Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De pro-aritmische hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie. Het muizenhart is een wijdverbreide soort voor het modelleren van erfelijke hartritmestoornissen, waaronder CPVT. Het gelijktijdig optisch in kaart brengen van transmembraanpotentiaal (Vm) en calciumtransiënten (CaT) van met Langendorff geperfuseerde muizenharten heeft het potentieel om mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan aritmogenese. Vergeleken met het onderzoek op cellulair niveau kan de optische mappingtechniek enkele elektrofysiologische parameters testen, zoals de bepaling van activering, geleidingssnelheid, actiepotentiaalduur en CaT-duur. Dit artikel presenteert de instrumentatie-opstelling en experimentele procedure voor high-throughput optische mapping van CaT en Vm in muizen wildtype en heterozygote RyR2-R2474S/+ harten, gecombineerd met geprogrammeerde elektrische stimulatie voor en tijdens de isoproterenol-provocatie. Deze aanpak heeft een haalbare en betrouwbare methode aangetoond voor het mechanistisch bestuderen van CPVT-ziekte in een ex vivo muizenhartpreparaat.
Inleiding
Erfelijke hartaandoening catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie (CPVT) manifesteert zich als episodes van polymorfe ventriculaire tachycardie (PVT) na fysieke activiteit, stress of catecholamine-provocatie, die kan verslechteren tot mogelijk fatale ventriculaire fibrillatie 1,2,3,4 . Recent bewijs na de eerste melding als klinisch syndroom in 1995 impliceerde mutaties in zeven genen, die allemaal betrokken zijn bij de afgifte van Ca 2+ in sarcoplasmatisch reticulair (SR) in deze toestand: de meest frequent gerapporteerde RYR2 d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voor de experimenten worden mannelijke 10 tot 14 weken oude wildtype muizen of RyR2-R2474S/+ muizen (C57BL/6 achtergrond) met een gewicht van 20-25 g gebruikt. Alle procedures zijn goedgekeurd door de commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Southwest Medical University, Sichuan, China (goedkeuring nr.20160930) in overeenstemming met de nationale richtlijnen waaronder de instelling opereert.
1. Voorbereiding
- Voorraad oplossingen
- Blebbistatine-stockoplossing: Voeg 1 ml 100% dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de oorspronkelijke kolf met 2,924 mg (-) blebbistatinepoeder om een concentratie van....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Optical mapping is de afgelopen tien jaar een populaire benadering geweest bij het bestuderen van complexe hartritmestoornissen. De optische mapping-opstelling bestaat uit een EMCCD-camera, die een bemonsteringsfrequentie tot 1.000 Hz en een ruimtelijke resolutie van 74 x 74 μm voor elke pixel oplevert. Het maakt een vrij hoge signaal-ruisverhouding mogelijk tijdens signaalbemonstering (Figuur 1). Zodra het met Langendorff doorbloede hart een stabiele toestand bereikt en het laden van de kle.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Op basis van onze ervaring zijn de sleutels tot een succesvolle dual-dye optische mapping van een muishart een goed voorbereide oplossing en hart, het laden van kleurstoffen, het bereiken van de beste signaal-ruisverhouding en het verminderen van het bewegingsartefact.
Bereiding van de oplossing
De oplossing van Krebs is essentieel voor een succesvol hartexperiment. MgCl 2- en CaCl2-voorraadoplossingen (1 mol/L) worden van tevoren bereid rekening houde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81700308 tot XO en 31871181 tot ML, en 82270334 tot XT), Sichuan Province Science and Technology Support Program (CN) (2021YJ0206 tot XO, 23ZYZYTS0433 en 2022YFS0607 tot XT, en 2022NSFSC1602 tot TC) en State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 tot XO), MRC (G10031871181 tot ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE bij Oxford (ML) beurzen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm syringe filter | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China | N/A | Om oplossing te filteren |
| 15 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011150 | |
| 1 mL Pasteur pipette | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China | 00900026 | |
| 1 mL Syringe | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR tube | Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China | F611541-0010 | De stockoplossingen af te meten om herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen |
| 50 mL centrifuge tube | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Tyrode's oplossing bij 4 °C bewaren voor het isoleren van het hart |
| 585/40 nm filter | Chroma Technology | N/A | Filter voor calciumsignaal |
| 630 nm long-pass filter | Chroma Technology | G15604AJ | Filter voor voltagesignaal |
| Avertin (2,2,2-tribromoethanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom | T48402-100G | Om het lijden en pijnreflex te minimaliseren |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States | SLBV5564 | Excitatie-contractie ontkoppelingsmiddel om bewegingsartefact tijdens mapping te elimineren |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBK1794V | Voor Tyrode's oplossing |
| Custom-made thermostatic bath | MappingLab, United Kingdom | TBC-2.1 | Om de temperatuur van de perfusieoplossing te handhaven |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Oplosmiddel voor kleurstoffen |
| Dumont forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAF030 | |
| ElectroMap software | University of Birmingham | N/A | Kwantificering van elektrische parameters |
| EMCCD camera | Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States | A18G150001 | Beelden voor optische signalen verwerven |
| ET525/36 sputter coated filter | Chroma Technology | 319106 | Excitatiefilter |
| Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBT4811V | Voor Tyrode's oplossing |
| Heparin Sodium | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China | (H51021209) | Om bloedstolsels in de kransslagader te voorkomen |
| Iris forceps | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS5003 | Voor Tyrode's oplossing |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7355/7356 | De excitatielicht van fluorescentieproeven |
| MacroLED light source | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 7352 | De LED's aansturen |
| Mayo scissors | Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | Optische signalen samplen |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBS6841V | Voor Tyrode's oplossing |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | M5337 | De elektrische stimulator en Spike2 software verbinden |
| MyoPacer EP field stimulator | Ion Optix Co, Milton, MA, United States | S006152 | Elektrische stimulator |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBS2340V | Voor Tyrode's oplossing |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | BCBW9042 | Voor Tyrode's oplossing |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States | SLBX3605 | Voor Tyrode's oplossing |
| NeuroLog System | Digitimer | NL905-229 | Voor ECG-versterker |
| OmapScope5 | MappingLab, United Kingdom | N/A | Calcium-alternans- en aritmie-analyse |
| Ophthalmic scissors | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, United Kingdom | 6970 | De emissielicht splitsen voor het tegelijkertijd detecteren van Ca2+ en Vm |
| Peristalic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | BT100-2J | Om de oplossing te pompen |
| Petri dish | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1899021 | Om het laden met Rhod2AM te verbeteren |
| RH237 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 1971387 | Spanningsgevoelige kleurstof |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, Carlsbad, CA, United States | 1890519 | Calciumindicator |
| Silica gel tube | Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China, | 96402-16 | Aansluiten op de peristaltische pomp |
| Silk suture | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China | 20172650032 | Om de aorta te fixeren |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom | N/A | ECG-gegevens opnemen en analyseren |
| Stimulation electrode | MappingLab, United Kingdom | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | Voor lichtbron |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | Voor lichtbron |
Referenties
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. P....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
