Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65082

⸱

22 december 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Medical Electrophysiology of Ministry of Education, Collaborative Innovation Center for Prevention and Treatment of Cardiovascular Disease, Institute of Cardiovascular Research, Southwest Medical University, 2Department of Cardiology, the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, 3Department of Cardiology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 4Department of Pharmacology, University of Oxford

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Samenvatting

De pro-aritmische hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie. Het muizenhart is een wijdverbreide soort voor het modelleren van erfelijke hartritmestoornissen, waaronder CPVT. Het gelijktijdig optisch in kaart brengen van transmembraanpotentiaal (Vm) en calciumtransiënten (CaT) van met Langendorff geperfuseerde muizenharten heeft het potentieel om mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan aritmogenese. Vergeleken met het onderzoek op cellulair niveau kan de optische mappingtechniek enkele elektrofysiologische parameters testen, zoals de bepaling van activering, geleidingssnelheid, actiepotentiaalduur en CaT-duur. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput optische mapping van CaT en Vm in muizen wildtype en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en tijdens de isoproterenol-provocatie. Deze aanpak heeft een haalbare en betrouwbare methode aangetoond voor het mechanistisch bestuderen van CPVT-ziekte in een ex vivo muizenhartpreparaat.

Inleiding

Erfelijke hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie (PVT) na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie 1,2,3,4 . Recent bewijs na de eerste melding als klinisch syndroom in 1995 impliceerde mutaties in zeven genen, die allemaal betrokken zijn bij de afgifte van Ca 2+ in sarcoplasmatisch reticulair (SR) in deze toestand: de meest frequent gerapporteerde RYR2 die codeert voor ryanodinereceptor 2 (RyR2) van Ca2+ afgiftekanalen5,6, FKBP12.67, CASQ2 codeert voor cardiale calsequestrine8, TRDN codeert voor het junctionele SR-eiwit triadine 9, en CALM19, CALM2 10 en CALM3 codeert identiek voor calmoduline11,12. Deze genotypische patronen schrijven de aritmische gebeurtenissen toe aan de ongereguleerde pathologische afgifte van SR-opslag Ca2+12.

Spontane Ca 2+ afgifte van SR kan worden gedetecteerd als Ca 2+ vonken of Ca 2+ golven, die de Na+/Ca 2+ wisselaar (NCX) activeert. De wisselaar van één Ca2+ voor drie Na+ genereert een inwaartse stroom, die de diastolische depolarisatie versnelt en de membraanspanning naar de actiepotentiaaldrempel (AP) drijft. Bij RyR2 knock-in muizen leidt de verhoogde activiteit van RyR2R4496C in de sinusknoop (SAN) tot een onverwachte afname van de SAN-automaticiteit door Ca 2+-afhankelijke afname van I Ca,L en SRCa 2+ depletie tijdens diastole, waarbij subcellulaire pathofysiologische veranderingen worden geïdentificeerd die bijdragen aan de SAN-disfunctie bij CPVT-patiënten13,14. Het optreden van de verwante cardiomyocyt cytosolischeCa 2+ golven is waarschijnlijker na verhogingen van het cytosolische [Ca2+] op de achtergrond na RyR-sensibilisatie door catecholamine, waaronder isoproterenol (ISO), provocatie.

Gedetailleerde kinetische veranderingen in Ca 2+-signalering na RyR2-gemedieerde Ca2+-afgifte als reactie op activering van actiepotentiaal (AP) die de oorzaak kunnen zijn van de waargenomen ventriculaire aritmieën in intacte cardiale CPVT-modellen moeten nog worden bepaald voor het volledige bereik van gerapporteerde RyR2-genotypen12. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput mapping van Ca2+ signalen en transmembraanpotentialen (Vm) in muizen wild-type (WT) en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en na isoproterenol provocatie. Dit protocol biedt een methode voor de mechanistische studie van CPVT-ziekte in geïsoleerde muizenharten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor de experimenten worden mannelijke 10 tot 14 weken oude wildtype muizen of RyR2-R2474S/+ muizen (C57BL/6 achtergrond) met een gewicht van 20-25 g gebruikt. Alle procedures zijn goedgekeurd door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Southwest Medical University, Sichuan, China (goedkeuring nr.20160930) in overeenstemming met de nationale richtlijnen waaronder de instelling opereert.

1. Voorbereiding

  1. Voorraad oplossingen
    1. Blebbistatine-stockoplossing: Voeg 1 ml 100% dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de oorspronkelijke kolf met 2,924 mg (-) blebbistatinepoeder om een concentratie van 10 mM te bereiken.
    2. Spanningsindicator RH237 voorraadoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan de originele kolf met 1 mg RH237-poeder om een concentratie van 2,01 mM te bereiken.
    3. Calciumindicator Rhod-2 AM voorraadoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan 1 mg Rhod-2 AM-poeder om een concentratie van 0,89 mM te bereiken.
    4. Pluronic F127 stockoplossing: Voeg 1 ml 100% DMSO toe aan 200 mg Pluronic F127 om een concentratie van 20% w/v (0,66 mM) te bereiken.
    5. Aliquot de stockoplossingen in PCR-buisjes van 200 μl in 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM en 51 μl blebbistatine) voor eenmalig of dubbel gebruik om herhaaldelijk bevriezen en ontdooien te voorkomen. Wikkel de oplossingen vervolgens in aluminiumfolie en bewaar ze bij -20 °C, behalve de Pluronic F127-voorraadoplossing die in een donkere kamer bij kamertemperatuur wordt geplaatst.
  2. Perfusie oplossing
    1. Krebs-oplossing (in mM): Bereid 1 L Krebs-oplossing (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH 2 PO 4 1.0, KCl4.7, MgCl 2 1.05, CaCl2 1.35 en glucose 10).
    2. Filtreer de oplossing met een aseptisch naaldfilter van 0,22 μm en oxygeneer met 95% O 2/5% CO2.
    3. Neem 40 ml Krebs-oplossing in een centrifugaalbuis van 50 ml en bewaar deze bij 4 °C voor follow-up hartisolatie.
  3. Het Langendorff-perfusiesysteem en het optische kaartapparaat
    1. Stel het Langendorff-perfusiesysteem in.
      1. Zet het waterbad aan en stel de temperatuur in op 37 °C.
      2. Was het Langendorff-perfusiesysteem met 1 L gedeïoniseerd water.
      3. Perfuseer de oplossing uit het inlaatkanaal en stel het uitstroomdebiet in op 3,5-4 ml/min. Zuurstof het perfusaat vervolgens met O 2/CO2 (95%/5%) gas bij 37 °C.
        OPMERKING: Een luchtbel is nooit toegestaan in het perfusiesysteem.
    2. Bereid het optische mappingsysteem voor.
      1. Installeer de EMCCD-camera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) (512 × 512 pixels), lens (40x vergroting), golflengtesplitter light-emitting diodes (LED's), elektrocardiogram (ECG)-monitor en stimulatie-elektrode (Afbeelding 1).
      2. Stel de juiste werkafstand van de lens naar de hartpositie in.
      3. Plaats twee LED's op de diagonale positie van het thermostatische bad voor een gelijkmatige verlichting, waardoor een golflengte van 530 nm ontstaat voor het genereren van excitatielicht. Gebruik een ET525/50 sputterfilter om out-of-band licht voor de LED's te verwijderen.
      4. Pas de handgreepschakelaar aan om een gelijk vierkant van het doeloppervlak te bereiken, waardoor de spannings- en calciumbeelden adequaat op de verwervingsinterface verschijnen.
      5. Draai het diafragma van de lens naar de maximale diameter om te voorkomen dat spannings- of calciumsignalen lekken.
      6. Stel de cameralens op de juiste hoogte af, want deze heeft een fijne werkafstand tot het thermostatische bad, meestal wordt 10 cm gebruikt.
      7. Schakel de camera in voor een stabiele bemonsteringstemperatuur bij -50 °C.

2. Werkwijze

  1. Oogst, canulatie en perfusie van muizenhart
    1. Injecteer de dieren intraperitoneaal met avertine-oplossing (1,2%, 0,5-0,8 ml) en heparine (200 eenheden) om lijden en pijnreflex te minimaliseren en de vorming van bloedstolsels te voorkomen. Offert de dieren na 15 minuten door cervicale dislocatie.
    2. Open de kist met een schaar, oogst het hart voorzichtig en plaats het in de koude Krebs-oplossing (4 °C, 95% O 2, 5% CO2) om de stofwisseling te vertragen en het hart te beschermen.
    3. Verwijder het omringende weefsel van de aorta, kanunneer de aorta met een op maat gemaakte canulerende naald (buitendiameter: 0,8 mm, binnendiameter: 0,6 mm, lengte: 27 mm) en fixeer deze met een 4-0 zijden hechtdraad.
    4. Doordrenk het hart met het Langendorff-systeem met een constante snelheid van 3,5-4,0 ml/min en houd de temperatuur op 37 ± 1 °C.
      OPMERKING: Alle volgende procedures worden in deze toestand uitgevoerd.
    5. Steek een klein plastic buisje (0,7 mm diameter, 20 mm lengte) in de linker hartkamer om de congestie van de oplossing in de kamer te verminderen om overbelasting te voorkomen.
  2. Ontkoppelaar van excitatie-contractie en dual-dye belasting
    1. Plaats twee draden in het parfum in het bad, schakel de stroomvoorziening van de ECG-versterkerbox en de elektrische stimulatieregelaar in en start vervolgens de ECG-software waarnaar wordt verwezen en controleer het ECG continu.
    2. Voer de volgende stappen in het donker uit wanneer het hart een stabiele toestand bereikt (het hart klopt ritmisch met ~400 slagen per minuut).
    3. Meng 50 μL 10 mM blebbistatine-stockoplossing met 50 ml Krebs-oplossing om een concentratie van 10 μM te bereiken. Laat het mengsel van blebbistatine en Krebs-oplossing gedurende 10 minuten constant in het hart doordringen om contractie los te koppelen van excitatie en contractieartefacten tijdens het filmen te voorkomen.
    4. Gebruik een rode zaklamp om te controleren of de samentrekking van het hart volledig stopt, omdat samentrekking de kwaliteit van het laden van de kleurstof zal beïnvloeden.
    5. Meng na het ontkoppelen van excitatie-contractie 15 μL Rhod-2 AM-voorraadoplossing met 15 μL Pluronic F127-stockoplossing in 50 ml Krebs-oplossing om de eindconcentraties van 0,267 μM Rhod-2 AM en 0,198 μM Pluronic F127 te bereiken. Doordrenk het hart vervolgens continu met Rhod-2 AM werkoplossing gedurende 15 minuten in het Langendorff-perfusiesysteem.
    6. Houd de zuurstoftoevoer op peil tijdens het laden van intracellulaire calciumkleurstoffen. Aangezien bellen gemakkelijk worden gevormd in Pluronic F127, moet u een bellenvanger in het perfusiesysteem plaatsen om gasembolisatie van de kransslagaders te voorkomen.
    7. Verdun 10 μL RH237-stockoplossing in 50 ml perfusaat om de uiteindelijke concentratie van 0,402 μM te bereiken en laad gedurende 10 minuten.
    8. Maak aan het einde van het laden met dubbele kleurstof een reeks foto's om er zeker van te zijn dat zowel de spannings- als de calciumsignalen voldoende zijn voor analyse (geen interactie tussen twee signalen).
  3. Optische mapping en aritmie-inductie
    OPMERKING: Het optisch in kaart brengen begint na het stoppen van de contractie en een geschikte kleurstofbelasting, en het hart wordt achtereenvolgens geperfundeerd zoals in de hierboven beschreven stappen in 2.1 (4).
    1. Schakel de twee LED's in voor excitatielichten en pas hun intensiteit aan op het juiste bereik (sterk genoeg voor verlichting en relatief eenvoudig filmen, maar niet te robuust voor overbelichting).
    2. Plaats het hart onder het detectieapparaat, zorg ervoor dat het voldoende verlicht wordt door twee LED's en stel de diameter van de lichtvlek in op 2 cm.
    3. Stel de werkafstand van de lens tot het hart in op 10 cm, wat een bemonsteringsfrequentie van bijna 500 Hz en een ruimtelijke resolutie van 120 x 120 μm per pixel oplevert.
    4. Open de signaalbemonsteringssoftware om de camera digitaal te bedienen om tegelijkertijd spannings- en calciumsignalen vast te leggen.
    5. Start de myopacer-veldstimulator en stel het stimulatiepatroon in op Transistor Transistor Logic (TTL), 2 ms stimulatieduur voor elke puls en 0.3 V als initiële intensiteit.
    6. Gebruik 30 opeenvolgende 10 Hz S1-stimuli om de diastolische spanningsdrempel van het hart te testen die wordt aangedreven door de ECG-opnamesoftware. Verhoog geleidelijk de spanningsamplitude totdat 1:1 opname is gerealiseerd (controleer QRS-golf van de ECG-monitor, actiepotentiaal (AP) en calciumtransiënten (CaT)-signalen).
    7. Na het bepalen van de spanningsdrempel, loopt u het hart met een intensiteit van 2x de diastolische spanningsdrempel met een paar platina-elektroden die zijn bevestigd aan de epicardiale apex van de linker hartkamer (LV) (ELVA).
    8. Implementeer het S1S1-protocol om calcium- of actiepotentiaalalternanen en restitutie-eigenschappen te meten. Versnel het hart achtereenvolgens met een basiscycluslengte van 100 ms, waarbij u elke volgende reeks 10 ms van de cycluslengte verlaagt totdat 50 ms is bereikt. Elke aflevering bevat 30 opeenvolgende stimuli met een pulsbreedte van 2 ms. Begin tegelijkertijd met het optisch in kaart brengen vóór stimulatie (de bemonsteringstijd omvat ~10 sinusritmes en pacingduur).
    9. Om de ventriculaire effectieve refractaire periode (ERP) te meten met behulp van het S1S2-stimulusprotocol, begint u met een S1S1-stimulatiecycluslengte van 100 ms met een S2 gekoppeld aan 60 ms met een stapafname van 2 ms totdat S2 er niet in slaagt het ectopische QRS-complex vast te leggen.
    10. Voer voor aritmie-inductie eeuwigdurende burst-stimulatie van 50 Hz uit (50 continue elektrische stimulaties met een pulsbreedte van 2 ms) en voer dezelfde stimulatie-episode uit na een rustinterval van 2 s.
    11. Observeer ECG-opnames zorgvuldig tijdens de continue hoogfrequente pacing-periode, zodat de gelijktijdige optische mapping-opnames onmiddellijk kunnen beginnen wanneer een interessante aritmische ECG-golf wordt gegenereerd (aangezien de meeste hartritmestoornissen worden veroorzaakt door elektrische stimulatie, worden de optische signalen 2-3 s vóór burst-stimulatie bemonsterd in geval van verlies van belangrijke cardiale gebeurtenissen).
    12. Beeld met EMCCD-camera (bemonsteringsfrequentie: 500 Hz, pixelgrootte: 64 x 64).
  4. Data-analyse
    1. Laden van beelden en signaalverwerking
      1. Druk op Map selecteren en Afbeeldingen laden om de afbeeldingen in de beeldacquisitiesoftware te laden voor semi-automatische massale videogegevensanalyse volgens de eerder beschreven instellingen en protocollen15,16.
      2. Voer de juiste samplingparameters in (zoals pixelgrootte en framerate).
      3. Stel de afbeeldingsdrempel in door handmatige invoer en selecteer het interessegebied (ROI).
      4. Implementeer een Gaussiaans ruimtelijk filter van 3 x 3 pixels, een Savitzky-Goaly-filter en een basislijncorrectie met een hoge hoed.
      5. Druk op Afbeeldingen verwerken om de basislijn te verwijderen en de elektrofysiologische parameters te berekenen, zoals APD80 en CaTD50.
    2. Analyse van elektrofysiologische parameters
      1. Stel de initiatietijd van APD in op de piek en het eindpunt op 80% repolarisatie (APD80) voor de berekening van APD80. Evenzo wordt de starttijd van CaTD gedefinieerd als de piek en het eindpunt als de ontspanning van 80%.
      2. De meting van de geleidingssnelheid (CV) is afhankelijk van de pixelgrootte en de actiepotentiaalgeleidingstijd tussen twee pixels of meer. Bereken de gemiddelde snelheid van alle gekozen pixels - dit is de gemiddelde geleidingssnelheid van het geselecteerde gebied. Genereer tegelijkertijd overeenkomstige isochronale afbeeldingen voor een duidelijk beeld van de geleidingsrichting.
        OPMERKING: O'Shea et al.15 rapporteerden de CV-meting in detail.
      3. Voor de analyse van alternanen en aritmieën worden calciumalternanen gedefinieerd als een continue grote en kleine piekamplitude die afwisselend verschijnen. Gebruik de piekamplitudeverhouding om de ernst van frequentieafhankelijke alternanen te beoordelen (1-A2/A1). Pas fasekaarten toe om complexe aritmieën zoals ventriculaire tachycardie (VT) te analyseren. Zoek naar de rotoren die duidelijk in een specifiek gebied verschijnen terwijl de rotors verschuiven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Optical mapping is de afgelopen tien jaar een populaire benadering geweest bij het bestuderen van complexe hartritmestoornissen. De optische mapping-opstelling bestaat uit een EMCCD-camera, die een bemonsteringsfrequentie tot 1.000 Hz en een ruimtelijke resolutie van 74 x 74 μm voor elke pixel oplevert. Het maakt een vrij hoge signaal-ruisverhouding mogelijk tijdens signaalbemonstering (Figuur 1). Zodra het met Langendorff doorbloede hart een stabiele toestand bereikt en het laden van de kle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op basis van onze ervaring zijn de sleutels tot een succesvolle dual-dye optische mapping van een muishart een goed voorbereide oplossing en hart, het laden van kleurstoffen, het bereiken van de beste signaal-ruisverhouding en het verminderen van het bewegingsartefact.

Bereiding van de oplossing
De oplossing van Krebs is essentieel voor een succesvol hartexperiment. MgCl 2- en CaCl2-voorraadoplossingen (1 mol/L) worden van tevoren bereid rekening houde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81700308 tot XO en 31871181 tot ML, en 82270334 tot XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 tot XO, 23ZYZYTS0433 en 2022YFS0607 tot XT, en 2022NSFSC1602 tot TC) en State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 tot XO), MRC (G10031871181 tot ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE bij Oxford (ML) beurzen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 μm syringe filterMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, ChinaN/AOm oplossing te filteren
15 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011150
1 mL Pasteur pipetteBeijing Labgic Technology Co., Ltd. China00900026
1 mL SyringeB. Braun Medical Inc.YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tubeSangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. ChinaF611541-0010De stockoplossingen af te meten  om herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen
50 mL centrifuge tubeGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. ChinaCFT011500Tyrode's oplossing bij 4 °C bewaren voor het isoleren van het hart
585/40 nm filterChroma TechnologyN/AFilter voor calciumsignaal
630 nm long-pass filterChroma TechnologyG15604AJFilter voor voltagesignaal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United KingdomT48402-100GOm het lijden en pijnreflex te minimaliseren
BlebbistatinTocris Bioscience, Minneapolis, MN, United StatesSLBV5564Excitatie-contractie ontkoppelingsmiddel om  bewegingsartefact tijdens mapping te elimineren
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBK1794VVoor Tyrode's oplossing
Custom-made thermostatic bathMappingLab, United KingdomTBC-2.1Om de temperatuur van de perfusieoplossing te handhaven
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich(RNBT7442)Oplosmiddel voor kleurstoffen
Dumont forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAF030
ElectroMap softwareUniversity of BirminghamN/AKwantificering van elektrische parameters
EMCCD cameraEvolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United StatesA18G150001Beelden voor optische signalen verwerven
ET525/36 sputter coated filterChroma Technology319106Excitatiefilter
GlucoseSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBT4811VVoor Tyrode's oplossing
Heparin SodiumChengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China(H51021209)Om bloedstolsels in de kransslagader te voorkomen
 Iris forcepsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYAA010
IsoproterenolMedChemExpress, Carlsbad, CA, United StatesHY-B0468/CS-2582
KClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS5003Voor Tyrode's oplossing
MacroLEDCairn Research, Faversham, United Kingdom7355/7356De excitatielicht van fluorescentieproeven
MacroLED light sourceCairn Research, Faversham, United Kingdom7352De LED's aansturen
Mayo scissorsMedical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, ChinaYBC010
MetaMorphMolecular DevicesN/AOptische signalen samplen
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBS6841VVoor Tyrode's oplossing
MICRO3-1401Cambridge Electronic Design limited, United KingdomM5337De elektrische stimulator en Spike2 software verbinden
MyoPacer EP field stimulatorIon Optix Co, Milton, MA, United StatesS006152Elektrische stimulator
NaClSigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBS2340VVoor Tyrode's oplossing
NaH2PO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesBCBW9042Voor Tyrode's oplossing
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United StatesSLBX3605Voor Tyrode's oplossing
NeuroLog SystemDigitimerNL905-229Voor ECG-versterker
OmapScope5MappingLab, United KingdomN/ACalcium-alternans- en aritmie-analyse
Ophthalmic scissorsHuaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, ChinaT4-3904
OptoSplitCairn Research, Faversham, United Kingdom6970De emissielicht splitsen voor het tegelijkertijd detecteren van Ca2+ en Vm 
Peristalic pumpLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,BT100-2JOm de oplossing te pompen
Petri dishBIOFILTCD010060
Pluronic F127Invitrogen, Carlsbad, CA, United States1899021Om het laden met Rhod2AM te verbeteren
RH237Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States1971387Spanningsgevoelige kleurstof
Rhod-2 AMInvitrogen, Carlsbad, CA, United States1890519Calciumindicator
Silica gel tubeLonger Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,96402-16Aansluiten op de peristaltische pomp
Silk sutureYuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China20172650032Om de aorta te fixeren
Spike2Cambridge Electronic Design limited, United KingdomN/AECG-gegevens opnemen en analyseren
Stimulation electrodeMappingLab, United KingdomSE1600-35-2020
T510lpxrChroma Technology312461Voor lichtbron
T565lpxrChroma Technology321343Voor lichtbron

Referenties

  1. Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
  2. Goddard, C. A., et al. Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts. Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).
  3. Sabir, I. N., et al. Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).
  4. Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification. Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).
  5. Leenhardt, A., et al. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients. Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).
  6. Priori, S. G., et al. Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).
  7. Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
  8. Novak, A., et al. Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).
  9. Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. CACNA1C-related disorders. GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).
  10. Makita, N., et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility. Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).
  11. Gomez-Hurtado, N., et al. Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks. Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).
  12. Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).
  13. Neco, P., et al. Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).
  14. Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation. Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).
  15. O'Shea, C., et al. ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology. Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).
  16. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  17. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).
  18. Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. Open-source low-cost cardiac optical mapping system. PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).
  19. Lucas-Lopez, C., et al. Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin. European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).
  20. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).
  21. Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
  22. Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
  23. O'Shea, C., et al. High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).
  24. He, S., et al. A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts. Scientific Data. 8 (1), 314(2021).
  25. Lei, M., Huang, C. L. Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks. Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).
  26. Mal Baudot,, et al. Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity. Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).
  27. Dai, W., et al. ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction. Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).
  28. Glukhov, A. V., et al. Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1. European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).
  29. Torrente, A. G., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  30. Yang, B., et al. Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).
  31. Dong, R., et al. A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing. Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).
  32. He, S., et al. A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart. Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).
  33. Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).
  34. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).
  35. Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium. Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Dualdye imagingRyR2 knock in muizenLangendorff perfusiecalciumtransi ntenmembraanpotentiaalactiepotentiaalduurisoproterenol challengemodellen voor hartaritmie
Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.