Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

BS3 Chemische crosslinking assay: evaluatie van het effect van chronische stress op het celoppervlak GABAA receptorpresentatie in het knaagdierbrein

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65063

⸱

26 mei 2023

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Addiction and Mental Health (CAMH), Campbell Family Mental Health Research Institute, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Psychiatry, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

De BS3 chemische crosslinking assay onthult verminderde celoppervlak GABAA receptor expressie in muizenhersenen onder chronische psychosociale stressomstandigheden.

Samenvatting

Angst is een toestand van emotie die variabel het gedrag van dieren beïnvloedt, inclusief cognitieve functies. Gedragsmatige tekenen van angst worden waargenomen in het dierenrijk en kunnen worden herkend als adaptieve of onaangepaste reacties op een breed scala aan stressmodaliteiten. Knaagdieren bieden een bewezen experimenteel model voor translationele studies die de integratieve mechanismen van angst op moleculair, cellulair en circuitniveau aanpakken. In het bijzonder lokt het chronische psychosociale stressparadigma onaangepaste reacties uit die angst- / depressieve gedragsfenotypen nabootsen die analoog zijn tussen mensen en knaagdieren. Hoewel eerdere studies significante effecten van chronische stress op neurotransmitterinhoud in de hersenen laten zien, is het effect van stress op neurotransmitterreceptorniveaus onderbelicht. In dit artikel presenteren we een experimentele methode om de neuronale oppervlakteniveaus van neurotransmitterreceptoren bij muizen onder chronische stress te kwantificeren, met name gericht op gamma-aminoboterzuur (GABA) receptoren, die betrokken zijn bij de regulatie van emotie en cognitie. Met behulp van de membraan-ondoordringbare onomkeerbare chemische crosslinker, bissulfosuccinimidylsuberaat (BS3), tonen we aan dat chronische stress de oppervlaktebeschikbaarheid van GABA A-receptoren in de prefrontale cortex aanzienlijk downreguleert. De neuronale oppervlakteniveaus van GABAA-receptoren zijn het snelheidsbeperkende proces voor GABA-neurotransmissie en kunnen daarom worden gebruikt als een moleculaire marker of een proxy van de mate van angst - / depressieve fenotypen in experimentele diermodellen. Deze crosslinking-benadering is van toepassing op een verscheidenheid aan receptorsystemen voor neurotransmitters of neuromodulatoren die tot expressie komen in elk hersengebied en zal naar verwachting bijdragen aan een dieper begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan emotie en cognitie.

Inleiding

Neurotransmitterreceptoren zijn gelokaliseerd aan het neuronale plasmamembraanoppervlak of intracellulair op de endomembranen (bijv. Het endosoom, het endoplasmatisch reticulum [ER] of het trans-Golgi-apparaat) en pendelen dynamisch tussen deze twee compartimenten, afhankelijk van intrinsieke fysiologische toestanden in neuronen of als reactie op extrinsieke neurale netwerkactiviteiten 1,2. Aangezien nieuw uitgescheiden neurotransmitters hun fysiologische functies voornamelijk opwekken via de oppervlakte-gelokaliseerde pool van receptoren, zijn de oppervlaktereceptorniveaus voor een bepaalde neurotransmitter een van de kritische determinanten van zijn signaleringscapaciteit binnen het neurale circuit3.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om oppervlaktereceptorniveaus in gekweekte neuronen te controleren, waaronder de oppervlaktebiotinyleringstest4, de immunofluorescentietest met een specifiek antilichaam in niet-permeabiliseerde omstandigheden5, of het gebruik van een receptortransgen dat genetisch is gefuseerd met een pH-gevoelige fluorescerende optische indicator (bijv. pHluorine)6. Daarentegen zijn deze benaderingen beperkt of onpraktisch bij het beoordelen van oppervlaktereceptorniveaus in vivo. De oppervlaktebiotinyleringsprocedure is bijvoorbeeld mogelijk niet praktisch voor het verwerken van grote hoeveelheden en monsteraantallen in vivo hersenweefsels vanwege de relatief hoge prijs en de daaropvolgende stappen die nodig zijn voor het zuiveren van de gebiotinyleerde eiwitten op avidine-geconjugeerde kralen. Voor neuronen die zijn ingebed in driedimensionale hersenarchitectuur, kunnen lage toegankelijkheid van antilichamen of problemen bij op microscoop gebaseerde kwantificering een significante beperking vormen voor het beoordelen van de oppervlaktereceptorniveaus in vivo. Om de verdeling van neurotransmitterreceptoren in intacte hersenen te visualiseren, kunnen niet-invasieve methoden, zoals positronemissietomografie, worden gebruikt om de receptorbezetting te meten en de oppervlaktereceptorniveauste schatten 7. Deze aanpak is echter kritisch afhankelijk van de beschikbaarheid van specifieke radioliganden, dure apparatuur en speciale expertise, waardoor deze minder toegankelijk is voor routinematig gebruik door de meeste onderzoekers.

Hier beschrijven we een eenvoudige, veelzijdige methode voor het meten van oppervlaktereceptorniveaus in experimentele dierlijke hersenen ex vivo met behulp van een in water oplosbare, membraan-ondoordringbare chemische crosslinker, bis (sulfosuccinimidyl) suberaat (BS3) 8,9. BS3 richt zich op primaire amines in de zijketen van lysineresiduen en kan covalent eiwitten in de nabijheid van elkaar kruisen. Wanneer hersenplakken vers worden bereid uit een gebied van belang en geïncubeerd in een buffer die BS3 bevat, worden de celoppervlakreceptoren gekruist met naburige eiwitten en transformeren ze dus in soorten met een hoger molecuulgewicht, terwijl de intracellulaire endomembrane-geassocieerde receptoren ongewijzigd blijven. Daarom kunnen de oppervlakte- en intracellulaire receptorpools worden gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en gekwantificeerd door western blot met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor de te bestuderen receptor.

Onvoorspelbare chronische milde stress (UCMS) is een beproefd experimenteel paradigma voor het induceren van chronische psychosociale stress bij knaagdieren10. UCMS lokt angst-/depressief-achtige gedragsfenotypes en cognitieve tekorten uit via de modulatie van een reeks neurotransmittersystemen, waaronder GABA en zijn receptoren10,11. In het bijzonder is de α5 subunit-bevattende GABA A-receptor (α5-GABAA R) betrokken bij de regulatie van geheugen en cognitieve functies12,13, wat wijst op de mogelijke betrokkenheid van veranderde functies van deze subeenheid bij UCMS-geïnduceerde cognitieve tekorten. In dit protocol gebruikten we de BS3 crosslinking assay om niveaus van oppervlakte-uitgedrukte α5-GABAAR in de prefrontale cortex van muizen blootgesteld aan UCMS te kwantificeren in vergelijking met niet-gestreste controlemuizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Al het dierenwerk in dit protocol werd voltooid in overeenstemming met de Ontario Animals for Research Act (RSO 1990, hoofdstuk A.22) en de Canadian Council on Animal Care (CCAC) en werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care Committee.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Bepaal de aantallen dieren die in de experimenten moeten worden gebruikt en verdeel ze in geschikte groepen of experimentele cohorten. Zie het discussiegedeelte voor een bespreking van de groepsgrootte, het geslacht en de statistische kracht.
    OPMERKING: Dit protocol is aangepast voor muizen (C57BL6 / J-stam; 2-4 maanden oud; meestal 20-30 g lichaamsgewicht; equivalente aantallen mannetjes en vrouwtjes die moeten worden gebruikt).
  2. Plaats de dieren onder UCMS of controleer niet-gestreste omstandigheden gedurende 5-8 weken, volgens het protocol zoals eerder beschreven14.
  3. Laat de dieren na de laatste UCMS-procedure 1 dag in hun thuiskooien blijven voordat ze worden gebruikt voor de crosslinking-test om acute stresseffecten op de receptorexpressie te voorkomen.

2. Bereiding van de stamoplossingen

  1. Bereid en bewaar de volgende oplossingen volgens de instructies voorafgaand aan de test.
    1. Bereid 5 M NaCl door 14,6 g NaCl op te lossen in 40 ml gedeïoniseerd water. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
    2. Bereid 1,08 M KCl door 3,22 g KCl op te lossen in 40 ml gedeïoniseerd water. Winkel bij RT.
    3. Bereid 400 mM MgCl 2 door 3,25 g MgCl 2·6H 2O op te lossen in 40 ml gedeïoniseerd water. Winkel bij RT.
    4. Bereid 1 M glycine door 3 g glycine op te lossen in 40 ml gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 °C.
    5. Bereid 1 M dithiothreitol (DTT) door 1,54 g DTT op te lossen in 10 ml gedeïoniseerd water. Filtersteriliseer het door een filter met een poriegrootte van 0,2 μm en aliquot in buisjes van 2 ml. Bewaren bij −20 °C.
    6. Bereid 10% Nonidet-P40 (NP-40) door het te verdunnen in een verhouding van 1:10 (v/v) in gedeïoniseerd water. Winkel bij RT.
    7. Bereid 0,5 M EDTA (pH = 8,0) en bewaar bij RT.
    8. Bereid 1 M HEPES-buffer (pH = 7,2-7,5) en bewaar bij 4 °C.
    9. Bereid 2,5 M of 45% (m/v) glucose en bewaar bij 4 °C.

3. Voorbereiding van de werkplek

  1. Verzamel op de dag van de BS3-crosslinkingtest de volgende materialen in de snijruimte voor dieren (figuur 1), met verschillende items die voorgekoeld zijn op ijs: een ijsemmer, een metalen temperatuurblok (voorgekoeld op ijs), ijskoude PBS in een conische buis van 50 ml en bevroren PBS in een petrischaal, filterpapier bevochtigd met PBS en geplaatst op een gekoeld plat oppervlak of blauw ijs, een hersenmatrix (1 mm interval voor het inbrengen van scheermesjes) voorgekoeld op ijs, scheermesjes (~10) voorgekoeld op ijs, dissectiegereedschappen (schaar, tang, een gebogen sonde), een tissue punch, 70% ethanol spray veegpapier en papieren handdoekjes, pipetpunten (200 μL), een pipettor (P200), een stopwatch, een memoblok, een pen en microcentrifugebuizen (1,5 ml).
    1. Label voorafgaand aan de test de microcentrifugebuizen met de monsterinformatie (bijv. dier-ID-nummer, behandelingstype [UCMS versus geen stress (NS)], hersengebied, met of zonder BS3, enz.).
      OPMERKING: Voor de BS3 crosslinking assays moeten twee monsters van elk hersengebied worden verzameld; het ene monster zal worden gebruikt voor crosslinking (met BS3) en het andere voor de niet-crosslinkingreactie (zonder BS3) als controle. Om monsters te nemen van twee hersengebieden (d.w.z. de prefrontale cortex [PFC] en hippocampus [HPC]) in 12 muizen, etiketteert u daarom 48 buizen voor initiële bemonstering (= 2 monsters × 2 regio's × 12 muizen) (te gebruiken in rubriek 6). Etiketteer nog eens twee sets van 48 buizen voor latere opslag (voor het opslaan van twee verschillende volumes [100 μL, 300 μL] van elk monster) (te gebruiken in rubriek 7). Het is dus vereist om in totaal 144 buizen te labelen voor deze cohortgrootte.
  2. Zorg er daarnaast voor dat de volgende apparatuur beschikbaar is in het laboratorium: een gekoelde microcentrifuge op tafel, een sonicator, een buisrotator (te gebruiken in de koelruimte of in de koelkast [4 °C]), een vriezer (−80 °C) voor het bewaren van monsters en een emmer droogijs voor de tijdelijke opslag van de monsters (te gebruiken in rubriek 7)

4. Voorbereiding van de werkoplossingen en buffers

OPMERKING: Bereid op de ochtend van de test de volgende oplossingen voor. Deze berekening is gebaseerd op de nodige oplossingen om twee hersengebieden (d.w.z. de PFC en HPC) van 12 muizen te verwerken.

  1. Bereid kunstmatig hersenvocht (aCSF, pH = 7,4) zoals vermeld in tabel 1. Doseer 750 μL aCSF in elke bemonsteringsbuis (de 48 buizen gelabeld in stap 3.1.1) en plaats ze in het metalen temperatuurblok op ijs om de buffer voor te koelen.
  2. Bereid de lysisbuffer voor zoals vermeld in tabel 2. Bewaren op ijs (400 μL te gebruiken per monster).
  3. Bereid een 52 mM BS3 stockoplossing (26x) in 5 mM natriumcitraatbuffer (pH = 5,0).
    1. Bereid eerst 100 mM citroenzuur (bouillon A) en 100 mM natriumcitraat (bouillon B).
    2. Verdun bouillon A en bouillon B in een verhouding van 1:20 met gedeïoniseerd water. Voeg elk 100 μL toe aan 1,9 ml water om respectievelijk 5 mM citroenzuur (kolf C) en 5 mM natriumcitraat (kolf D) te bereiden.
    3. Meng 410 μL bouillon C en 590 μL stam D om een natriumcitraatbuffer van 5 mM (pH = 5,0) te bereiden (oplossing E, 1 ml).
    4. Bevestig de pH van oplossing E met behulp van een pH-indicatorstrip.
    5. Los 24 mg BS3 op in 806,4 μL oplossing E door gedurende 30 s te vortexen om de BS3-stamoplossing te bereiden (26x).
    6. Bereid nog eens 1 ml oplossing E voor gebruik als voertuigbesturing voor de niet-verknopingsmonsters.
      OPMERKING: Bereid BS3-voorraadoplossing voor wanneer al het andere klaar is en het experiment op het punt staat te beginnen. De BS3 moet tot gebruik uitgedroogd bij 4 °C worden bewaard. Na reconstitutie blijft BS3 slechts ongeveer ≤3 uur actief. Aangezien de pH van de 5 mM natriumcitraatbuffer (oplossing E) naar verluidt in de loop van de tijd stijgt, waardoor versnelde BS3-hydrolyse ontstaat, wordt aanbevolen oplossing E vers uit stamoplossingen A en B9 te bereiden. Vanwege de beperkte oplosbaarheid van BS3 bij lage temperaturen, houdt u het gereconstitueerde BS3 op RT. Gebruik het gereconstitueerde BS3 in 3 uur en vries/ontdooi het gereconstitueerde BS3 niet in en gebruik het opnieuw samengestelde BS3 niet.

5. Dissectie van hersenweefsels

OPMERKING: Vanaf deze stap moeten ten minste twee mensen op een gecoördineerde manier samenwerken. Terwijl de ene persoon zich richt op de dissectie van het dier (stappen 5.2-5.10 en stap 6.3), moet de andere persoon als tijdwaarnemer werken en helpen bij het coördineren van de test (stap 5.1, stap 6.1, stap 6.2, stap 6.4 en stap 6.5)

  1. Breng het eerste dier voor dissectie uit de behuizing naar de snijruimte.
    OPMERKING: Omdat acute stressoren (bijvoorbeeld een nieuwe omgeving, de geur van bloed) de herseneiwitdynamiek kunnen beïnvloeden, moeten de dieren in hun thuiskooien worden gehouden die ver van het dissectiegebied worden geplaatst en vervolgens individueel in de snijruimte worden gebracht voor onmiddellijke onthoofding.
  2. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie gevolgd door onthoofding. Verwijder de hersenen snel uit de schedel en dompel ze onder in ijskoude PBS in een petrischaal gedurende 10-15 s (figuur 2).
    OPMERKING: De dieren worden niet verdoofd voor BS3-experimenten, omdat elk verdovingsmiddel mogelijk het oppervlaktepresentatieniveau van de neurotransmitterreceptoren kan beïnvloeden9.
  3. Plaats de gekoelde hersenen in de hersenmatrix op ijs, met de ventrale kant van de hersenen naar boven gericht (figuur 3).
  4. Steek het eerste scheermesje door de rand tussen de reukbol en de reuksteel om de hersenen coronaal door te snijden (figuur 4). Gebruik drie tot vier extra scheermesjes om het voorste deel van de hersenen coronaal te snijden met intervallen van 1 mm.
  5. Til de coronale plakjes van de hersenmatrix op door alle ingebrachte scheermesjes bij elkaar te houden, waardoor het achterste deel van de hersenen achterblijft in de hersenmatrix. Gebruik een tang om de scheermesjes van elkaar te scheiden en plaats ze op het platte, gekoelde oppervlak met de hersenschijf naar boven gericht (figuur 5).
  6. Identificeer de segmenten die het interessegebied bevatten. Kies voor het bemonsteren van de PFC de tweede en derde plak na de eerste plak met de olfactorische steel.
  7. Verwijder het interessegebied met behulp van een weefselpons (video 1), leg het opzij op het gekoelde scheermesje en verdeel het weefsel gelijkmatig in tweeën (bijvoorbeeld weefsels van de linker- versus rechterhersenhelft, waarbij de ene helft moet worden gebruikt voor de BS3-crosslinkingreactie en de andere helft voor de controle zonder crosslinking als het doeleiwit van belang gelijkelijk tot expressie komt in beide hemisferen).
  8. Hak elk weefsel in stukjes op het scheermesje met behulp van de fijne punt van de tang met meerdere verticale bewegingen tegen het mes (Video 2) in plaats van de weefsels te pureren of te slijpen. Dit zal het oppervlak dat toegankelijk is voor BS3 maximaliseren zonder de membraanintegriteit van de cellen ernstig in gevaar te brengen. Breng de gehakte weefsels onmiddellijk na het fijnhakken over in de juiste buisjes (zie stap 6.3).
  9. Voor het bemonsteren van de HPC haalt u het achterste deel van de hersenen uit de matrix en plaatst u de hersenen op bevochtigd filterpapier op het gekoelde platte oppervlak, met de dorsale zijde naar boven gericht (figuur 6).
  10. Gebruik een gebogen sonde en tang en nader vanaf de dorsale kant (Video 3), ontleed de HPC (dorsale helft, ventrale helft of beide) van beide hemisferen (één helft voor BS3-crosslinking en de andere helft voor de controle). Hak elk weefsel fijn zoals in stap 5.8 en breng het weefsel over in de juiste buisjes (zie stap 6.3).
    OPMERKING: De volledige dissectietijd voor elk dier moet op ~ 5 minuten worden gehouden om de experimentele omstandigheden en resultaten consistent te houden.

6. Crosslinking reactie

  1. Breng het volgende dier voor dissectie uit de behuizing naar de snijruimte wanneer de dissectie van de hersenen van de vorige muis bijna is voltooid (stap 5.10).
  2. Prik de op ijs voorgekoelde buis (vanaf stap 4.1) met 30 μl BS3-oplossing (26x) of mediumoplossing E vlak voordat de gehakte weefsels klaar zijn om in de juiste buizen te worden overgebracht. Vervang de pipetpunten tussen de buizen om ervoor te zorgen dat er geen BS3 wordt verontreinigd in de niet-verknopte controlebuizen.
  3. Breng de gehakte weefsels (van stap 5.8 en stap 5.10) over in de juiste buizen en begin vervolgens met het ontleden van het volgende dier (stap 5.2)
  4. Keer de buis om en meng deze om de weefselbrokken in kleinere stukjes te breken (Video 4) en begin met het incuberen van de monsters op de buisrotator in de koude ruimte gedurende 30 minuten tot 2 uur. Noteer de starttijd van de BS3-incubatie voor elke buis. Zie het discussiegedeelte voor de optimale incubatietijd.
  5. Blus de reactie door de buis te besprenkelen met 78 μL 1 M glycine en incubeer het monster verder gedurende 10 minuten bij 4 °C met constante rotatie. Noteer de begin- en eindtijd van het blussen voor elke buis. Blijf de persoon helpen die zich richt op de ontleding van het dier door het volgende dier mee te nemen (stap 6.1) en te helpen met crosslinking (stap 6.2).
    OPMERKING: Behandel elk monster met exact dezelfde timing voor alle monsters. Als de snijruimte ver weg is van de koelruimte, wordt ten zeerste aanbevolen dat een derde persoon wordt gerekruteerd om deel te nemen aan de incubatie van het monster en het blussen in de koelruimte.

7. Weefsellysis, eiwitpreparatie en western blot

  1. Draai de monsters na 10 minuten blussen (stap 6.5) gedurende 2 minuten op 20.000 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Als er een derde persoon beschikbaar is, gaat u verder met stap 7.2; Vries anders de monsters in op droogijs en pauzeer de test hier totdat de hersendissectie (sectie 5) en crosslinking (sectie 6) voor alle dieren zijn voltooid.
  2. Voeg 400 μL ijskoude lysisbuffer per buis toe.
  3. Soniceer de monsters gedurende 1 s vijf keer met intervallen van 5 s ertussen, terwijl u de monsters op ijs houdt.
  4. Spin monsters op 20.000 x g gedurende 2 minuten om onoplosbaar weefselafval (pellet) uit te spinnen en het supernatant op te slaan.
  5. Gebruik 5 μL van het supernatant voor het meten van de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchoninic acid (BCA) assay.
  6. Verdeel de rest van het supernatant in twee buizen; één buis bevat 100 μL supernatant voor de daaropvolgende western blot, en de andere buis bevat de rest (~300 μL) voor langdurige opslag bij −80 °C. Voeg een passende hoeveelheid 4x SDS-monsterbuffer (aangevuld met β2-mercaptoethanol) toe aan de monsters en incubeer gedurende 10 minuten bij 70 °C.
  7. Voer 10-20 μg eiwit per put uit op een acrylamidegel voor elektroforese (SDS-PAGE) en breng vervolgens eiwitten over naar het polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan voor western blot-analyse.
  8. Blokkeer het PVDF-membraan in 5% (g/v) magere melk opgelost in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBS-T) gedurende 1 uur bij RT.
  9. Was het membraan twee keer kort met TBS-T en incubeer het met het primaire antilichaam verdund in TBS-T gedurende een nacht bij 4 °C.
  10. Was het primaire antilichaam drie keer gedurende 10 minuten elk in TBS-T bij RT.
  11. Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam verdund in TBS-T gedurende 1 uur bij RT.
  12. Was het secundaire antilichaam drie keer gedurende 10 minuten elk in TBS-T bij RT.
  13. Incubeer het membraan in verbeterd chemiluminescentiereagens en detecteer het signaal met behulp van het geldocumentatieapparaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de haalbaarheid aan te tonen van de BS3 crosslinking assay voor het evalueren van de oppervlakte α5-GABA A R niveaus in de muis PFC, voerden we 10 μg elk van BS3-crosslinked en niet-crosslinked eiwitmonsters uit op SDS-PAGE en analyseerden de eiwitten door western blot met behulp van een anti-α5-GABAAR-antilichaam (konijnenpolyklonaal) (figuur 7). De niet-verknoopte eiwitmonsters gaven de totale hoeveelheid α5-GABA A R bij ~ 55 kDa, terwijl de BS3-crosslinked eiwitmo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel de impact van chronische psychosociale stress op gedrag (d.w.z. emotionaliteit en cognitieve tekorten) en moleculaire veranderingen (d.w.z. verminderde expressie van GABAerge genen en bijbehorende tekorten in GABAerge neurotransmissie) goed gedocumenteerd zijn10, moeten de mechanismen die ten grondslag liggen aan dergelijke tekorten verder worden onderzocht. In het bijzonder, gezien de recente studie die aantoont dat chronische stress het neuronale proteoom aanzienlijk beïnvloedt door overb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken het personeel van de CAMH-dierenfaciliteit voor de zorg voor de dieren gedurende de studieduur. Dit werk werd ondersteund door het Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant # 470458 to T.T.), het Discovery Fund van de CAMH (naar T.P.), de National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD award #25637 to E.S.), en het Campbell Family Mental Health Research Institute (to E.S.). E.S. is de oprichter van Damona Pharmaceuticals, een biofarmaceutisch bedrijf dat zich toelegt op het brengen van nieuwe GABAerge verbindingen naar de kliniek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020
1 M HEPESGibco15630080
10x TBSBio-Rad1706435
2.5 M (45%, w/v) GlucoseSigmaG8769
2-mercaptoethanolSigmaM3148
4x SDS sample buffer (Laemmli)Bio-Rad1610747
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)PierceA39266No-Weigh Format; 10 x 2 mg
Brain matrixTed Pella15003Voor muis, 30 g volwassen, coronaal, 1 mm
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC4901
Curved probeFine Science Tools10088-15Gross Anatomy Probe; hoek 45
Deionized watermilli-QEQ 7000Ultrapuur water [resistiviteit 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; totaal organisch koolstof (TOC) ≤ 5 ppb] 
Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
Filter paper (3MM)Whatman3030-917
Forceps (groot)Fine Science Tools11152-10Extra fijne Graefe-forceps
Forceps (klein)Fine Science Tools11251-10Dumont #5 Forceps
GABA-A R alpha 5 antibodyInvitrogenPA5-31163Polyclonal konijn IgG; detecteert foutmelding bij chemische crosslinking
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibodyR&D SystemsPPS027Polyclonal konijn IgG; cross-reageert met muis en rat
GlycineSigmaW328707
Horseradish peroxidase-geconjugeerd geit anti-konijn IgG (H+L)Bio-Rad1721019
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O)SigmaM2670
Nonidet-P40, vervanger (NP-40)SantaCruz68412-54-4
Kaliumchloride (KCl)SigmaP9541
Protease inhibitor cocktailSigmaP8340
PVDF membraanBio-Rad1620177
Schaar (groot)Fine Science Tools14007-14Chirurgische schaar - gekarteld
Schaar (klein)Fine Science Tools14060-09Fijne schaar - scherp
Natriumchloride (NaCl)SigmaS9888
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) Qsonica15338284
Centrifuge op tafel met koelingEppendorf5425R
Weefselpunch (ID 1 mm)Ted Pella15110-10Miltex Biopsy Punch met plunjer, ID 1,0 mm, OD 1,27 mm
Trans-Blot Turbo 5x Transfer bufferBio-Rad10026938
Tube rotator (LabRoller)LabnetH5000

Referenties

  1. Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
  2. Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
  3. Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
  4. Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
  5. Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
  6. Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
  7. Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
  8. Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
  9. Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 5, Unit 5.30 1-19 (2012).
  10. Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
  11. Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
  12. Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
  13. Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
  14. Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208(2021).
  15. Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
  16. Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
  17. Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
  18. Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
  19. Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358(2016).
  20. Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
  21. Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
  22. Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
  23. Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BS3 crosslinkingGABA receptorceloppervlakterecptorenprefrontale cortexWestern blotweefseldissectieangstmodel
BS3 Chemische crosslinking assay: evaluatie van het effect van chronische stress op het celoppervlak GABAA receptorpresentatie in het knaagdierbrein
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.