te stellen in het venster voor het bewerken van methoden.
    OPMERKING: Het standaard totale debiet van de mobiele fase is constant op 0,3 ml/min met 50% A en 50% B en zonder kolomtemperatuur bij afwezigheid van een chromatografische kolom. De standaardwaarden van de monstertemperatuur en de parate temperatuurdelta zijn respectievelijk 15 °C en 0,1 °C. Andere instellingen zijn afhankelijk van het type vloeistofchromatografiekolom dat wordt gebruikt.
  6. Selecteer het type Algemeen MS of MSn experiment voor de MS-methode. Voer waarden in om de acquisitietijd, polariteit, massabereik, omleidingswaardegetal en omleidingswaardeduur te configureren. Klik op de knop Opslaan om de instellingen als instrumentmethode te configureren.
    OPMERKING: De standaardinstellingen zonder chromatografiekolom zijn als volgt: acquisitietijd, 2 min; polariteit, positief of negatief; massabereik, 100 tot 1.200; omleidingswaardenummer, 2; en omleidingswaarde duur, 1,99 min.

4. Bediening van meertraps massaspectrometrie

  1. Klik op de knop Sequence Setup om de sequentietabel te openen.
    1. Voer in de tabel de volgende informatie in: monstertype, bestandsnaam, pad, voorbeeld-id, instrumentmethode, positie en injectievolume.
    2. Klik op de knop Opslaan om de volgordetabel op te nemen en klik vervolgens op de knop Analyse starten om de instellingen te implementeren en de MS-acquisitie te starten.
      OPMERKING: Het standaardvoorbeeldtype is geselecteerd als onbekend. De instrumentmethode is de methode die is opgeslagen in stap 3.6. De monsterfles wordt op zijn unieke locatie in de monsterruimte geplaatst. RA1 is bijvoorbeeld de eerste locatie in de eerste rij van het rode gebied in de monsterruimte. Het standaard injectievolume is meestal 2 μL, wat afhankelijk is van de concentratie van het monster.
  2. Dubbelklik op het raw-bestand in verkenner om de MS-gegevens in de gegevensverwerkingssoftware te laden. Selecteer in het basispiekchromatogram (BPI) het gebied met het maximale gebied onder de curve (AUC) door met de muis te klikken en te slepen. De bijbehorende MS-spectra worden in hetzelfde venster weergegeven.
  3. Selecteer een gericht ion voor de volgende MS/MS-analyse.
    1. Open het venster voor het bewerken van methoden opnieuw. Stel in de instellingstabel MSn de m/z van het beoogde ion in op één decimaal in de kolom Bovenliggende massa .
    2. Selecteer Botsingsmodus en voer de waarde voor botsingsenergie (CE) in. Stel het MS/MS-scanbereik in. Klik op de knop Opslaan om de MS-methode op te nemen en voer een nieuwe bestandsnaam in de volgordetabel in. Klik op de knop Start om de MS/MS-acquisitie te starten.
      OPMERKING: Het MS/MS-scanbereik was 40%-130% van het beoogde ouderion. De standaard CE-waarde in de CID-modus (collision-induced dissociation) is 35%.
  4. Dubbelklik op het raw-bestand in verkenner om het MS/MS raw-bestand in de gegevensverwerkingssoftware te laden.
    1. Identificeer het sterkste fragmention in het MS/MS-spectrum en voer de m/z-waarde in de MSn-methodelijst in. Stel in de MS n-instellingstabel de MS3-parameters in, waaronder botsingsmodus, CE-waarde en scanbereik.
    2. Klik op de knop Opslaan om de MS-methode op te nemen en voer een nieuwe bestandsnaam in de volgordetabel in. Klik op de knop Start om de MS3-acquisitie te starten.
  5. Dubbelklik op het raw-bestand in verkenner om het MS3 raw-bestand in de gegevensverwerkingssoftware te laden. Herhaal stap 4.4 om het MS4-spectrum te verkrijgen.
  6. Voltooi het MSn-experiment wanneer er geen stabiele fragmentionen in het spectrum worden waargenomen.

5. Handmatige MSn data-analyse

  1. Dubbelklik op de raw-bestanden om alle massaspectra van MS naar MSn te openen. Bereken handmatig de m/z-verschilwaarden tussen het ion en de bijbehorende fragmentionen.
    OPMERKING: De m/z-verschilwaarde tussen het ion (m/z 617,25) en de overeenkomstige fragmentionen (m/z 571,28) was bijvoorbeeld 45,97 in MS/MS, de m/z-verschilwaarde tussen het ion (m/z 571,28) en de overeenkomstige fragmentionen (m/z 525,38) was 45,90 in MS3, en de m/z-verschilwaarden tussen het ion (m/z 525,38) en de overeenkomstige fragmentionen (m/z 344,93 en 273,16) waren 180,45 en 252,22 in MS4, respectievelijk.
  2. Teken handmatig de "core" -structuur volgens MS4-resultaten (het laatste niveau van MSn). Leid handmatig de oorspronkelijke structuur af met behulp van functionele groepen of moleculaire segmenten op basis van de m/z-verschilwaarde. Teken handmatig de moleculaire splitsingspaden volgens elke moleculaire structuur in MSn. Voorbeelden van handmatige moleculaire afleiding worden beschreven in de sectie representatieve resultaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellobiose werd gebruikt als model om de haalbaarheid van MSn in positieve ionmodus te verifiëren. Zoals te zien is in figuur 2A, produceerde de ESI-MS (positieve ionenmodus) van cellobiose [C 12 H22O11]+ het geprotoneerde molecuul [M+H]+ bij m/z 365. De product ion scan (CID-MS/MS) van [M+H]+ bij m/z 365 resulteerde in het tweede fragmention bij m/z 305 (figuur 2B), dat verder werd geanalyseerd met behulp van MS

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IT-MS en zijn MSn-technologie bieden een nieuwe benadering voor het identificeren van de structuur van trace TCM-verbindingen. In tegenstelling tot Q-TOF-MS, dat de fragmentionen niet diep kon identificeren, blinkt IT-MS met MSn-technologie uit door zijn vermogen om ionen te isoleren en te accumuleren. Dit artikel schetst een methode voor het identificeren van sporenverbindingen in de Tibetaanse geneeskunde met behulp van de IT-MS en MSn techniek. De methode gebruikt de n-waarde in MS

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door het Xinglin Talent Program van Chengdu University of TCM (nr. 030058191), de Nature Science Foundation of Sichuan (2022NSFSC1470) en de National Natural Science Foundation of China (82204765).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetonitrileThermo ScientificCAS 75-05-8LC-MS grade
Formic AcidKnowlesCAS 64-18-6HPLC grade
Linear ion trap mass spectrometerThermo ScientificLTQ XL
Liquid chromatographThermo ScientificU3000
LTQ TuneThermo Scientificversion 2.8.0MS control software
MethanolThermo ScientificCAS 67-56-1LC-MS grade
Pure waterThermo ScientificCAS 7732-18-5LC-MS grade
XcaliburThermo Scientificversion 2.0LC-IT-MS operational software

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines. Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).
  2. Ou, C., et al. Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028(2020).
  3. Kind, T., et al. Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search. Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).
  4. Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus. Journal of Visualized Experiments. (183), e63322(2022).
  5. Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions. Journal of Visualized Experiments. (184), e64050(2022).
  6. Karas, B. F., et al. Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications. Journal of Visualized Experiments. (182), e6358(2022).
  7. Chang, H. -L., et al. Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e63089(2022).
  8. Wang, S., et al. Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).
  9. Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270(2016).
  10. Ichou, F., et al. Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes. Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).
  11. Fu, X., et al. Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran. Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).
  12. Fu, X., et al. Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural. ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).
  13. Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. Modern research of Tibetan medicine. World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).
  14. Shang, X., et al. Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China. Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).
  15. Su, J., et al. Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization. Frontiers in Pharmacology. 13, 932198(2022).
  16. Fu, X., et al. Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water. Green Energy & Environment. , In Press (2022).
  17. Hua, Y., Jenke, D. Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization. Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).
  18. Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).
  19. Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).
  20. Wu, S. -L., et al. Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation. Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).
  21. Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges. Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Identificatie van verbindingstructuurvloeistofchromatografieelectrospray ionisatiemonstervoorbereidingcontrole van botsingsenergieanalyse van fragmentionenAbelmoschus manihot

Gerelateerde artikelen