Gebruik van referentiereagentia om de robuustheid van cytokine-afgiftetests te bevestigen voor de voorspelling van de veiligheid van monoklonale antilichamen

Samenvatting

Het gebruik van referentiereagentia voor cytokine-afgifte zorgt voor meer reproduceerbare en gestandaardiseerde in vitro veiligheidsprofielen van immunotherapeutische monoklonale antilichamen. Hier beschrijven we hoe cytokine-afgiftetests kunnen worden gebruikt naast een referentiereagenspanel om de veiligheid van sommige therapeutische monoklonale antilichamen te voorspellen.

Samenvatting

Nieuwe immunostimulerende antilichaamgeneesmiddelen die zijn ontworpen om specifieke immuuncellen direct te stimuleren of indirect de immuunrespons te versterken door een endogene regulator van het immuunsysteem te blokkeren of te activeren, hebben het potentieel om ernstige immuungerelateerde bijwerkingen zoals cytokine release syndrome (CRS) te veroorzaken. Het is daarom van cruciaal belang om het veiligheidsprofiel van dergelijke geneesmiddelen te beoordelen met een combinatie van in vivo en in vitro experimenten vóór de eerste toediening van de dosis bij de mens. Cytokine-afgiftetests (CRA's), waarbij het voorgestelde antilichaamtherapeutisch middel wordt gekweekt samen met menselijke immuuncellen (zoals perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's), volbloed of anderszins) en de hoeveelheid geproduceerd inflammatoir cytokine wordt gemeten, zijn van cruciaal belang voor de identificatie van gevaren. Verschillende laboratoria die verschillende controle-antilichamen gebruiken, kunnen echter een bedreiging vormen voor de harmonisatie van CRA's, en klinisch relevante controles (zoals TGN1412) kunnen moeilijk te vinden zijn, wat kan leiden tot minder nauwkeurige of betrouwbare resultaten of gegevens die moeilijk te vergelijken zijn tussen laboratoria. De opname van positieve en negatieve controles in een ratingbureau kan de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de resultaten waarborgen. Het National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) heeft een panel van gevriesdroogde antilichaamcontroles geproduceerd die bedoeld zijn voor gebruik in verschillende CRA-platforms om de resultaten van verschillende laboratoria en testmethoden te harmoniseren. Een set van drie verschillende positieve controle-antilichamen omvat anti-CD52, anti-CD3 en anti-CD28 superagonist (SA), waarvan bekend is dat ze dosisafhankelijk CRS bij patiënten induceren. Elk antilichaam wordt voorzien van een isotype-gematcht negatief controle-antilichaam. Van dit panel van referentiereagentia is eerder aangetoond dat het een goede reproduceerbaarheid tussen laboratoria heeft en geschikte controles zijn om het vertrouwen en de robuustheid van veiligheidsgegevens van verschillende CRA-platforms te vergroten.

Inleiding

Geïnduceerde afgifte van cytokines kan een verwacht en gewenst effect zijn van sommige immunomodulerende monoklonale antilichamen (mAbs). De onverwachte afgifte van pro-inflammatoire cytokinen kan echter leiden tot cytokine release syndrome (CRS) bij patiënten die worden gekenmerkt door koorts, vermoeidheid en zelfs meervoudig orgaanfalen¹. Het is daarom van cruciaal belang dat nieuwe immunostimulerende mAbs in vitro worden getest op hun potentieel om CRS te veroorzaken door de afgifte van cytokinen te meten in een cytokine release assay (CRA).

TGN1412 is een monoklonaal antilichaam dat is ontwikkeld als een potentiële behandeling voor chronische lymfatische leukemie op B-cellen door op te treden als een CD28-superagonist (CD28SA), die in staat is T-lymfocyten te activeren door de co-stimulerende receptor CD28² te verknopen. In 2006 ondervonden zes gezonde vrijwilligers die TGN1412 kregen toegediend in een klinische studie ernstige bijwerkingen, waaronder CRS, binnen enkele uren na ontvangst van het medicijn¹. Dit leidde ertoe dat de proef werd stopgezet en TGN1412 werd teruggetrokken uit de verdere ontwikkeling. Andere antilichamen waarvan bekend is dat ze CRS als bijwerking veroorzaken, zijn de anti-CD52 mAb, Campath-1H³ en de anti-CD3 mAb, Muromonab (OKT3)⁴. Gezien hun vermogen om dosisafhankelijk CRS bij patiënten te induceren, zijn TGN1412, OKT3 en Campath-1H geschikte positieve controle-antilichamen voor het genereren van robuuste en betrouwbare resultaten van een CRA. Toch waren deze controle-antilichamen voorheen niet gemakkelijk te verkrijgen vanwege de hoge kosten of de beperkte beschikbaarheid.

Een gereviseerd gevriesdroogd referentiepanel van deze drie antilichamen ^5,6,7 naast isotype-gematchte negatieve controles werd echter onlangs beschikbaar gesteld door het National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC). Van dit panel van referentiereagentia is eerder aangetoond dat het een goede reproduceerbaarheid tussen laboratoria^{heeft 8} en is daarom een geschikte controle om het vertrouwen en de robuustheid van veiligheidsgegevens van verschillende CRA-platforms te vergroten. De grondgedachte achter het gebruik van dit protocol naast deze reagentia is dus het verbeteren van de CRA-harmonisatie, met als voordeel dat deze reagentia zijn gevalideerd in een internationale gezamenlijke studie⁸.

Hier beschrijven we hoe dit panel van referentiereagentia het beste kan worden gebruikt in een vaste-fase (SP) PBMC CRA en een waterige fase (AQ) volbloed (WB) CRA om door antilichamen geïnduceerd CRS te voorspellen. Beide CRA-formaten zijn complementair vanwege de wijze van presentatie van antilichamen (indirect voor de vaste fase versus direct voor de waterige fase) en vanwege het feit dat ze zich richten op verschillende groepen respondercellen. Hetzelfde protocol kan worden aangepast voor gebruik met verdund volbloed (dWB) of met endotheel: PBMC-coculturen.

Protocol

Het volgende protocol volgt de richtlijnen van de NIBSC-commissie voor onderzoeksethiek. Verkrijg in overeenstemming met de toepasselijke regelgeving en richtlijnen schriftelijke geïnformeerde toestemming van een gezonde donor of patiënten. Gebruik steriele technieken om alle voorbereidende stappen van het protocol uit te voeren in een laminaire flow-celkweekkap. Zie Materiaaltabel voor details over alle reagentia en apparatuur.

1. Voorbereiding van gecoate platen met mAb voor vastefase-assay (SP)

1. Reconstitueer de inhoud van de referentiereagensampullen met 1 ml steriel gedestilleerd water. Wacht 5-10 minuten voor rehydratatie voordat u de antilichaamoplossing mengt en overbrengt naar een steriel afgesloten buisje.
2. Na reconstitutie in 1 ml water zal de voorraadconcentratie van de volgende recombinante antilichamen 200 μg/ml zijn: anti-CD3 (15/162), anti-CD52 (15/178), IgG1K isotype controle (15/198) voor anti-CD52, IgG2a isotype controle (15/218) voor anti CD3, IgG4 isotype controle (15/232) voor anti-CD28SA.
3. Na reconstitutie in 1 ml water zal de voorraadconcentratie van anti-CD28SA (15/144) 100 μg/ml bedragen. Voor kortstondige opslag tot 7 dagen wordt het gereconstitueerde materiaal in een steriel buisje met dop overgebracht naar 4 °C.
4. Verdun de gereconstitueerde antilichamen en testantilichamen tot 10 μg/ml in steriel PBS en smeer de putjes van een steriele, niet met TC behandelde U-bodem polypropyleen microtiterplaat met 96 putjes in met 100 μl verdunde antilichaamoplossing (1 μg/putje) en incubeer een nacht bij 4 °C.
   OPMERKING: Het is belangrijk om polypropyleen platen te gebruiken voor eiwitadsorptie, want deze werden gebruikt bij de validatie van de standaard reagentia⁹.

2. Voorbereiding van PBMC's

1. Verzamel minimaal 30 ml perifeer volbloed (WB) in gehepariniseerde/heparinehoudende buisjes en keer dit meerdere keren om om een goede menging met de natriumheparine te garanderen.
2. Breng 15 ml WB over in een aparte buis om later te gebruiken bij de bereiding van de volbloedtest in de waterfase (stap 3.1)
3. Verdun de resterende 15 ml bloed in een volumeverhouding van 1:1 met PBS of serumvrije RPMI-1640-media en breng het verdunde bloed voorzichtig aan over de bovenkant van 15 ml dichtheidsgradiëntmedium (bijv. lymfoprep, ficoll-hypaque) in een tube van 50 ml.
4. Centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een uitzwenkbare rotor zonder rem en met een verminderde versnelling om het bloed in zijn verschillende componenten te scheiden.
5. Na centrifugatie zal de dichtheidsgradiënt zich scheiden als een bovenste laag plasma, gevolgd door een dunne laag buffy-laag met PBMC's en een onderste laag met rode bloedcellen (RBC's) en polymorfonucleaire granulocyten, waaronder neutrofielen en eosinofielen. Oogst de PBMC's voorzichtig door een pipet rechtstreeks door de bovenste plasmalaag naar de PBMC's te brengen. U kunt ook de bovenste laag verwijderen voordat u cellen verzamelt.
6. Resuspendeer de buffy-vacht voorzichtig in 10 ml PBS of serumvrije RPMI-1640-media. Centrifugeer de buis opnieuw op 500 x g gedurende 10 minuten om de cellen te pelleteren. Verwijder het bovenstaande en gooi het weg.
7. Herhaal wasstap 2.6. en suspendeer pellet in 2 ml RPMI met 10% FCS (volledige RPMI-1640, cRPMI)
8. Tel cellen met behulp van een hemocytometer¹⁰.
9. Pas PBMC's aan op een concentratie van 1 x 10⁶ cellen/ml in cRPMI.

3. Bereiding van een test voor de afgifte van cytokines in volle fase (AQ) in volle bloed (WB)

1. Voeg 190 μL WB toe aan de putjes van een polystyreenplaat met 96 putjes in U-bodem. Als dit nog niet 100 μg/ml is, verdun dan alle behandelingsantilichamen en referentiereagentia tot 100 μg/ml in PBS.
2. Voeg 10 μL verdunde antilichamen toe aan 190 μL WB om een uiteindelijke antilichaamconcentratie van 5 μg/ml antilichaam in 95% WB te verkrijgen.
3. Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C.

4. Bereiding van vaste fase (SP) PBMC-cytokine-afgiftetest

1. Verwijder met een meerkanaalspipet de antilichaamoplossing en gooi deze weg van de gecoate platen (beschreven in stap 1), vul een reagensreservoir met PBS en spoel de plaat 3x met 200 μL PBS om ongebonden mAbs te verwijderen.
2. Voeg 200 μL van de celsuspensie uit stap 2.8 toe aan elk putje. Incubeer de plaat gedurende 48 uur in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C, 5% CO₂ .

5. Verzameling van supernatans of plasma

1. Na een incubatie van 48 uur met controle- en testmAbs, centrifugeert u de platen gedurende 5 minuten bij 400 x g en verzamelt u het celgeconditioneerde medium of plasma, waarbij u ervoor zorgt dat de celpellet niet wordt verstoord. Vries het verzamelde bovenstaande of plasma in bij -20 °C.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u de rode bloedcelpellet niet verstoort bij het verzamelen van het plasma.

6. Kwantificering van cytokinen in het bovenstaande of plasma

1. Voer met behulp van het verzamelde supernatans of plasma cytokineanalyse uit van IFN-γ-, IL-2-, TNF-α- en IL-6-concentraties met behulp van de voorkeursmultiplexoptie. Een voorbeeldmethode voor multiplex cytokine-analyse met behulp van een cytometrische kralentest is eerder gepubliceerd¹¹.
   NOTITIE: Raadpleeg de materiaaltabel voor de multiplexkit die is gebruikt bij het genereren van de representatieve resultaten.

Resultaten

De resultaten van de SP-test moeten aantonen dat IL-2, IFN-γ, IL-6 en^{TNF-α 12} na 48 uur vrijkomen in het pg/ml-bereik van alle positieve controle-antilichamen en moeten statistisch significant groter zijn dan gematchte isotypecontroles. Onze representatieve resultaten tonen aan dat de positieve controle-antilichamen, αCD28, αCD3 en αCD28SA, significant hoge niveaus van IFN-γ, IL-6 en TNF-α induceren in vergelijking met gematchte isotypecontroles, wanneer ze worden uitgevoerd in de PBMC SP-assay (Figuur 1). Deze test wordt ook gekenmerkt door een hoge vouwverandering van IL-2-afgifte door stimulatie met αCD28SA in vergelijking met het gematchte isotype (859.0). Terwijl αCD3 en αCD52, hoewel ze nog steeds IL-2-expressie induceren, resulteren in lagere vouwveranderingen dan αCD28SA (6,2 en 3,3 voor respectievelijk αCD3 en αCD52, figuur 2).

In de WB AQ-test (Figuur 3) is het niveau van detecteerbare cytokinen merkbaar lager dan in de PBMC SP-assay, maar wordt gekenmerkt door een grotere gevoeligheid voor stimulatie door αCD52-antilichaam (Figuur 2 en Figuur 3) met gemiddelde vouwveranderingen van IL-2, IFN-γ en IL-6 boven 100.

Een testantilichaam waarvan kan worden verwacht dat toekomstige eerste toediening bij mensen geen onverwachte significante toename van de afgifte van cytokines zal veroorzaken in vergelijking met relevante isotypecontroles. Hoewel, in plaats van de ontwikkeling van een nieuwe therapeutische mAb te stoppen, een positief resultaat in een CRA moet worden overwogen als onderdeel van het risico-batenbeheer¹³. Bij de ontwikkeling van een nieuw CRA-platform moet de test worden herhaald met een andere set donoren om de reproduceerbaarheid van het platform te waarborgen. Er moet ook belang worden gehecht aan het verklaren van de variabiliteit van de respons tussen donoren¹⁴, en daarom wordt een goed uitgevoerd experiment aanbevolen¹⁵. Om de breedte van de responsen te begrijpen en een volledige weergave te krijgen van de variabiliteit die kan worden waargenomen in donorresponsen, zou de test idealiter moeten worden uitgevoerd met meerdere individuele donoren, naast het testen van het geneesmiddel in replicatie-experimenten.

Figuur 1: Cytokine-afgifte van PBMC-SP-experiment. Representatieve resultaten van IFN-γ, IL-2, IL-6 en TNF-α afgifte verkregen uit PBMC-SP-cytokine-afgiftetests (3 onafhankelijke experimenten met elk 5-8 donoren per experiment; n=8, n=10, n=5 [van boven naar beneden]) na 48 uur bij gebruik van referentiereagensantilichamen. Afkortingen: PBMC = perifere mononucleaire bloedcellen; SP = vaste fase; IFN-γ = interferon-gamma; IL-2 = interleukine 2; IL-6 = interleukine 6; TNF-α = tumornecrosefactor alfa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Toename van de verandering van de cytokinevouw door PBMC-SP- en WB-AQ-experimenten. Vouwverandering van IFN-γ, IL-2, IL-6 en TNF-α afgifte van CRS-inducerende antilichaamreferentiereagentia ten opzichte van hun gematchte isotypecontroles, verkregen uit PBMC-SP en WB-AQ cytokine-afgiftetests na 48 uur. Afkortingen: PBMC = perifere mononucleaire bloedcellen; SP = vaste fase; WB = volbloed; AQ = waterig (fase); IFN-γ = interferon-gamma; IL-2 = interleukine 2; IL-6 = interleukine 6; TNF-α = tumornecrosefactor alfa; CRS = cytokine release syndroom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Cytokine-afgifte van WB-AQ-experiment. Representatieve resultaten van IFN-γ-, IL-2-, IL-6- en TNF-α-afgifte verkregen uit WB-AQ-cytokine-afgiftetests (3 onafhankelijke experimenten met elk 5-8 donoren per experiment; n=8, n=10, n=5 [van boven naar beneden]) na 48 uur bij gebruik van referentiereagensantilichamen. Afkortingen: WB = volbloed; AQ = waterig (fase); IFN-γ = interferon-gamma; IL-2 = interleukine 2; IL-6 = interleukine 6; TNF-α = tumornecrosefactor alfa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Hier worden methoden beschreven voor het meten van de cytokine-afgifte van PBMC's en WB na antilichaam-gemedieerde stimulatie van een met antilichaam beklede plaat of met antilichaam in oplossing, met behulp van een panel van referentiereagentia voor positieve en negatieve controles. Elk van deze tests heeft zijn eigen sterke en zwakke punten. PBMC- en WB-assays zijn complementair omdat het aandeel van verschillende immuuncellen zoals lymfocyten, monocyten en granulocyten verschillend is in de twee experimentele matrices die voor CRA's worden gebruikt. Het is interessant om op te merken dat, hoewel een WB-test de in vivo conditie beter zou kunnen weergeven in tegenstelling tot PBMC-monocultuur, het eerste platform minder voorspellend is voor T-celgemedieerd CRS-risico van TGN1412 en OKT3¹⁵; een gevolg van glycofor A op RBC's die IL-2-gemedieerde T-celexpansie remmen¹⁶. Desalniettemin blijft de voorspelling van het CRS-risico van anti-CD52 intact in WB CRA, dankzij de aanwezigheid van neutrofielen (verloren gegaan tijdens conventionele dichtheidsgradiëntmethoden beschreven in stap 2, gebruikt voor PBMC-isolatie).

Het formaat van de CRA (SP- of AQ-presentatie) is van cruciaal belang voor de detectie van een specifiek mechanisme van CRS. Bijvoorbeeld, presentatie in de waterfase van de mAb aan menselijke lymfocyten^17,18, gebruikt tijdens preklinische in vitro veiligheidstests van TGN1412 kon het CRS-risico niet identificeren, waarschijnlijk als gevolg van een gebrek aan gelokaliseerde celreceptorclustering en -betrokkenheid¹⁹ en de daaruit voortvloeiende T-celactivering gemedieerd door antilichaam in de waterige fase. In feite kon TGN1412-gemedieerde CRS alleen nauwkeurig worden gedetecteerd in SP-formaat dat Fc-gammareceptor (FcγR) cross-linking kunstmatig repliceert, zoals hier gepresenteerd, of door contactafhankelijke priming in PBMC-precultuur bij hoge dichtheid en Fc-interactie met CD32+ immuuncellen (zoals B-cellen²⁰ en monocyten²¹).

Naast deze platforms zijn er andere manieren om CRA uit te voeren met complexere co-cultuursystemen. Een voorbeeld van een alternatief CRA voor de CRA die in deze methoden worden beschreven, is het co-kweken van PBMC's met autologe endotheelcellen uit bloed (BOEC's)²². Deze test werd in 2015 beschreven als een verbetering van de toenmalige conventionele HUVEC:PBMC-test met gemengde donoren door de verstorende weefselmismatch te verwijderen. Het vertoont een betere gevoeligheid voor anti-CD28SA CRS dan de WB-test, en overwint ook de beperking van de PBMC-monocultuurtest door de combinatie van endotheelcellen en leukocyten die in vivo aanwezig zijn na te bootsen, maar ten koste van langere procedurele stappen die gespecialiseerde celkweektechnieken vereisen²².

Bovendien, hoewel dit protocol zich specifiek richt op de afgifte van IFN-γ, IL-2, IL-6 en TNF-α, hebben collega's bij MHRA eerder gekeken naar IL-12 en anderen in deze setting²³. De productie van IL-12 wordt verhoogd door deze positieve controle CRS-antilichamen, hoewel het niet bijzonder gevoelig is, en daarom misschien geen goede voorspeller van CRS in deze modaliteit. Sommige cytokinen, zoals IL-15, zijn nooit getest, hoewel de 4 cytokinen die in ons protocol zijn geëvalueerd, een goede indicatie geven van het mogelijke risico op CRS. Natuurlijk kunnen, afhankelijk van de modaliteit en geteste antilichamen, andere cytokines worden beoordeeld.

Gecombineerd benadrukken deze observaties het belang van de opmerking dat, hoewel het gebruik van referentiereagentia kan helpen om het CRS-risico van nieuwe antilichamen te identificeren, ervoor moet worden gezorgd dat een suboptimaal CRA-platform wordt vermeden dat mogelijk geen CRS-potentieel identificeert. Cruciaal is dat het voorspelde werkingsmechanisme van een therapeutisch middel, hetzij via het Fc-gebied of via de veronderstelde werking op cellen die antigeenexpressie tot expressie brengen, moet overeenkomen met de biologie van de test. Hoewel de verschillen in het werkingsmechanisme van de testtherapeutische en referentiereagentia die in dit artikel worden besproken, een potentiële beperking kunnen vormen op een zodanige manier dat een relevant CRA voor het testantilichaam onverenigbaar zou kunnen zijn met de biologie van de referentiereagentia, biedt de test een robuust, betrouwbaar platform voor gevarenidentificatie. Resultaten van verschillende CRA-formaten die verschillende werkingsmechanismen en subsets van immuuncellen bestrijken, kunnen echter nodig zijn voor een optimaal vertrouwen in de veiligheidsevaluatiegegevens.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 ml  Microcentrifuge Tubes, Natural (Sterile)	Starlab	S1615-5510
Fetaal bovien serum, gekwalificeerd, hitte geïnactiveerd	ThermoFisher	10500064
Heparinized tubes	ThermoFisher	12967676
Heracell 150i CO2 Incubator	ThermoFisher	16406639
MESO QuickPlex SQ 120 Human Proinflammatory Panel 1 V-PLEX kit	Meso Scale Discovery	K15049
MESO QuickPlex SQ 120MM	Meso Scale Discovery	AI1AA-0
Neubauer Improved Haemocytometer Counting Chamber	Hawksley	AS1000
Panel van gelyofiliseerd recombinante antilichaam controles voor Cytokine Release Assays	NISBC	19/156
PBS	ThermoFisher	10010023
Polypropyleen 96-well microtiter plate	Corning	3879
Polystyreen 96-well microtiter plate	Corning	3799
RPMI 1640	ThermoFisher	11875093
Sorvall ST 40 Centrifuge	ThermoFisher	75004525
Steriele water	ThermoFisher	15230162