Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro

4.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65106

⸱

17 maart 2023

 , 
1Weill Center for Metabolic Health, Department of Medicine, Weill Cornell Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Triglyceride lipolyse in adipocyten is een belangrijk metabolisch proces dat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om basale en gestimuleerde lipolyse te meten in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen.

Samenvatting

Adipocyten slaan energie op in de vorm van triglyceriden in lipidedruppeltjes. Deze energie kan worden gemobiliseerd via lipolyse, waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst van de glycerol-ruggengraat, wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren en glycerol. Vanwege de lage expressie van glycerolkinase in witte adipocyten zijn de heropnamesnelheden van glycerol verwaarloosbaar, terwijl de heropname van vetzuren wordt bepaald door de vetzuurbindende capaciteit van mediacomponenten zoals albumine. Zowel glycerol als vetzuurafgifte in media kunnen worden gekwantificeerd door colorimetrische assays om de lipolytische snelheid te bepalen. Door deze factoren op meerdere tijdstippen te meten, kan men de lineaire snelheid van lipolyse met hoge betrouwbaarheid bepalen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de meting van lipolyse in in vitro gedifferentieerde adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen. Dit protocol kan ook worden geoptimaliseerd voor andere preadipocytencellijnen of vetweefsel van andere organismen; Overwegingen en optimalisatieparameters worden besproken. Dit protocol is ontworpen om nuttig te zijn bij het bepalen en vergelijken van de snelheid van adipocytenlipolyse tussen muismodellen en behandelingen.

Inleiding

Overtollige voedingsstoffen worden opgeslagen in wit vetweefsel in de vorm van triglyceriden in de neutrale lipidekern van lipidedruppels. Triglyceridevoorraden worden gemobiliseerd via lipolyse, een proces waarbij de vetzuurzijketens sequentieel worden gesplitst door vetweefseltriglyceridilase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL), wat resulteert in de afgifte van vrije vetzuren (FFA's) en de glycerol-ruggengraat 1,2. Lipolyse wordt geactiveerd door catecholaminesignalering in het vetweefsel. Sympathische zenuwuiteinden geven lokaal catecholaminen af, die binden aan β-adrenerge receptoren op het adipocytenplasmamembraan. Bij ligandbinding activeren deze G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) adenylylcyclase via Gαs. Daaropvolgende activering van proteïnekinase A (PKA) door cAMP resulteert in de upregulatie van zowel ATGL als HSL. De fosforylering van perilipine-1 door PKA veroorzaakt de dissociatie van ABHD5 (ook bekend als CGI-58), dat ATGL3 bindt en coactiveert. PKA fosforyleert HSL direct en bevordert de translocatie van het cytosol naar de lipidedruppel, waar interactie met gefosforyleerd perilipine-1 de lipase-activiteit verder bevordert 4,5,6,7. De derde lipase die betrokken is bij lipolyse, MGL, lijkt niet te worden gereguleerd door catecholaminesignalering8. Belangrijk is dat triglyceridensynthese in adipocyten wordt gemedieerd door de glycerollipidesyntheseroute, die niet de vorming van monoglyceriden als tussenproduct met zich meebrengt; in plaats daarvan katalyseren glycerol-3-fosfaat acyltransferasen de vorming van lysofosfatidinezuur, dat wordt gecombineerd met een ander vette acyl-CoA om fosfatidisch zuur te vormen en vervolgens wordt geïsomeriseerd tot diglyceriden vóór de uiteindelijke synthese van triglyceriden (figuur 1) 9,10,11.

figure-introduction-1
Figuur 1: Lipolyse en glycerol lipide synthese routes. Top: Lipolytische route; enzymen in rood: vetweefsel triglyceride lipase (ATGL), hormoongevoelige lipase (HSL) en monoglyceride lipase (MGL). Onder: glycerol lipide synthese route; enzymen in het groen: diglyceride acyltransferase (DGAT), fosfatidinezuurfosfatase (PAP), lysofosfatidinezuuracyltransferase (LPAT, ook bekend als LPAATs) en glycerol-3-fosfaatacyltransferase (GPAT). Lipiden: triglyceride (TG), diglyceride (DG), monoglyceride (MG), vrij vetzuur (FFA), vette acyl-CoA (FA-CoA), lysofosfatidinezuur (LPA) en fosfatidinezuur (PA). Andere metabolieten: anorganisch fosfaat (Pi) en glycerol 3-fosfaat (G3P). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Extracellulaire adenosine is een andere belangrijke regulator van lipolyse, die werkt via G s- en Gi-gekoppelde GPCR's om de adenylcyclase-activiteit te beïnvloeden. De overheersende adenosinereceptor in adipocyten, ADORA1, remt adenylylcyclase en dus lipolyse door de activering van Gi12. Uitgedrukt op lagere niveaus, en voornamelijk in bruine adipocyten, activeert ADORA2A lipolyse via Gs signalering13. ADORA1 beïnvloedt zowel basale lipolyse als de respons op adrenerge agonisten. Het effect van adenosine op lipolyse kan worden gecontroleerd door adenosinedeaminase toe te voegen om adenosine te neutraliseren, evenals de ADORA1-specifieke agonist fenylisopropyladenosine14,15. Hormonale activering van G q-gekoppelde GPCR's kan ook de lipolyse beïnvloeden via de activering van fosfolipase C en eiwitkinase C16,17,18,19. Ontstekingssignalen hebben ook invloed op de lipolytische snelheden. TLR4-activering door LPS (en andere endotoxinen) verhoogt de lipolytische snelheid door ERK te activeren, dat perilipine-1 en HSL20 fosforyleert. TNF-α activeert ook lipolyse via ERK- en NF-κB-activering, evenals transcriptionele downregulatie van het fosfodiësterase PDE-3B en CIDEC21,22,23. IL-6 is ook in verband gebracht met verhoogde adipocytenlipolyse, vooral in mesenterisch vetweefsel, waarvan de FFA-afgifte van invloed is op leversteatose en gluconeogenese24,25,26.

Lipolyse wordt onderdrukt tijdens de gevoede toestand door insuline. AKT fosforyleert en activeert PDE-3B om cAMP-signalering te onderdrukken en PKA-activering te voorkomen27. Insuline downreguleert ook transcriptioneel ATGL28. Obesitas bevordert catecholamineresistentie door middel van een verscheidenheid aan mechanismen, waaronder de downregulatie van β-adrenerge receptoren in adipocyten 29,30,31,32,33. Adipocyten brengen alle drie de β-adrenerge receptoren tot expressie (β-1, β-2 en β-3). Terwijl β-1 en β-2 adrenerge receptoren alomtegenwoordig tot expressie komen, wordt de β-3 adrenerge receptor voornamelijk uitgedrukt in adipocyten in muizen34,35. Adrb3-expressie wordt geïnduceerd door C/EBPα tijdens adipogenesis36. De β-3 adrenerge receptor komt sterk tot expressie in volwassen adipocyten. De activering van β-1 en β-2 adrenerge receptoren is zelfbeperkend als gevolg van feedbackremming door β-arrestine37. Feedbackremming van de β-3 adrenerge receptor wordt gemedieerd door andere signaalroutes, die de Adrb3-expressie 33,38,39 verminderen.

Talrijke verbindingen kunnen worden gebruikt om adipocytenlipolyse te activeren. Catecholamines zijn belangrijke fysiologische activatoren van lipolyse. Noradrenaline (of noradrenaline) en epinefrine (of adrenaline) activeren alle drie de β-adrenerge receptoren40. Noradrenaline en epinefrine beïnvloeden ook lipolyse via activering van α-adrenerge receptorsignalering41. Veelgebruikte β-adrenerge receptoragonisten zijn isoproterenol, een niet-selectieve β-adrenerge receptoragonist, en de β-3 adrenerge receptoragonisten CL-316,243 en mirabegron42. Aangezien adipocyten voornamelijk de β-3 adrenerge receptor tot expressie brengen, gebruiken we hier CL-316,243 als voorbeeld. De specificiteit voor de β-3 adrenerge receptor maakt het ook een relatief specifieke activator van adipocyte catecholamine signalering, die ook veilig in vivo kan worden gebruikt. Merk op dat de veelgebruikte concentratie van 10 μM CL-316,243 in celcultuur ordes van grootte hoger is dan de ~ 0,1 μM dosis die nodig is om een maximale responste bereiken 33. Forskolin omzeilt de adrenerge receptor, direct activeren adenylyl cyclase en downstream lipolytische signalering. Er zijn veel meer activatoren, evenals onderdrukkers van lipolyse. Bij het selecteren van een verbinding om lipolyse te stimuleren, moeten de receptorspecificiteit en downstream signaalroutes zorgvuldig worden overwogen binnen het experimentele ontwerp.

De snelheid van lipolyse in wit vetweefsel is een belangrijke metabolische factor die van invloed is op de koudetolerantie en de beschikbaarheid van voedingsstoffen tijdens vasten of lichaamsbeweging43,44,45,46. Het doel van dit protocol is om de snelheid van lipolyse in adipocyten en vetweefsel te meten, wat het begrip van adipocytenmetabolisme zal vergemakkelijken en hoe dit het metabole fenotype van verschillende muizenmodellen kan beïnvloeden. Om de lipolytische snelheid te kwantificeren, meten we het uiterlijk van lipolytische producten in de media (d.w.z. FFA's en glycerol). De methode is gebaseerd op het vrijkomen van lipolytische producten uit de adipocyt in de media. Aangezien witte adipocyten lage niveaus van glycerolkinase tot expressie brengen, zijn de heropnamepercentages van glycerol laag47. Omgekeerd moet ook de productie van FFA's en glycerol door andere metabole routes dan lipolyse worden overwogen. Adipocyten lijken een fosfatase uit te drukken met activiteit tegen glycerol-3-fosfaat, waardoor de productie van glycerol uit glycerol-3-fosfaat afgeleid van glucose48,49,50 mogelijk is. Glycolyse is een bron van glycerol-3-fosfaat dat wordt gebruikt voor FFA-herverestering in witte adipocyten. Wanneer de glucosespiegels beperkt zijn, vereist glyceroneogenese andere 3-koolstofbronnen, zoals lactaat en pyruvaat51. De kanalisatie van FFA's die vrijkomen door lipolyse in de cel en hun metabolische lot is slecht begrepen; FFA's die vrijkomen door lipolyse moeten worden omgezet in vette acyl-CoA, voordat ze opnieuw worden veresterd of β-oxidatie ondergaan. Het lijkt erop dat FFA's die vrijkomen door lipolyse waarschijnlijk de cel verlaten voordat ze weer worden opgenomen en omgezet in vette acyl-CoA 52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62 . FFA's kunnen buiten de cel worden gesekwestreerd door albumine. Belangrijk is dat van FFA's met een lange keten bekend is dat ze de lipolyse remmen als ze niet worden gesekwestreerd door albumine 63,64,65,66,67. Het optimaliseren van de FFA-buffercapaciteit van de media tijdens de lipolyse-assay is dus van cruciaal belang. De hier beschreven procedure is vergelijkbaar met eerder gepubliceerde methoden om de lipolytische snelheid in adipocyten en ex vivo vetweefsel van muizen en mensen te meten 15,68,69,70,71. Dit protocol verschilt door het gebruik van seriële bemonstering; Door seriële bemonstering uit te voeren, kunnen we intern valideren dat lipolyse wordt gemeten in de lineaire fase en meerdere metingen gebruiken om de snelheid van lipolyse te berekenen, waardoor de meetfout wordt verminderd om het vertrouwen in de uiteindelijke berekende waarde te vergroten. Het nadeel van seriële bemonstering is dat de test meer tijd en reagentia vereist; Het langere tijdsbestek vermindert echter de impact van meetfouten op de standaardfout van de schattingen van het tarief. Bovendien meet dit protocol zowel FFA als glycerolafgifte en beschouwt het de verhouding FFA: glycerolafgifte met als doel een 3: 1-verhouding te bereiken, zoals zou worden verwacht van volledige lipolyse en afgifte van lipolytische producten in de media72.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het gebruik van alle dieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het Weill Cornell Medical College van Cornell University.

1. Voorbereiding van buffers en opvangplaten

  1. Maak 5% runderserumalbumine (BSA) door 5 g BSA op te lossen in 100 ml Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) zonder fenolrood. Roer de BSA voorzichtig om op te lossen (schudden werkt averechts). Zodra de BSA volledig is opgelost, filter-steriliseer de media met een 0,2 μm filter. Bewaar de BSA media bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
  2. Maak werkconcentraties van controle- en stimulatiemedia. Besturingsmedia: 5% BSA-media met voertuigbesturing. Stimulatiemedia: 5% BSA-media met 0,5 μM CL-316,243. Maak nieuwe stimulatiemedia voor elk experiment.
  3. Verwarm de te gebruiken media tot 37 °C. Label een plaat met 96 putten voor mediaverzameling.

2. Monstervoorbereiding

  1. Voer celkweek uit zoals hieronder beschreven. Voer alle celwerkzaamheden uit in een steriele zuurkast om besmetting van buitenaf te minimaliseren.
    1. Isoleer en differentieer primaire preadipocyten, zoals in73,74.
      1. Plaat primaire preadipocyten met een hoge dichtheid, zoals 1 x 105 cellen / put in een 24-well plaat in 1 ml / put kweekmedia (15% foetaal runderserum (FBS) en 1x penicilline-streptomycine-glutamine in DMEM / F12).
      2. Nadat de cellen 100% confluentie hebben bereikt, differentiëren met 5 μM dexamethason, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1 μg / ml insuline en 1 μM thiazolidinedion (TZD) in kweekmedia gedurende 3 dagen. Schakel vervolgens over op kweekmedia met 1 μg / ml insuline gedurende ten minste 3 dagen om lipidedruppels te laten groeien. Gebruik 1 ml/put media in de 24-well plaat.
      3. Vervang de kweekmedia (1 ml/put) met insuline om de 2 of 3 dagen. De cellen kunnen tot 2 weken in media met insuline worden gehouden. Gebruik alleen culturen waarin de differentiatiepercentages meer dan 90% zijn en vergelijkbaar zijn tussen groepen voor deze test, omdat verminderde differentiatie verkeerd kan worden geïnterpreteerd als een verlaging van de lipolytische snelheid.
      4. Kweek de cellen in insulinevrije media gedurende 24 uur voorafgaand aan het meten van lipolyse.
        OPMERKING: Insuline in de media onderhoudt lipidedruppels, maar remt ook lipolyse. Incubatie zonder insuline gedurende 24 uur zorgt voor volledige lipolytische activering zonder verlies van lipidedruppelvolume. In sommige systemen moet de kweektijd zonder insuline mogelijk worden verkort of verlengd.
    2. Was de cellen eenmaal met DPBS om het resterende serum uit de kweekmedia te verwijderen.
      OPMERKING: Dit protocol omvat geen serumuithongering, die lipolyse kan activeren. Serumhonger kan naar goeddunken van de onderzoeker worden gebruikt.
  2. Voer ex vivo cultuur uit zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid een plaat met 6 putten voor, met één put voor elk weefsel dat van elke muis moet worden verzameld. Plaats 4 ml DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put.
      OPMERKING: BSA in de verzamelmedia is niet nodig.
    2. Bereid een plaat met 48 putten voor de lipolysetest, met één put voor elke replicatie. Plaats 400 μL DMEM op kamertemperatuur in elke te gebruiken put. Gebruik twee tot vier controle- en twee tot vier gestimuleerde putjes per weefsel per muis.
    3. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie onder anesthesie, met een secundaire methode zoals bilaterale pneumothorax. Hier gebruikten we een 32 g, 7 maanden oude vrouwelijke C57BL / 6J-muis, gevoed met een 45% vetrijk dieet gedurende 4 maanden.
      OPMERKING: Dit protocol kan ook worden gebruikt voor mannen, evenals andere stammen, diëten en leeftijden.
    4. Spray met 70% ethanol en gebruik een schaar om een kleine (~ 1 cm) laterale incisie in het midden van de buikhuid te maken, trek de huid uit elkaar door aan weerszijden met duim en wijsvinger te knijpen en vouw de onderbuikhuid om om de achterste onderhuidse depots te onthullen. Lokaliseer en verwijder de inguinale lymfeklier en ontleed het inguinale vetweefsel onmiddellijk na de inguinale lymfeklier met een tang.
    5. Om het gonadale vetweefsel te verzamelen, maakt u een laterale en een verticale incisie in het peritoneum om toegang te krijgen tot de peritoneale holte. Houd het gonadale vetkussen vast met een pincet en snijd langs de baarmoeder (of bijbal voor mannen) om het gonadale vetweefsel te verwijderen. Plaats de verzamelde depots in een 6-well plaat.
    6. Verwijder het weefsel goed, leg het op een siliconenmat en snijd met een schaar in stukjes van 5 tot 7 mg.
    7. Weeg 25 tot 30 mg (vijf of zes brokken) voor elke test goed af en plaats in een 48-well assay-plaat. Dep de tissue op een schone handdoek voordat u weegt om eventuele media te verwijderen. Weeg het gewicht na verwijdering van het weefsel en noteer het gewicht van eventuele achtergebleven resten. Veeg de gewichtsboot schoon tussen de monsters en reparaer indien nodig. Gebruik een nieuwe gewichtsboot voor elk weefsel.
    8. Zodra alle weefselmonsters zijn gewogen, plaatst u de 48-well assay plate in een 37 °C, 10% CO 2-incubator gedurende 15 minuten.

3. Lipolyse-test

  1. Mediaverzameling uitvoeren. Voer de overdracht van de media en de daaropvolgende monsterverzameling uit in een steriele zuurkast om mogelijke verontreiniging door externe bronnen te minimaliseren.
    1. Bij t = 0 verwijdert u de media en voegt u 400 μL per put controle- of stimulatiemedia toe en plaatst u de plaat in een 37 °C, 10% CO 2-incubator. Voor ex vivo weefselkweek, verwijder media voorzichtig met behulp van een pipet; zuigkracht mag nooit worden gebruikt.
      OPMERKING: U kunt ook een tweede plaat met controle- en stimulatiemedia voorbereiden en de weefsels overbrengen.
    2. Verzamel bij t = 1, 2, 3 en 4 uur 200 μL media, vervang door 200 μL van de juiste controle- of stimulatiemedia en breng de testplaat terug naar de incubator. Bewaar de opvangplaat bij 4 °C. Om de FFA-buffercapaciteit van de BSA-media te bepalen, gebruikt u een extra verzameling na 24 uur.
      OPMERKING: De experimenten kunnen hier worden gestopt en de verzamelde media kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

4. FFA colorimetrische assay

  1. Verwarm de reagentia tot kamertemperatuur en los één fles kleurreagens A op met één fles oplosmiddel A en één fles kleurreagens B met één fles oplosmiddel B. Vanaf de datum van reconstitutie kunnen deze reagentia het beste binnen 1 week worden gebruikt. 1 maand na reconstitutie weggooien.
  2. Ontdooi en meng de monsters.
  3. Maak een FFA-standaardcurve. De standaardoplossing is 1 mM. Gebruik het volgende volume met de reagentia voor de standaardcurve: 25 μL, 20 μL, 15 μL, 10 μL, 10 μL (1:2 verdunning), 10 μL (1:4 verdunning), 10 μL (1:8 verdunning) en 10 μL water voor maximaal bereik. Voor lage FFA-niveaus kan de standaard 10 μL van 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM en 0,05 mM meer van toepassing zijn.
  4. Pipetstandaarden en monsters in een 96-well assayplaat. Het aanbevolen monstervolume is 10 μL. Neem drie putjes op met hetzelfde volume BSA-media als de monsters voor achtergrondcorrectie.
    OPMERKING: Als de monsterconcentraties buiten het bereik van de standaardcurve vallen, herhaalt u de test en stelt u het monstervolume in op 2-25 μl.
  5. Voeg 150 μL reagens A toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Lees de absorptie van de plaat af bij 550 nm en 660 nm referentie (aflezing A).
  7. Voeg 75 μL reagens B toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  8. Lees de absorptie van de plaat opnieuw af bij 550 nm en 660 nm referentie (Reading B).

5. Glycerol colorimetrische assay

  1. Reconstitueer het vrije glycerolreagens met 36 ml ultrapuur water en acclimatiseer aan kamertemperatuur. Deze reagentia kunnen het beste binnen enkele weken worden gebruikt. 2 maanden na reconstitutie weggooien.
  2. Ontdooi en meng de monsters.
  3. Maak een glycerolstandaardcurve door een zevenpunts, 2-voudige seriële verdunning van de glycerolstandaardoplossing en een waterblanco te maken.
    OPMERKING: De standaardcurve is relatief lineair tot 25 μL van 2,8 mM glycerol, maar niet lineair bij hogere concentraties.
  4. Pipetteer 25 μL elk van de standaard en monsters in de 96-well assay plaat. Voeg drie putten toe aan de BSA-media voor achtergrondcorrectie.
  5. Voeg 175 μL vrij glycerolreagens toe aan elke put en meng. Vermijd het genereren van bubbels. Knal eventuele bubbels met een fijne naald. Incubeer de testplaat bij 37 °C gedurende 5 min.
  6. Lees de absorptie van de plaat bij 540 nm.

6. Berekening van de lipolytische snelheid

  1. Begin met optische dichtheidswaarden (OD). Gebruik voor glycerol direct A540 OD-waarden. Bereken de OD van de FFA-test volgens de volgende formule:
    OD = (Lezing B: A 550 - A 660) - (Lezing A: A550 - A 660)
  2. Gebruik de standaardcurve om de FFA- en glycerolniveaus in de verzamelde monsters te berekenen. Zet de standaard OD-waarden uit op de y-as en gebruik op de x-as standaardconcentraties ten opzichte van het monstervolume (d.w.z. de concentratie van de putten met 20 μL van 1 mM FFA-standaard op een plaat met 10 μL-monsters is gelijk aan 2 mM). Pas een lineaire trendlijn aan:
    y = mx + b
  3. Inspecteer de standaardcurve visueel en verwijder alle punten buiten het lineaire bereik van de test. Bereken de monsterconcentraties met behulp van de vergelijking:
    Monsterconcentratie: x = (OD - b) ÷ m
  4. Pas monsters aan en test deze opnieuw die buiten het lineaire testbereik vallen. Om de uiteindelijke monsterconcentratie te verkrijgen, trekt u de concentratie van de achtergrondputten die alleen BSA-media bevatten af van de concentratie van de monsters.
  5. Bereken de mol FFA en glycerol geproduceerd door elk monster op elk tijdstip, volgens de formule:
    figure-protocol-1
    waarbij C n = concentratie op tijdstip t = n; Vt = totaal volume in de put; Vs = volume van de monsterneming; en M n = mol geproduceerd op tijdstip t = n (wanneer de concentraties in mM zijn en de volumes in ml zijn, is de output μMol).
    Voorbeelden, op verschillende tijdstippen:
    M 1 = C1 × Vt
    M 4 = C4 × Vt + (C1 + C2+ C3)Vs
    of
    M 4 = C4 × Vt + C3 × V s + C2 × V s + C1 ×V s
  6. Normaliseer tot weefselgewicht door het weefselgewicht voor elk monster in grammen te delen om eenheden μmol/g te verkrijgen. Voor gekweekte cellen worden waarden gepresenteerd als μmol/well. Zorg ervoor dat het celaantal en de differentiatie-efficiëntie vergelijkbaar zijn van goed tot goed.
    OPMERKING: Verschillen in proliferatie- of differentiatie-efficiëntie zullen de interpretatie van resultaten bemoeilijken en een andere methode van normalisatie vereisen (bijv. Normalisatie naar eiwit; zie discussie).
  7. Bereken de helling van de geproduceerde μmol/g (y-as) versus tijd (x-as) voor elk monster afzonderlijk.
    1. In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =SLOPE(known_ys,known_xs). Typ in een nieuwe cel "=SLOPE" (gebruik vervolgens de cursor om de glycerol- of FFA-waarden van het monster in μmol/g te markeren en vervolgens de bijbehorende tijdwaarden te markeren).
    2. Controleer de lineariteit van de gegevens. R2-waarden zijn een snelle manier om de lineariteit van de monsters te bepalen. In een spreadsheet kan dit worden gedaan met behulp van de functie =RSQ(known_ys,known_xs), op dezelfde manier als beschreven in stap 6.7.1, maar de initiële invoer is =RSQ. Zorg ervoor dat de R2-waarden > 0,98 zijn; lagere waarden duiden op afwijking van de lineariteit. Dit kan het gevolg zijn van een meet-/bemonsteringsfout of verlies van lineariteit.
      1. Een andere manier om de lineariteit te testen, is door voor elk monster een lineaire regressie uit te voeren en de residuen uit te zetten. Genereer in statistische analysesoftware een XY-tabel met één Y-waarde voor elk tijdstip. Selecteer Analyseren > Eenvoudige lineaire regressie en selecteer het vakje voor Residuele plot voordat u op OK drukt. De resterende grafiek wordt weergegeven als een nieuwe grafiek.
  8. Gebruik de FFA- en glycerolproductiesnelheid (d.w.z. helling [(μmol/g/h]) voor elk monster als een individueel gegevenspunt om statistische analyse uit te voeren en waarden uit te zetten als verschillende lipolytische omstandigheden worden vergeleken. Als lipolytische snelheden worden vergeleken tussen genotypen, gebruik dan twee of drie monsters per dier als technische replicaties en gebruik het gemiddelde voor één gegevenspunt per dier, zodat de steekproefgrootte gelijk is aan het aantal dieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We maten de basale en gestimuleerde lipolytische snelheid van in vitro gedifferentieerde adipocyten. Primaire preadipocyten uit inguinaal wit vetweefsel werden gedifferentieerd in adipocyten door de behandeling van confluente cellen met 5 μM dexamethason, 0,5 mM IBMX, 1 μg/ml insuline en 1 μM troglitazon gedurende 4 dagen, gevolgd door een aanvullende behandeling van 3 dagen met 1 μg/ml insuline. Cellen werden geïncubeerd in media zonder insuline gedurende 24 uur voorafgaand aan de lipolysetest. Op het moment = ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier bieden we een basisprotocol voor het meten van de snelheid van lipolyse in adipocyten en ex vivo vetweefsel. Om lipolyse te kwantificeren, is het belangrijk om de lipolytische snelheid in de lineaire fase te meten. We maken gebruik van een seriële bemonsteringstechniek, waarbij een groot deel van de media wordt verzameld en op regelmatige tijdstippen wordt vervangen door verse media. Deze semiconservatieve methode maakt de toevoeging van verse BSA met FFA-buffercapaciteit mogelijk en vertraagt feedbackremmi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Institutes of Health subsidie R01DK126944 aan SMR.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
24-Well tissue culture treated plateCorning Inc3527Moet voor weefselkweek worden behandeld voor adipocyte differentiatie
48-Well flat bottom plate with lidCorning Inc353078Kan voor weefselkweek worden behandeld
6-Well flat bottom plate with lidCorning Inc353046Kan voor weefselkweek worden behandeld
96-Well PCR PlateUSA sceintific1402-9100Elke conische 0,2 mL PCR-plaat is handig 
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA9418FFA-vrije BSA zoals A8806, wordt ook vaak gebruikt. De BSA mag geen detecteerbare FFA hebben, ook kunnen lot-to-lot variaties in BSA van invloed zijn op de waargenomen snelheid van lipolyse
CL-316,243Sigma AldrichC5976CAS #: 138908-40-4 verkrijgbaar bij andere leveranciers
CO2 incubatorPHCBIMCO-170AICUVHCO2 moet idealiter worden ingesteld op 10% voor vetweefsel, echter 5% CO2 zal ook werken
DMEM, low glucose, no phenol redThermofischer11054020Elk phenolroodvrij medium zou moeten werken, DMEM/F12, RPMI, maar moet een vluchtige buffercapaciteit bevatten, d.w.z. biocarbonaat
FFA-vrij bovien serumalbumineEquitech-Bio, Inc, BAH66
Free Glycerol ReagentSigma AldrichF6428
Glycerol Standard SolutionSigma AldrichG7793 Dit kan ook worden gemaakt door glycerol te verdunnen tot de gewenste concentratie
HR Series NEFA Standard SolutionFujifilm276-76491
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent AFujifilm999-34691
HR Series NEFA-HR (2) Color Reagent BFujifilm991-34891
HR Series NEFA-HR (2) Solvent A Fujifilm995-34791
HR Series NEFA-HR (2) Solvent B Fujifilm993-35191
Microbiological IncubatorFischer ScientificS28668Elke incubator bij 37C kan worden gebruikt
Nunc MicroWell 96-Well PlatesThermo Scientific269620Elke optisch heldere, platte bodem 96-well plaat werkt
Silicone Laboratory Benchtop MatVWR76045-300Een glazen plaat kan ook worden gebruikt. Absorberende oppervlakken worden niet aanbevolen
Spectrophotometer/Microplate ReaderMolecular devicesSpectraMax i3x Elke plate reader die kan lezen op 540, 550 en 660 mm zal werken
V Bovine serum albuminSigma-Aldrich810531
WypAll X70 WipersKimberly-Clark41200Elke hoogwaardige papieren handdoek zal werken

Referenties

  1. Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
  2. Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tissue is promoted by adipose triglyceride lipase. Science. 306 (5700), 1383-1386 (2004).
  3. Lass, A., et al. Adipose triglyceride lipase-mediated lipolysis of cellular fat stores is activated by CGI-58 and defective in Chanarin-Dorfman syndrome. Cell Metabolism. 3 (5), 309-319 (2006).
  4. Stralfors, P., Bjorgell, P., Belfrage, P. Hormonal regulation of hormone-sensitive lipase in intact adipocytes: identification of phosphorylated sites and effects on the phosphorylation by lipolytic hormones and insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (11), 3317-3321 (1984).
  5. Miyoshi, H., et al. Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15837-15844 (2006).
  6. Sztalryd, C., et al. Perilipin A is essential for the translocation of hormone-sensitive lipase during lipolytic activation. The Journal of Cell Biology. 161 (6), 1093-1103 (2003).
  7. Lafontan, M., Langin, D. Lipolysis and lipid mobilization in human adipose tissue. Progress in Lipid Research. 48 (5), 275-297 (2009).
  8. Grabner, G. F., Xie, H., Schweiger, M., Zechner, R. Lipolysis: cellular mechanisms for lipid mobilization from fat stores. Nature Metabolism. 3 (11), 1445-1465 (2021).
  9. Weiss, S. B., Kennedy, E. P., Kiyasu, J. Y. The enzymatic synthesis of triglycerides. The Journal of Biological Chemistry. 235, 40-44 (1960).
  10. Kennedy, E. P. Biosynthesis of complex lipids. Federation Proceedings. 20, 934-940 (1961).
  11. Wendel, A. A., Lewin, T. M., Coleman, R. A. Glycerol-3-phosphate acyltransferases: rate limiting enzymes of triacylglycerol biosynthesis. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 501-506 (2009).
  12. Johansson, S. M., Lindgren, E., Yang, J. N., Herling, A. W., Fredholm, B. B. Adenosine A1 receptors regulate lipolysis and lipogenesis in mouse adipose tissue-interactions with insulin. European Journal of Pharmacology. 597 (1-3), 92-101 (2008).
  13. Gnad, T., et al. Adenosine activates brown adipose tissue and recruits beige adipocytes via A2A receptors. Nature. 516 (7531), 395-399 (2014).
  14. Fried, S. K., et al. Resistance to the antilipolytic effect of insulin in adipocytes of African-American compared to Caucasian postmenopausal women. Journal of Lipid Research. 51 (5), 1193-1200 (2010).
  15. Lee, M. J., Fried, S. K. Optimal protocol for the differentiation and metabolic analysis of human adipose stromal cells. Methods in Enzymology. 538, 49-65 (2014).
  16. Fricke, K., Heitland, A., Maronde, E. Cooperative activation of lipolysis by protein kinase A and protein kinase C pathways in 3T3-L1 adipocytes. Endocrinology. 145 (11), 4940-4947 (2004).
  17. Bergan, H. E., Kittilson, J. D., Sheridan, M. A. PKC and ERK mediate GH-stimulated lipolysis. Journal of Molecular Endocrinology. 51 (2), 213-224 (2013).
  18. Schmitz-Peiffer, C. The tail wagging the dog--regulation of lipid metabolism by protein kinase C. The FEBS Journal. 280 (21), 5371-5383 (2013).
  19. Carmen, G. Y., Victor, S. M. Signalling mechanisms regulating lipolysis. Cellular Signalling. 18 (4), 401-408 (2006).
  20. Zu, L., et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose lipolysis via toll-like receptor 4 and extracellular signal-regulated kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 284 (9), 5915-5926 (2009).
  21. Zhang, H. H., Halbleib, M., Ahmad, F., Manganiello, V. C., Greenberg, A. S. Tumor necrosis factor-alpha stimulates lipolysis in differentiated human adipocytes through activation of extracellular signal-related kinase and elevation of intracellular cAMP. Diabetes. 51 (10), 2929-2935 (2002).
  22. Tan, X., et al. TNF-α downregulates CIDEC via MEK/ERK pathway in human adipocytes. Obesity. 24 (5), 1070-1080 (2016).
  23. Laurencikiene, J., et al. NF-kappaB is important for TNF-alpha-induced lipolysis in human adipocytes. Journal of Lipid Research. 48 (5), 1069-1077 (2007).
  24. van Hall, G., et al. Interleukin-6 stimulates lipolysis and fat oxidation in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 88 (7), 3005-3010 (2003).
  25. Wueest, S., et al. Mesenteric fat lipolysis mediates obesity-associated hepatic steatosis and insulin resistance. Diabetes. 65 (1), 140-148 (2016).
  26. Trujillo, M. E., et al. Interleukin-6 regulates human adipose tissue lipid metabolism and leptin production in vitro. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 89 (11), 5577-5582 (2004).
  27. Kitamura, T., et al. Insulin-induced phosphorylation and activation of cyclic nucleotide phosphodiesterase 3B by the serine-threonine kinase Akt. Molecular and Cellular Biology. 19 (9), 6286-6296 (1999).
  28. Chakrabarti, P., et al. Insulin inhibits lipolysis in adipocytes via the evolutionarily conserved mTORC1-Egr1-ATGL-mediated pathway. Molecular and Cellular Biology. 33 (18), 3659-3666 (2013).
  29. Collins, S., Daniel, K. W., Petro, A. E., Surwit, R. S. Strain-specific response to beta 3-adrenergic receptor agonist treatment of diet-induced obesity in mice. Endocrinology. 138 (1), 405-413 (1997).
  30. Surwit, R. S., Dixon, T. M., Petro, A. E., Daniel, K. W., Collins, S. Diazoxide restores beta3-adrenergic receptor function in diet-induced obesity and diabetes. Endocrinology. 141 (10), 3630-3637 (2000).
  31. Gettys, T. W., et al. Age-dependent changes in beta-adrenergic receptor subtypes and adenylyl cyclase activation in adipocytes from Fischer 344 rats. Endocrinology. 136 (5), 2022-2032 (1995).
  32. Mowers, J., et al. Inflammation produces catecholamine resistance in obesity via activation of PDE3B by the protein kinases IKKε and TBK1. eLife. 2, e01119(2013).
  33. Valentine, J. M., et al. β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 132 (2), e153357(2022).
  34. Collins, S., et al. Impaired expression and functional activity of the beta 3- and beta 1-adrenergic receptors in adipose tissue of congenitally obese (C57BL/6J ob/ob) mice. Molecular Endocrinology. 8 (4), 518-527 (1994).
  35. Collins, S., Surwit, R. S. The beta-adrenergic receptors and the control of adipose tissue metabolism and thermogenesis. Recent Progress in Hormone Research. 56, 309-328 (2001).
  36. Dixon, T. M., Daniel, K. W., Farmer, S. R., Collins, S. CCAAT/enhancer-binding protein alpha is required for transcription of the beta 3-adrenergic receptor gene during adipogenesis. The Journal of Biological Chemistry. 276 (1), 722-728 (2001).
  37. Lohse, M. J., Benovic, J. L., Codina, J., Caron, M. G., Lefkowitz, R. J. beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science. 248 (4962), 1547-1550 (1990).
  38. Nantel, F., et al. The human beta 3-adrenergic receptor is resistant to short term agonist-promoted desensitization. Molecular Pharmacology. 43 (4), 548-555 (1993).
  39. Liggett, S. B., Freedman, N. J., Schwinn, D. A., Lefkowitz, R. J. Structural basis for receptor subtype-specific regulation revealed by a chimeric beta 3/beta 2-adrenergic receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (8), 3665-3669 (1993).
  40. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor agonists at human beta1-, beta2- and beta3-adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 160 (5), 1048-1061 (2010).
  41. Lafontan, M. Inhibition of epinephrine-induced lipolysis in isolated white adipocytes of aging rabbits by increased alpha-adrenergic responsiveness. Journal of Lipid Research. 20 (2), 208-216 (1979).
  42. Baker, J. G. The selectivity of beta-adrenoceptor antagonists at the human beta1, beta2 and beta3 adrenoceptors. British Journal of Pharmacology. 144 (3), 317-322 (2005).
  43. Jensen, M. D., Nielsen, S. Insulin dose response analysis of free fatty acid kinetics. Metabolism. 56 (1), 68-76 (2007).
  44. Jensen, M. D., Haymond, M. W., Gerich, J. E., Cryer, P. E., Miles, J. M. Lipolysis during fasting. Decreased suppression by insulin and increased stimulation by epinephrine. The Journal of Clinical Investigation. 79 (1), 207-213 (1987).
  45. Heckmann, B. L., et al. Defective adipose lipolysis and altered global energy metabolism in mice with adipose overexpression of the lipolytic inhibitor G0/G1 switch gene 2 (G0S2). The Journal of Biological Chemistry. 289 (4), 1905-1916 (2014).
  46. Shin, H., et al. Lipolysis in brown adipocytes is not essential for cold-induced thermogenesis in mice. Cell Metabolism. 26 (5), 764.e5-777.e5 (2017).
  47. Treble, D. H., Mayer, J. Glycerolkinase activity in white adipose tissue of obese-hyperglycaemic mice. Nature. 200, 363-364 (1963).
  48. Possik, E., et al. New mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: role in beta-cell, liver and adipocyte metabolism. Frontiers in Endocrinology. 12, 706607(2021).
  49. Romero Mdel, M., Sabater, D., Fernandez-Lopez, J. A., Remesar, X., Alemany, M. Glycerol production from glucose and fructose by 3T3-L1 cells: a mechanism of adipocyte defense from excess substrate. PLoS One. 10 (10), e0139502(2015).
  50. Mugabo, Y., et al. Identification of a mammalian glycerol-3-phosphate phosphatase: Role in metabolism and signaling in pancreatic beta-cells and hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (4), E430-E439 (2016).
  51. Hanson, R. W., Reshef, L. Glyceroneogenesis revisited. Biochimie. 85 (12), 1199-1205 (2003).
  52. Vaughan, M. The production and release of glycerol by adipose tissue incubated in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 237, 3354-3358 (1962).
  53. Jensen, M. D., Ekberg, K., Landau, B. R. Lipid metabolism during fasting. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 281 (4), E789-E793 (2001).
  54. Ballard, F. J., Hanson, R. W., Leveille, G. A. Phosphoenolpyruvate carboxykinase and the synthesis of glyceride-glycerol from pyruvate in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 242 (11), 2746-2750 (1967).
  55. Reshef, L., Hanson, R. W., Ballard, F. J. A possible physiological role for glyceroneogenesis in rat adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 245 (22), 5979-5984 (1970).
  56. Gorin, E., Tal-Or, Z., Shafrir, E. Glyceroneogenesis in adipose tissue of fasted, diabetic and triamcinolone treated rats. European Journal of Biochemistry. 8 (3), 370-375 (1969).
  57. Elia, M., Zed, C., Neale, G., Livesey, G. The energy cost of triglyceride-fatty acid recycling in nonobese subjects after an overnight fast and four days of starvation. Metabolism. 36 (3), 251-255 (1987).
  58. Reshef, L., et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. Journal of Biological Chemistry. 278 (33), 30413-30416 (2003).
  59. Edens, N. K., Leibel, R. L., Hirsch, J. Mechanism of free fatty acid re-esterification in human adipocytes in vitro. Journal of Lipid Research. 31 (8), 1423-1431 (1990).
  60. Vaughan, M., Steinberg, D. Effect of hormones on lipolysis and esterification of free fatty acids during incubation of adipose tissue in vitro. Journal of Lipid Research. 4, 193-199 (1963).
  61. Brooks, B., Arch, J. R., Newsholme, E. A. Effects of hormones on the rate of the triacylglycerol/fatty acid substrate cycle in adipocytes and epididymal fat pads. Federation of European Biochemical Societies Letters. 146 (2), 327-330 (1982).
  62. Bjorntorp, P., Karlsson, M., Hovden, A. Quantitative aspects of lipolysis and reesterification in human adipose tissue in vitro. Acta Medica Scandinavica. 185 (1-2), 89-97 (1969).
  63. Angel, A., Desai, K., Halperin, M. L. Free fatty acid and ATP levels in adipocytes during lipolysis. Metabolism. 20 (1), 87-99 (1971).
  64. Husted, A. S., et al. Autocrine negative feedback regulation of lipolysis through sensing of NEFAs by FFAR4/GPR120 in WAT. Molecular Metabolism. 42, 101103(2020).
  65. Fain, J. N., Shepherd, R. E. Free fatty acids as feedback regulators of adenylate cyclase and cyclic 3':5'-AMP accumulation in rat fat cells. The Journal of Biological Chemistry. 250 (16), 6586-6592 (1975).
  66. Burns, T. W., Langley, P. E., Terry, B. E., Robinson, G. A. The role of free fatty acids in the regulation of lipolysis by human adipose tissue cells. Metabolism. 27 (12), 1755-1762 (1978).
  67. Kalderon, B., et al. Suppression of adipose lipolysis by long-chain fatty acid analogs. Journal of Lipid Research. 53 (5), 868-878 (2012).
  68. Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods in Enzymology. 538, 171-193 (2014).
  69. Decaunes, P., Bouloumie, A., Ryden, M., Galitzky, J. Ex vivo analysis of lipolysis in human subcutaneous adipose tissue explants. Bio-Protocol. 8 (3), e2711(2018).
  70. Roy, D., Myers, J. M., Tedeschi, A. Protocol for assessing ex vivo lipolysis of murine adipose tissue. STAR Protocols. 3 (3), 101518(2022).
  71. Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads. Journal of Visualized Experiments. 125 (125), 55625(2017).
  72. Reilly, S. M., et al. Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nature Metabolism. 2 (7), 620-634 (2020).
  73. Liu, L., et al. Isolation of mouse stromal vascular cells for monolayer culture. Methods in Molecular Biology. 1566, 9-16 (2017).
  74. DeLuca, J. H., Reilly, S. M. Methods in Molecular Biology. , Springer Nature. (2023).
  75. Richard, G., Vernon, R. A. C. New Perspectives in Adipose Tissue. Butterworth-Heinemann. , (1985).
  76. Brito, M. N., Botion, L. M., Brito, N. A., Kettelhut, I. C., Migliorini, R. H. Lipolysis and glycerokinase activity in brown adipose tissue of rat fed a high protein, carbohydrate-free diet. Hormone and Metabolic Research. 26 (1), 51-52 (1994).
  77. Bertin, R. Glycerokinase activity and lipolysis regulation in brown adipose tissue of cold acclimated rats. Biochimie. 58 (4), 431-434 (1976).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Lipolysesnelheidex vivo-assayin vitro-differentiatievrij vetzuurglycerolvrijgavecolorimetrische assayrunder serumalbuminetriglyceridemobilisatie
Het meten van de snelheid van lipolyse in ex vivo muizenvetweefsel en primaire preadipocyten gedifferentieerd in vitro
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.