Method Article

Optimalisatie van de Epimedii Folium Mutton-Oil Processing Technology en het testen van het effect ervan op de embryonale ontwikkeling van zebravissen

DOI:

10.3791/65096

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werd de schapenolieverwerkingstechnologie van Epimedii folium (EF) geoptimaliseerd door een Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie toe te passen, en het effect van ruwe en geoptimaliseerde watergeëxtraheerde EF op de embryonale ontwikkeling van zebravissen werd voorlopig onderzocht.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als een traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft Epimedii folium (EF) een geschiedenis in geneeskunde en voedsel die > 2.000 jaar oud is. Klinisch wordt EF verwerkt met schapenolie vaak gebruikt als geneesmiddel. In de afgelopen jaren zijn de meldingen van veiligheidsrisico's en bijwerkingen van producten die EF als grondstof gebruiken geleidelijk toegenomen. Verwerking kan de veiligheid van TCM effectief verbeteren. Volgens de TCM-theorie kan de verwerking van schapenolie de toxiciteit van EF verminderen en het tonificerende effect op de nieren versterken. Er is echter een gebrek aan systematisch onderzoek en evaluatie van EF-technologie voor de verwerking van schapenolie. In deze studie gebruikten we de Box-Behnken experimentele ontwerp-respons oppervlaktemethodologie om de belangrijkste parameters van de verwerkingstechnologie te optimaliseren door de inhoud van meerdere componenten te beoordelen. De resultaten toonden aan dat de optimale verwerking van schapenolie van EF als volgt was: de schapenolie verwarmen bij 120 °C ± 10 °C, de ruwe EF toevoegen, voorzichtig roerbakken tot 189 °C ± 10 °C totdat deze gelijkmatig glanzend is, en vervolgens verwijderen en afkoelen. Voor elke 100 kg EF moet 15 kg schapenolie worden gebruikt. De toxiciteiten en teratogeniciteiten van een waterig extract van ruwe en schapenolie verwerkte EF werden vergeleken in een zebravisembryo-ontwikkelingsmodel. De resultaten toonden aan dat de ruwe kruidengroep meer kans had om zebravismisvormingen te veroorzaken en dat de half-maximale dodelijke EF-concentratie lager was. Kortom, de geoptimaliseerde schapenolieverwerkingstechnologie was stabiel en betrouwbaar, met een goede herhaalbaarheid. Bij een bepaalde dosis was het waterige extract van EF giftig voor de ontwikkeling van zebravisembryo's en de toxiciteit was sterker voor het ruwe medicijn dan voor het verwerkte medicijn. De resultaten toonden aan dat de verwerking van schapenolie de toxiciteit van ruwe EF verminderde. Deze bevindingen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit, uniformiteit en klinische veiligheid van met schapenolie verwerkte EF te verbeteren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epimedii folium (EF) is het gedroogde blad van Epimedium brevicornu Maxim., Epimedium sagittatum (Sieb. et Zucc.) Maxim., Epimedium pubescens Maxim., of Epimedium koreanum Nakai. EF kan worden gebruikt voor de behandeling van osteoporose, menopauzale syndroom, borstknobbels, hypertensie, coronaire hartziekten en andere ziekten1. Als traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft EF een geschiedenis in geneeskunde en voedsel van meer dan 2.000 jaar. Vanwege de lage prijs en het opmerkelijke effect van tonificatie van de nieren, wordt het veel gebruikt in medicijnen en gezonde voedingsmiddelen. EF wordt verwerkt door het te roerbakken met schapenolie, een proces dat voor het eerst werd beschreven in Lei Gong Processing Theory geschreven door Lei Xiao in de Liu Song-periode2. De werkzaamheid van ruwe EF en roergebakken EF is heel verschillend. Ruwe EF verdrijft voornamelijk reuma, terwijl de gewokte EF de nieren verwarmt om yang3 te versterken. Op dit moment wordt EF veel gebruikt als grondstof in geneesmiddelen en gezonde voedingsmiddelen; er zijn 399 beursgenoteerde Chinese patentgeneesmiddelen, negen geïmporteerde gezondheidsvoedingsmiddelen en 455 binnenlandse gezondheidsvoedingsmiddelen met EF als grondstof4. Dit medicinale materiaal heeft geweldige toepassingsperspectieven. In de afgelopen jaren zijn er echter steeds meer meldingen geweest van bijwerkingen en menselijke leverbeschadiging veroorzaakt door gezondheidsvoeding en Chinese patentgeneesmiddelen die EF als grondstof gebruiken, en gerelateerde toxiciteitsstudies 5,6,7 hebben gemeld dat EF als grondstof potentiële veiligheidsrisico's met zich meebrengt.

Chinese medicinale verwerking verwijst naar farmaceutische technieken die de toxiciteit effectief kunnen verminderen of elimineren en de veiligheid van TCM's kunnen verbeteren. De traditionele verwerkingsmethode van EF is roerbakken met schapenolie, wat de toxiciteit van EF vermindert en het effect ervan op het verwarmen van de nieren en het bevorderen van yang8 versterkt. Deze verwerkingsmethode is opgenomen in de Chinese Farmacopee en verschillende verwerkingsspecificaties1. Het proces van EF wordt alleen als volgt gespecificeerd: voor elke 100 kg EF wordt 20 kg vruchtwaterolie (geraffineerd) toegevoegd en het wordt mild gebakken tot uniform en glanzend1. Er zijn geen strikte EF-verwerkingsmethodeparameters in de bovenstaande normen, dus lokale verwerkingsspecificaties zijn niet geharmoniseerd om consistentie te bieden. Daarom zou het nuttig zijn om een systematische studie van het EF-proces uit te voeren. In dit artikel werd de Box-Behnken experimentele design-response oppervlaktemethode gebruikt om de verwerkingstechnologie van EF te optimaliseren.

Het experimentele ontwerp van Box-Behnken is een methode die meestal wordt gebruikt om de factoren in een proces te optimaliseren. De extractieparameters kunnen worden geoptimaliseerd door de functionele relatie tussen meerdere regressievergelijkingsaanpassingsfactoren en effectwaarden vast te stellen. Onlangs is deze methode op grote schaal gebruikt om TCM-extractie 5,6,7 en verwerking9,10,11 te bestuderen. Verschillende studies hebben TCM-bereidingsmethoden gemeld met betrekking tot zoutverwerking, wijnverwerking en roerbakken volgens een Box-Behnken-ontwerp, zoals voor met zout verwerkte Psoraleae fructus 12, wijnverwerkte Cnidii fructus13 en geroosterde Cinnamomi ramulus14. Deze methode heeft een kortere testtijd, een hoge testnauwkeurigheid en is geschikt voor multi-factor en multi-level tests. De methode is eenvoudiger dan de orthogonale ontwerptestmethode en uitgebreider dan de uniforme ontwerpmethode15. De verkregen relaties kunnen de voorspelde waarde van elk testpunt binnen het testbereik bepalen, wat een groot voordeel is. Een zebravismodel kan worden gebruikt om te testen of EF na verwerking minder giftig is.

In TCM-toxiciteitsstudies heeft het zebravismodel de dubbele voordelen van de hoge doorvoer van celexperimenten en de overeenkomsten met knaagdierexperimenten16. Dit model wordt gekenmerkt door zijn kleine formaat, hoge paaisnelheid, korte reproductiecyclus en gemak van fokken. Het model kan worden gebruikt in grootschalige synchrone experimenten in celkweekplaten, en de experimentele medicijndosering is klein, de experimentele cyclus is kort, de kosten zijn laag en het hele experimentele proces is gemakkelijk te observeren en te bedienen17. Zebravisembryo's zijn transparant en ontwikkelen zich snel. Daarom kunnen de toxiciteit en teratogene effecten van geneesmiddelen op viscerale weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia direct worden waargenomen onder een microscoop18. De gen-homologie tussen zebravissen en mensen is zo hoog als 85%18. De signaaltransductieroute van zebravissen is vergelijkbaar met die van mensen18. De biologische structuur en fysiologische functie van zebravissen lijken sterk op die van zoogdieren18. Daarom kan een zebravismodel voor drugstests proefdieren bieden die betrouwbaar en volledig toepasbaar zijn op mensen19.

In deze studie gebruikten we de Box-Behnken design-response oppervlaktemethodologie om de hoeveelheid en temperatuur van schapenolie en de frituurtemperatuur die wordt gebruikt in de EF-verwerkingstechnologie te optimaliseren, met de inhoud van icariin, epimedin A, epimedin B, epimedin C en baohuoside I als de evaluatie-indexen. Het zebravismodel werd gebruikt om het effect van een EF-waterextract op de embryonale ontwikkeling van zebravissen voor en na de verwerking te onderzoeken om het verzwakkingseffect van verwerking op EF te evalueren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle diergerelateerde experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring van de Experiment Ethics Committee van het Chongqing Institute of TCM (proefdierethiek review certificaatnummer: ZJS2022-03).

1. Bepaling van de bioactieve bestanddelen

OPMERKING: De soort die in dit onderzoek werd gebruikt was Epimedium sagittatum en de monsters werden verzameld in Fengdu County, Chongqing. Het monster werd geïdentificeerd als een droog bovengronds deel van E. sagittatum (Sieb. et Zucc.) Spreuk. door onderzoekers van The Institute of Biological Medicine, Chongqing Institute of Traditional Chinese Medicine.

  1. Bereid de oplossing van het controleproduct door de juiste hoeveelheid van elke referentiestof, namelijk icariïne, epimedine A (EA), epimedine B (EB), epimedine C (EC) en baohuoside I (BI), nauwkeurig af te wegen met behulp van een elektronische analytische balans, en los op in methanol. Bereid hiermee een gemengde referentie-stamoplossing met 381,61 μg/ml icariïne, 124,14 μg/ml EA, 110,24 μg/ml EB, 1091,75 μg/ml EC en 184,98 μg/ml BI.
  2. Bereid de oplossing van het testproduct door EF door een zeef nr. 3 te pletten. Plaats ongeveer 0,2 g (met behulp van een elektronische analytische balans) gemalen EF in een erlenmeyer met stop, voeg 20 ml verdunde ethanol toe en ultrasoon met een vermogen van 400 W en een frequentie van 50 kHz gedurende 1 uur. Schud goed en ga door een membraanfilter van 0,22 μm om de testoplossing te verkrijgen.
  3. Voer de chromatografie als volgt uit. Gebruik high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) met een C18-kolom met afmetingen van 4,6 mm x 250 mm en een binnendiameter van 5 μm. Gebruik acetonitril als mobiele fase A en ultrapuur water als mobiele fase B. Gebruik de volgende gradiëntrelutieparameters: 0-30 min, 24% A tot 26% A; 30-31 min, 26% A tot 45% A; 31-45 min, 45% A tot 47% A. Gebruik een detectiegolflengte van 220 nm (voor de gebruikte detector, zie Materiaaltabel). Houd de kolomtemperatuur op 30 °C en de stroomsnelheid op 1,0 ml/min en gebruik een monstergrootte van 10 μl.
  4. Om de lineaire relatie te onderzoeken, gebruikt u de gemengde referentieoplossing zoals in stap 1.1 verdund 2 keer, 4 keer, 8 keer, 16 keer en 32 keer, voor respectievelijk icariin, EA, EB, EC en BI. Gebruik acetonitril als mobiele fase A en ultrapuur water als mobiele fase B.
  5. Gebruik de volgende gradiëntrelutieparameters: 0-30 min, 24% A tot 26% A; 30-31 min, 26% A tot 45% A; 31-45 min, 45% A tot 47% A. Gebruik een detectiegolflengte van 220 nm (voor de gebruikte detector, zie Materiaaltabel). Houd de kolomtemperatuur op 30 °C en de stroomsnelheid op 1,0 ml/min en gebruik een monstergrootte van 10 μl. Noteer ten slotte de piekgebieden. Plot de lineaire regressie met de referentieconcentratie (x-as, μg/ml) als abscis en het piekoppervlak (y-as) als ordinaat met behulp van professionele software (zie Materiaaltabel).
  6. Voer de precisietest uit door de gemengde regeloplossing zes keer achtereen te meten met HPLC met behulp van de chromatografische omstandigheden die worden weergegeven in stap 1.3. Noteer de detectietijd en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de relatieve standaardafwijkingen (RSD) van de piekgebieden om de precisie (reproduceerbaarheid) te beoordelen met behulp van de onderstaande formule:
    RSD% = standaardafwijking (SD)/rekenkundig gemiddelde van de berekende resultaten (X) x 100 %
  7. Om de reproduceerbaarheidstest uit te voeren, weegt u het EF-poeder nauwkeurig en bereidt u zes delen van de testproductoplossing parallel volgens de methode in stap 1.2. Onderwerp de bereide oplossingen aan HPLC onder de chromatografische omstandigheden in stap 1.3. Noteer de retentietijden en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de hoeveelheden van elke verbinding op basis van een standaardcurve (piekgebieden versus concentraties). Bereken de RSD% zoals hierboven.
  8. Bewaar de testoplossingen bij kamertemperatuur en meet de inhoud ervan volgens de in stap 1.3 beschreven HPLC-methode om 0 uur, 2 uur, 4 uur, 8 uur, 12 uur en 24 uur na bereiding de stabiliteit te beoordelen. Noteer de retentietijden en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de RSD% van de piekgebieden zoals hierboven.
  9. Om de monsterterugwinningstest uit te voeren, weegt u 0,2 g EF-poeder in een erlenmeyer met stop gedurende zes replicaties. Voeg een passende hoeveelheid van de referentieoplossing toe (de hoeveelheid referentiestof die aan het monster wordt toegevoegd, is gelijk aan 100% van de bekende inhoud van het monster) en bereid de testoplossing volgens de in stap 1.2 beschreven methode.
  10. Injecteer de monsters in de chromatograaf en analyseer volgens de chromatografische omstandigheden in stap 1.3. Noteer de piekgebieden en bereken de gemiddelde herstel- en RSD%-waarden zoals hieronder:
    Spiked sample recovery rate = (spiked sample content − sample content)/sample amount x 100%

2. Optimalisatie van de EF-technologie voor de verwerking van schapenolie met behulp van de Box-Behnken design-response oppervlaktemethodologie

  1. Selecteer de belangrijkste parameters in EF-verwerking, zoals de hoeveelheid schapenolie (A; 15%-35%), de schapenolietemperatuur (B; 50-120 °C) en de frituurtemperatuur (C; 80-300 °C), als invloedrijke factoren. Gebruik de uitgebreide scores van icariin-, EA-, EB-, EC- en BI-inhoud als evaluatie-indexen. Het percentage schapenolie is hier het massapercentage.
  2. Gebruik de responsoppervlakanalysesoftware (zie materiaaltabel) om de Box-Behnken-responsoppervlakexperimenten te ontwerpen, het kwadratische responsoppervlak te verkennen en een tweede-orde polynomiaal model te construeren. Selecteer het nieuwe Box-Behnken-ontwerp en stel de optie Numerieke factoren in op 3; stel de factoren A, B en C in. Klik op Doorgaan. Stel de optie Reacties in op 1 (wat de uitgebreide score was). Klik op Doorgaan om het ontwerp te voltooien. In totaal waren 17 experimenten gepland (zie tabel 1).
    OPMERKING: Voor de onafhankelijke en afhankelijke variabelen, samen met hun lage, middelste en hoge niveaus, zie tabel 2.
  3. Verwerk de EF volgens de specifieke parameters in tabel 1; weeg bijvoorbeeld voor order nummer 1 geraffineerde schapenolie af als 15% v/v en verwarm vervolgens tot 50 °C om het te smelten. Voeg de ruwe EF toe aan het gesmolten schapenvlees, roerbak boven een zacht vuur (190 °C) tot het gelijkmatig glanzend is en verwijder en laat afkoelen. 17 experimentele operaties uitgevoerd. In dit werk werden in totaal 17 groepen EF-verwerkte producten verkregen.
    OPMERKING: Schapenolie is vast bij kamertemperatuur (25 °C) en smelt bij verhitting tot vloeistof. Schapenolie in vloeibare toestand kan worden gebruikt als hulpstof.
  4. Bereid de testoplossingen van de verwerkte producten volgens de in stap 1.2 beschreven methode. Analyseer ze vervolgens met HPLC volgens de chromatografische omstandigheden beschreven in stap 1.3. Noteer de retentietijden en piekgebieden van elke chemische samenstelling en bereken de inhoud van de icariin, EA, EB, EC en BI in elke testoplossing tegen een externe standaardcurve. Gebruik de uitgebreide scoreberekeningsformule hieronder om de uitgebreide scores van de 17 experimentele groepen te berekenen:
    Uitgebreide score = Z/Z max × 0,5 + BI/BImax × 0,5
    waarbij Z de som is van de icariin-, EA-, EB- en EC-inhoud; Zmax is de maximale waarde van de som van de icariin-, EA-, EB- en EC-gehalten in de 17 experimentele groepen; BI is de BI-inhoud; en BImax is de maximale waarde van de BI-inhoud in de 17 experimentele groepen.
  5. Importeer de uitgebreide scoreresultaten voor de 17 groepen experimenten in de data-analysesoftware (zie Materiaaltabel) om de experimentele gegevens te analyseren. Selecteer onder de evaluatie-items de kwadratische procesvolgordeoptie en de polynomiale modeltypeoptie.

3. Testen van het effect van verwerking op de embryonale ontwikkeling van zebravissen

  1. Monstervoorbereiding
    1. Plet de ruwe en verwerkte EF door een zeef nr. 3 (zie materiaaltabel). Voeg aan 100 g van elk EF-monster 1.000 ml ultrapuur water toe. Week de EF gedurende 0,5 uur, kook het water twee keer gedurende 30 minuten elk en filtreer vervolgens met filtreerpapier.
    2. Combineer de filtraten en concentreer het monster door verhitting. Voeg ultrapuur water toe aan een eindvolume van 100 ml om de verwerkte EF (PEF, 1 g/ml) en de ruwe EF (CEF,1 g/ml) stamoplossingen te verkrijgen. Meet de hoeveelheid ruw geneesmiddel in elke stockoplossing.
    3. Plaats aliquots van 1 ml, 1,5 ml, 2,5 ml, 5 ml en 7,5 ml stamoplossingen in maatkolven van 10 ml en voeg vervolgens ultrapuur water toe aan het volume om de testoplossingen te bereiden met concentraties van 100 mg / ml, 150 mg / ml, 200 mg / ml, 250 mg / ml, 500 mg / ml en 750 mg / ml voor het onderzoek naar embryotoxiciteit van zebravissen.
      OPMERKING: De concentraties van de testoplossingen werden bereid door te verwijzen naar de relevante literatuur 20,21 en door voorbereidende experimenten uit te voeren om de10-voudige concentratiegradiënt te geven die in de normale toxicologie wordt gebruikt. CEF was een onbewerkt monster en PEF was een monster dat was bereid met de beste verwerkingstechnologie zoals beschreven in punt 2.
  2. Zebravishouderij en embryobehandeling21
    1. Pas wilde zebravissen (zie materiaaltabel) gedurende 2 dagen aan bij een gecontroleerde temperatuur, houd ze in een doorstroomaquarium met een pH van 7,0-7,4 en voer ze twee keer per dag.
      OPMERKING: De remming van melaninevorming bij zebravissen werd bereikt door 1-fenyl-2-thioureum in een concentratie van 0,003% (massa/volume) toe te voegen aan het kweekmedium, dat hun lichaam transparant hield voor morfologische observatie.
    2. Selecteer 's avonds volwassen vruchtbare zebravissen van het wilde type en scheid ze door schotten in paringsdozen te gebruiken. Verwijder de schotten de volgende ochtend en laat de vis 30 minuten paaien. Verzamelde de bevruchte eieren met een druppelaar om de 15 minuten. In totaal werden 520 gezonde wild-type embryo's verzameld. Bewaar de zebravisembryo's gedurende 24 uur in een broedmachine bij 28,5 °C.
    3. Wijs de gezonde embryo's willekeurig toe op 24 uur na de bevruchting (hpf) aan 13 groepen en week samen met één controlegroep afzonderlijk 10 ml van elk van de volgende oplossingen in een kweekschaal: PEF: 100 μg / ml, 150 μg / ml, 200 μg / ml, 250 μg / ml, 500 μg / ml, 750 μg / ml; CEF: 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml. Behandel de lege controlegroep met het medium als oplossing. Elke groep bevatte 40 embryo's in deze studie.
      OPMERKING: De mediumsamenstelling is 0,15 M NaCl, 5 mM KCl, 0,25 mM Na 2 HPO 4, 0,45 mM KH 2 PO 4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO 4 en 4 mM NaHCO3.
    4. Kweek de zebravis in een incubator met constante temperatuur voor maximaal 120 pk. Tel elke dag het aantal dode larven, observeer de belangrijkste orgaanmorfologie van de larven in elke experimentele groep onder een stereomicroscoop (schaalbalk = 500 μm, zie Materiaaltabel) en bereken de halfdoodconcentratie (LC50) van zebravissen bij 72 hpf met behulp van data-analysesoftware (zie Materiaaltabel).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resultaten methodologisch onderzoek
Er werd een lineair verband waargenomen tussen de concentratie van icariin, EA, EB, EC, BI en chromatografische piekgebieden (zie tabel 3). De RSD%-waarden (n = 6) van de chromatografische piekgebieden van icariin, EA, EB, EC en BI waren respectievelijk 0,28%, 1,22%, 0,65%, 1,67% en 1,06%, wat aangeeft dat de precisie van de HPLC-metingen goed was. De RSD%-waarden (n = 6) van de inhoud van icariin, EA, EB, EC en BI waren respectievelijk 1,59%, 1,46%...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onafhankelijke variabelen en de bepaling van hun niveaus
De EF-verwerkingstechnologie wordt alleen beschreven in de 2020-editie van de Chinese Farmacopee en de lokale Chinese medicijnverwerkingsspecificaties die zijn gepubliceerd door 26 provincies, gemeenten en autonome regio's in het hele land1. De beschrijving omvat de volgende stappen: schapenolie nemen en verwarmen om te smelten, EF-snippers toevoegen, roerbakken met een langzaam vuur tot het uniform en glanzend is, het er...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door het Basic Scientific Research Business Project van de Chongqing Academy of Traditional Chinese Medicine (projectnummer: jbky20200013), het Performance Incentive Guidance Project van Chongqing Scientific Research Institutions (projectnummer: cstc2021jxjl 130025) en het Chongqing Municipal Health Commission Key Discipline Construction Project van Chinese Materia Medica Processing.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileFisher197164
Baohuoside figure-materials-1 (Bfigure-materials-2 ) Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20042402
Chromatographic columnWaters CorporationSymmetry C18
Design Expert softwareStat- Ease Inc., Minneapolis, MNTrial Version8.0.6.1
DetectorWaters Corporation2998
DisintegratorHefei Rongshida Small Household Appliance Co., Ltd.S-FS553
Electronic analytical balanceMettler-Toledo International Inc.MS205DU
Epimedin A (EA)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-21112118
Epimedin B (EB)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080403
Epimedin C (EC)Chengdu Manst Biotechnology Co., Ltd.MUST-20080310
EthanolChongqing Chuandong Chemical ( Group ) Co., Ltd.20180801
Graphpad softwareGraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA6.02
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)Waters Corporation2695
IcariinChengdu Glip Biotechnology Co., Ltd.21091401
MethanolChongqing Chuandong Chemical (Group) Co., Ltd.20171101
Microporous membraneTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd.0.22μm
Mutton oilKuoshan Zhiniu Fresh Food Store20211106
Office Excel office softwareMicrosoftOffice Excel 2021
Pharmacopoeia sieveShaoxing Shangyu Huafeng Hardware Instrument Co., Ltd.R40/3
Pure water machineChongqing Andersen Environmental Protection Equipment Co., Ltd.AT Sro 10A
Qualitative filter paperShanghai Leigu Instrument Co., Ltd.18cm
StereomicroscopeCarl Zeiss, Oberkochen, GermanyStemi 2000
Ultrasonic cleanerBranson Ultrasonics (Shanghai) Co.,Ltd.BUG25-12
ZebrafishChina Zebrafish Resource Center (CZRC)The AB strain

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chinese Pharmacopoeia Commission. Chinese Pharmacopoeia. Volume I. , China Medical Science and Technology Press. Beijing, China. (2020).
  2. Wang, X. T. Collection of Traditional Chinese Medicine Processing Methods. , Nanchang Science and Technology Press. Jiangxi, China. (1998).
  3. Chen, L. L., Jia, X. B., Jia, D. S. Advances in studies on processing mechanism of Epimedii Folium. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 12 (12), 2108-2111 (2010).
  4. Zhao, W., et al. Optimized extraction of polysaccharides from corn silk by pulsed electric field and response surface quadratic design. Journal of The Science of Food and Agriculture. 91 (12), 2201-2209 (2011).
  5. Zhao, L. C., et al. The use of response surface methodology to optimize the ultrasound-assisted extraction of five anthraquinones from Rheum palmatum L. Molecules. 16 (7), 5928-5937 (2011).
  6. Mao, W. H., Han, L. J., Shi, B. Optimization of microwave assisted extraction of flavonoid from Radix Astragali using response surface methodology. Separation Science and Technology. 43 (12), 671-681 (2008).
  7. Liu, W., et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from Gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis. International Journal of Molecular Sciences. 11 (11), 4750-4763 (2010).
  8. Guo, G. L., et al. Research progress on processing mechanism of Epimedium fried with sheep fat oil based on warming kidney and promoting yang. Journal of Liaoning University of TCM. 22 (07), 1-5 (2020).
  9. Shen, X. J., Zhou, Q., Sun, L. -L., Dai, Y. -P., Yan, X. -S. Optimization for cutting procedure of astragali radix with Box-Behnken design and response surface method. China Journal of Chinese Materia Medica. 39 (13), 2498-2503 (2014).
  10. Wang, L. H., et al. Optimization of processing technology of honey wheat bran based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 52 (12), 3538-3543 (2021).
  11. Zhang, J. B., et al. Study on integrated process of producing area and processing production for Paeoniae Radix Alba based on Box-Behnken response surface methodology. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (18), 5657-5662 (2022).
  12. Li, N., Zhang, X. M., Yao, Y. Y., Chen, Y. L., Fan, Q. Optimization of processing technology for Psoraleae Fructus by D-optimal response surface methodology with UHPLC. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 39 (05), 42-44 (2022).
  13. Jia, Y. Q., et al. Optimization of processing technology with wine of Cnidii Fructus by AHP-entropy weight method combined with response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 10, 2338-2343 (2022).
  14. Chen, F. G., et al. Optimization of the baked drying technology of Cinnamomi Ramulus based on CRITIC combined with Box-Behnken response surface method. Journal of Chinese Medicinal Materials. 2022 (08), 1838-1842 (2022).
  15. Wang, W. D., et al. Optimization extraction of effective constituents from Epimedii Herba based on central composite design-response surface methodology and orthogonal experimental design. Lishizhen Medicine and Materia Medica. 21 (11), 2766-2768 (2010).
  16. Yang, L., et al. Zebrafish embryos as models for embryotoxic and teratological effects of chemicals. Reproductive Toxicology. 28 (2), 245-253 (2009).
  17. Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
  18. Jayasinghe, C. D., Jayawardena, U. A. Toxicity assessment of herbal medicine using zebrafish embryos: A systematic review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 7272808(2019).
  19. Scholz, S. Zebrafish embryos as an alternative model for screening of drug induced organ toxicity. Archives of Toxicology. 87 (5), 767-769 (2013).
  20. Ling, J., et al. Analysis of Folium Epimedium toxicity in combination with Radix Morindae Officinalis based on zebrafish toxicity/metabolism synchronization. Acta Pharmaceutica Sinica. 53 (1), 74(2018).
  21. Wang, Y., et al. Tri-n-butyl phosphate delays tissue repair by dysregulating neutrophil function in zebrafish. Toxicology and Applied Pharmacology. 449, 116114(2022).
  22. Sheng, Z. L., Li, J. C., Li, Y. H. Optimization of forsythoside extraction from Forsythia suspensa by Box-Behnken design. African Journal of Biotechnology. 10 (55), 11728-11737 (2011).
  23. Pang, X., et al. Prenylated flavonoids and dihydrophenanthrenes from the leaves of Epimedium brevicornu and their cytotoxicity against HepG2 cells. Natural Product Research. 32 (19), 2253-2259 (2018).
  24. Zhong, R., et al. The toxicity and metabolism properties of Herba Epimedii flavonoids on laval and adult zebrafish. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2019, 3745051(2019).
  25. Zhang, L., et al. Effect of 2" -O-rhamnosyl icariside II, baohuoside I and baohuoside II in Herba Epimedii on cytotoxicity indices in HL-7702 and HepG2 cells. Molecules. 24 (7), 1263(2019).
  26. Chen, Y., Yang, R. J., Yu, M., Ding, S. L., Chen, R. Q. Application of response surface methodology in modern production process optimization. Science & Technology Vision. 2016 (19), 36-39 (2016).
  27. Zhang, Y., et al. Progress in using zebrafish as a toxicological model for traditional Chinese medicine. Journal of Ethnopharmacology. 282, 114638(2022).
  28. Oliveira, R., Domingues, I., Grisolia, C. K., Soares, A. M. V. M. Effects of triclosan on zebrafish early-life stages and adults. Environmental Science and Pollution Research. 16 (6), 679-688 (2009).
  29. Ton, C., Lin, Y., Willett, C. Zebrafish as a model for developmental neurotoxicity testing. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (7), 553-567 (2006).
  30. He, Q., et al. Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos. Drug and Chemical Toxicology. 35 (2), 149-154 (2012).
  31. Chen, Y., et al. Developmental toxicity of muscone on zebrafish embryos. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology. (6), 267-273 (2014).
  32. He, Y. L., et al. Effects of shikonin on zebrafish's embryo and angiogenesis. Chinese Traditional Patent Medicine. 38 (2), 241-245 (2016).
  33. Zhou, Y. The transformation research on the chemical compositions in the processing of Epimedium. , Kunming University of Science and Technology. Kunming, China. (2016).
  34. Xiao, Y. P., Zeng, J., Jiao, L. -N., Xu, X. -Y. Review for treatment effect and signaling pathway regulation of kidney-tonifying traditional Chinese medicine on osteoporosis. China Journal of Chinese Materia Medica. 43 (1), 21-30 (2018).
  35. Wang, R. H. Study on modern pharmacological effects of traditional Chinese medicine for tonifying kidney yang. Journal of Hubei University of Chinese Medicine. 13 (04), 63-66 (2011).
  36. Luo, L., et al. Advances in the chemical constituents and pharmacological studies of Epimedium. Asia-Pacific Traditional Medicine. 15 (6), 190-194 (2019).
  37. Liu, S., et al. Effects of icariin on ERβ gene expression and serum estradiol level in ovariectomized rats. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine. 32 (1), 150-152 (2016).
  38. Liu, Y., et al. Effects of epimedin A on osteoclasts and osteoporotic male mice. Chinese Journal of Veterinary Science. 41 (07), 1359-1364 (2021).
  39. Liu, Y. L., et al. Effects of icariin and epimedium C on microstructure of bone tissue in glucocorticoid osteoporosis model mice based on Micro-CT technique. Drug Evaluation Research. 43 (09), 1733-1739 (2020).
  40. Zhan, Y. Evaluation of antiosteoporotic activity for micro amount icariin and epimedin B based on the osteoporosis model using zebrafish. Chinese Pharmaceutical Journal. (24), 30-35 (2014).
  41. Zhan, Y., Wei, Y. -J., Sun, E., Xu, F. -J., Jia, X. -B. Two-dimensional zebrafish model combined with hyphenated chromatographic techniques for evaluation anti-osteoporosis activity of epimendin A and its metabolite baohuoside I. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (06), 932-937 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epimedii FoliumMutton Oil ProcessingResponse Surface MethodBox Behnken DesignZebrafish Embryo DevelopmentHPLC AnalysisToxicity AssessmentChinese Medicine PreparationIcariin ContentTeratogenicity Testing

Related Articles