Methodenartikel

Ferritinofagie: beoordeling van de selectieve afbraak van ijzer door autofagie in menselijke fibroblasten

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65110

⸱

23 februari 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het uitvoeren van high-throughput, immunofluorescentie-gebaseerde ferritinofagiebeoordelingen in primaire, van de huid afgeleide menselijke fibroblasten.

Samenvatting

Mutaties in het autofagie-gen WDR45/WIPI4 zijn de oorzaak van bèta-propeller-geassocieerde neurodegeneratie (BPAN), een subtype van menselijke ziekten dat bekend staat als neurodegeneratie met ijzeraccumulatie in de hersenen (NBIA) als gevolg van de aanwezigheid van ijzerafzettingen in de hersenen van patiënten. Intracellulaire ijzerspiegels worden strak gereguleerd door een aantal cellulaire mechanismen, waaronder het kritieke mechanisme van ferritinofagie. Dit artikel beschrijft hoe ferritinofagie kan worden beoordeeld in primaire, van de huid afgeleide menselijke fibroblasten. In dit protocol gebruiken we ijzermodulerende voorwaarden voor het induceren of remmen van ferritinofagie op cellulair niveau, zoals de toediening van bafilomycine A1 om de lysosoomfunctie te remmen en ijzerammoniumcitraat (FAC) of deferasiox (DFX) behandelingen om respectievelijk ijzer te overbelasten of uit te putten. Dergelijke behandelde fibroblasten worden vervolgens onderworpen aan high-throughput beeldvorming en CellProfiler-gebaseerde kwantitatieve lokalisatieanalyse van endogene ferritine en autofagosomale/lysosomale markers, hier LAMP2. Op basis van het niveau van autofagosomaal/lysosomaal ferritine kunnen conclusies worden getrokken met betrekking tot het niveau van ferritinofagie. Dit protocol kan worden gebruikt om ferritinofagie te beoordelen in van BPAN-patiënten afgeleide primaire fibroblasten of andere soorten zoogdiercellen.

Inleiding

De WIPI-eiwitten (WD-repeat interaging with phosphoinositides) zijn evolutionair geconserveerde PI3P-effectoren met verschillende rollen in autofagie1. De vier menselijke WIPI-eiwitten (WIPI1 tot en met WIPI4) vouwen zich op tot zevenbladige β-propellers met twee evolutionair geconserveerde regio's waarin homologe en invariante aminozuren clusteren op tegenovergestelde plaatsen van de propeller. Eén plaats is uitgelijnd met het fosfoinositide-bindende gebied in propellerblad 5 en blad 6. De andere plaats is uitgelijnd met het eiwit-eiwitinteractiegebied waar WIPI's associëren met verschillende leden van de autofagiemachinerie of autofagieregulerende factoren2.

WIPI4 functioneert bij het beheersen van energiegedreven autofagieregulatie en op het niveau van het beheersen van de grootte van het groeiende ontluikende autofagosoom3. Een mutatie in het WIPI4-gen , aangeduid als WDR45, is de oorzaak van bèta-propeller-geassocieerde neurodegeneratie (BPAN), een subtype neurodegeneratie met ijzeraccumulatie in de hersenen (NBIA) bij menselijke patiënten dat wordt gekenmerkt door een hypo-intense ijzerhalo in de substantia nigra en globus pallidus4. De aanwezigheid van abnormale ijzerafzettingen bij BPAN-patiënten veroorzaakt neuronale schade die zich vertaalt in encefalopathie, algemene ontwikkelingsachterstand, toevallen en uiteindelijk parkinsonisme, dementie enspasticiteit.

IJzerhomeostase wordt strak gereguleerd door meerdere cellulaire mechanismen, waarbij de concentratie van cytosolisch ijzer wordt gecontroleerd door de expressieniveaus en functionaliteit van ijzerdragers, ijzertransporters en ijzeropslageiwitten6 . De concentratie van cytosolisch ijzer bepaalt op zijn beurt of er afbraakroutes zoals ferritinofagie7 of de proteasomale klaring van geoxideerd ferritine8 bij betrokken zijn.

Tijdens ferritinofagie wordt ferritine selectief gerekruteerd tot autofagosomen door de ladingreceptor NCOA4 en gericht op lysosomale afbraak als reactie op lage intracellulaire ijzerspiegels7. Gezien de rol van WIPI4 bij het reguleren van de grootte van autofagosomale membranen3, is het redelijk om te voorspellen dat het verlies van deze specifieke functie de selectieve sekwestratie van ferritine in autofagosomen en dus ferritinofagie kan beïnvloeden. Het bestuderen van deze belangrijke stap in het ijzermetabolisme kan deuren openen naar therapeutische opties voor BPAN-patiënten; Veelgebruikte protocollen om ferritinofagie in menselijke cellen te bestuderen, worden echter pas nu ontwikkeld.

Dit artikel beschrijft een high-throughput, op fluorescentie gebaseerde methode om ferritinofagie in menselijke cellen te beoordelen. De toepassing van deze test op van de patiënt afkomstige BPAN-cellen kan waardevol inzicht verschaffen in hoe ferritinofagie verschilt in vergelijking met gezonde menselijke cellen en kan dienen als een benchmark voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze zeldzame ziekte bij de mens.

Protocol

1. Kweken en zaaien van primaire cellen

  1. Pak de injectieflacon met bevroren cellen uit de tank met vloeibare stikstof en houd deze op het ijs totdat deze de celkweekruimte bereikt. Houd de injectieflacon in een eerder gesteriliseerde kap in de hand zodat de celsuspensie ontdooit. Resuspendeer de cellen en breng ze over naar een celkweekplaat van 10 cm met 9 ml voorverwarmde DMEM met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en 1% penicilline-streptomycine (P/S). Schud voorzichtig zodat de cellen gelijkmatig over de plaat worden verdeeld en incubeer een nacht bij 37 °C en 5% CO2
  2. Kijk de volgende ochtend naar de cellen om te bevestigen dat ze zijn bevestigd. Verander het medium in verse DMEM + 10% FCS + 1%P/S en laat de cellen groeien tot ze 80% samenvloeiing bereiken.
  3. Verwijder het kweekmedium, was 2x met DPBS, voeg 1 ml trypsine toe aan de plaat en incubeer het gedurende 10 minuten bij 37 °C en 5% CO2 . Voeg 9 ml DMEM + 10% FCS toe aan de plaat en resuspendeer de cellen.
  4. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuisje van 15 ml. Bepaal het celgetal handmatig met behulp van een Neubauer-kamer en verdun de celsuspensie in DMEM + 10% FCS tot een celconcentratie van 40.000 cellen/ml is bereikt.
  5. Zaai in een plaat met 96 putjes in een glasbodem 100 μl/putje van de celsuspensie. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 16 uur.

2. Behandelingen

  1. Bereid de volgende behandelingen voor volgens de materiaaltabel: controlemedium, controlemedium plus deferasiox (DFX) voor ijzerchelatie, of controlemedium plus ijzerammoniumcitraat (FAC) voor ijzerbelasting. Bereid alle behandelingen voor in zowel de aanwezigheid als de afwezigheid van een lysosomale remmer (bafilomycine A1) voor de beoordeling van de ferritinofagieflux.
  2. Verwijder het kweekmedium van de plaat en vervang het door de bijbehorende behandeling (100 μL/putje).
  3. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 6 uur.

3. Fixatie en kleuring

  1. Zuig het behandelingsmedium op en was 2x met DPBS (Tabel met materialen).
  2. Voeg 100 μL 3,7% paraformaldehyde (PFA, materiaaltabel) per putje toe. Fixeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  3. Verwijder de PFA en was de cellen 2x met PBS/T (Tabel met materialen).
  4. Blokkade in PBS/T met 1% runderserumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij 4 °C.
  5. Bereid het primaire antilichaammengsel (materiaaltabel) voor in PBS/T (ferritine-antilichaam 1:50, LAMP2-antilichaam 1:50).
  6. Was de cellen 2x met PBS/T, en breng 50 μL van de antistoffen mix per putje aan. Wikkel de platen in met parafilm en incubeer ze een nacht bij 4 °C.
  7. Bereid de volgende ochtend de mix van secundaire antilichamen (materiaaltabel) (1:200) in PBS/T.
  8. Was de cellen 2x met PBS/T en breng 50 μL van de secundaire antilichaammix per putje aan. Incubeer bij 4 °C gedurende 1 uur in het donker.
  9. Bereid 5 μg/μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, Tabel met materialen) oplossing in PBS op kamertemperatuur.
  10. Was de cellen 2x met PBS/T en voeg 100 μL/putje DAPI-kleuring toe. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  11. Was de cellen 2x met PBS en voeg 50 μL PBS toe aan elk putje. Wikkel de platen in met parafilm en bewaar ze in het donker bij 4 °C.

4. Geautomatiseerde beeldvorming met behulp van confocale laserscanmicroscopie

  1. Vervang de PBS in de plaat door 50 μL verse PBS bij kamertemperatuur.
  2. Dek de plaat af met aluminiumfolie en breng deze naar de microscopiekamer.
  3. Zet de confocale laserscanmicroscoop aan, plaats een monsterhouder voor platen met 96 putjes op de microscooptafel en selecteer een geschikt objectief (hier: 40x). Raadpleeg Tabel 1 voor meer informatie.
  4. Pas de beeldvormingsinstellingen aan (Tabel 1).
    1. Selecteer in Smart Setup de lasers en filters en wijs ze toe aan sporen (sporen 1-3) voor een optimale beeldkwaliteit en snelheid (Tabel 1).
    2. Wanneer u het type experiment selecteert, klikt u op Tegels om de optie in te schakelen om de bepaalde X,Y-posities op de plaat te selecteren en op te slaan.
    3. Visualiseer in de module Imaging Setup de acquisitiekanalen, de tracks die eraan zijn toegewezen en hun excitatie- en emissiegolflengten (Tabel 1).
    4. Selecteer in de module Acquisitiemodus het volgende: Scansnelheid: 6; Richting: bidirectioneel; Gemiddeld: 2x; Bits per pixel: 8.
    5. Pas in de module Kanalen het laservermogen, het gaatje en de hoofdversterking voor elk kanaal afzonderlijk aan (Tabel 2). Verfijn deze parameters om goed belichte beelden te krijgen zonder ze te oververzadigen.
    6. Klik op de module Focusstrategie .
      1. Selecteer Software-autofocus en Definitieve focus combineren.
      2. Selecteer onder Referentiekanaal en offsets het meest stabiele/helderste kanaal als referentie (normaal gesproken DAPI of 488 nm).
      3. Selecteer onder Herhalingen en frequentie van stabilisatiegebeurtenissen de optie Standaard.
    7. Selecteer in de module Software Autofocus het volgende: Modus | Intensiteit; Zoeken | Slim; Bemonstering | Boete; Relatief bereik.
    8. Klik op de module Tegels .
      1. Selecteer Posities | enkele posities.
      2. Navigeer onder Geavanceerde instellingen door de plaat, identificeer een positie voor beeldvorming en klik op de knop + onder het tabblad Positie-instelling .
      3. Label elke positie met aanvullende informatie die wordt vastgelegd op de metadata van de afbeelding. Open hiervoor het tabblad Eigenschappen , klik op het wielpictogram naast het vervolgkeuzemenu Categorie en klik op Nieuw om een nieuw dialoogvenster te openen waarin de nieuwe categorienaam moet worden ingevoerd. Om een categorie aan een bepaalde positie toe te wijzen, selecteert u de positie, klikt u op het tabblad Eigenschappen , gaat u naar het vervolgkeuzemenu Categorieën en selecteert u het bijbehorende label.
        OPMERKING: Het wordt aanbevolen om voor elke behandeling een categorie te maken om elke positie te labelen met de behandeling waaraan de cellen zijn onderworpen.
      4. Selecteer onder Sample Carrier de optie Multiwell 96-Cellvis glasbodem #0. Klik op Kalibreren om de microscoop op het plaatoppervlak te kalibreren. Kies tussen 1-punts of 7-punts kalibratie, afhankelijk van de specificaties van het systeem.
      5. Selecteer onder Opties een tegeloverlapping van 10%. Selecteer onder Reizen in tegelgebieden de optie Kam. Vink het volgende aan: gebruik de fasesnelheid van de fasecontrole, gebruik de faseversnelling van de fasecontrole en de beeldpiramide tijdens de acquisitie.
  5. Voer beeldacquisitie uit en sla de afbeeldingsresultaten (czi-bestanden) en de metagegevens van de afbeelding (csv-bestanden) op een draagbare harde schijf op.
  6. Exporteer de afbeeldingen als TIFF-bestanden.

5. Beeldanalyse met hoge doorvoer

  1. Maak een afzonderlijk spreadsheetbestand met metagegevens met de volgende kolommen: Positie, Well, Voorwaarde, Reeks en Set. De juiste gegevens om deze kolommen te vullen, worden opgehaald uit het originele metadatabestand dat afkomstig is van confocale laserscanmicroscopie.
  2. Download de open-source software CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. Start CellProfiler 4.2.4 door te dubbelklikken en importeer de CellProfiler-pijplijn (aanvullend bestand 1) door te slepen en neer te zetten.
    OPMERKING: Hieronder vindt u de stappen voor het samenstellen van de CellProfiler-pijplijn (aanvullend bestand 1) voor de geautomatiseerde herkenning van fibroblasten met behulp van DAPI-kleuring (Module 1, kernherkenning, zie Tabel 2) en achtergrondfluorescentie in afzonderlijke cellen afgeleid van AF488 (Module 2, celherkenning, zie Tabel 2). De herkenning van puncta (aangeduide objecten) wordt bepaald door de grootte van de puncta en de intensiteit van de puncta-fluorescentie op de achtergrond (module 3, puncta-herkenning, zie tabel 2). Ten slotte worden volgens de celgrenzen de door de software herkende puncta toegewezen aan de overeenkomstige cellen (Relaties toewijzen). Een gedetailleerde beschrijving van hoe een CellProfiler-pijplijn voor autofagiestudies moet worden geïmplementeerd, is eerder gepubliceerd9. Daarnaast bevat Tabel 2 de CellProfiler-instellingen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Bovendien geeft aanvullend bestand 2 de CellProfiler-pijplijn (aanvullend bestand 1) weer met schermafbeeldingen die in opeenvolgende volgorde zijn gemaakt en verwijzen naar de modules die in tabel 2 worden beschreven.
  4. Voordat u de CellProfiler-pijplijn (aanvullend bestand 1) aanpast, sleept u afzonderlijke .czi-afbeeldingsbestanden of een map met meerdere .czi-afbeeldingsbestanden naar de afbeeldingsmodule .
  5. Pas de pijplijn voor beeldherkenning aan. Vervang in de module Namen en typen de c1-c3-code door een code waarmee de software de te analyseren enkelkanaalsafbeeldingen kan identificeren en sorteren.
  6. Stem de pijplijninstellingen voor de modules IdentifyPrimaryObjects en IdentifySecondaryObjects af door de numerieke vermeldingen in de modules te optimaliseren. De waarden die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn weergegeven in tabel 2.
  7. Om de aanpassingen bij te houden, selecteert u de optie Testmodus door op de knop Testmodus starten te klikken. Klik vervolgens op de knop Stap tussen de modules. Wacht op pop-upvensters (de originele invoerafbeelding, de herkenningscontouren die over de originele afbeelding zijn getekend en het analyseresultaat) die laten zien hoe een afbeelding zou worden geanalyseerd met de instellingen die zojuist zijn ingevoerd.
  8. Zodra de pijplijn is geoptimaliseerd, beëindigt u de testmodus. Voer de analyse uit door de testmodus Afsluiten te activeren, gevolgd door op de knop Afbeeldingen analyseren te klikken.
  9. Nadat de analyse is voltooid, controleert u de nauwkeurigheid van de cel- en punctadetectie door de invoerafbeeldingen te vergelijken met de overlay-uitvoer (celgrenzen, puncta) die door CellProfiler is gegenereerd. Indien dit niet het geval is, past u de numerieke waarden in de verschillende modules aan (tabel 2) totdat het analyseresultaat voldoende nauwkeurig is.

6. Analyse van de gegevens

  1. Wacht na het uitvoeren van de analyse tot de software een set tekstbestanden in tabelvorm met de resultaten heeft gemaakt. Als u de meegeleverde CellProfiler-pijplijn (aanvullend bestand 1) gebruikt, zoekt u naar de volgende uitvoerbestanden:
    1. Het bestand CellProfilerOutputCells , dat het afbeeldingsnummer bevat dat door de software is toegewezen, het celnummer dat aan afzonderlijke cellen is toegewezen, de oorspronkelijke bestandsnaam en het pad dat aangeeft waar de bestanden zijn opgeslagen, het aantal puncta (ferritine, LAMP2) per cel en het gemiddelde punctagebied (ferritine, LAMP2) per cel.
    2. Het bestand CellProfilerOutputExperiment , dat informatie bevat over de technische details met betrekking tot het experiment (bijv. de softwareversie, de afbeeldingskanalen, de metagegevenstags).
  2. Open deze bestanden als spreadsheets.
  3. Ga verder met het uitvoeren van de statistische analyse van de puncta-tellingen en puncta-co-lokalisatienummers met behulp van de voorkeursstatistieksoftware (Materiaaltabel).

Resultaten

Van de menselijke huid afgeleide primaire fibroblasten (F-CO-60) van gezonde donoren (Figuur 1A) werden voorbereid voor ferritinofagiebeoordelingen met behulp van baflomycine A1-behandeling, gevolgd door immunokleuring van endogene ferritine en LAMP2, geautomatiseerde beeldanalyse en op CellProfiler gebaseerde analyse (Figuur 1B).

De colokalisatie van endogene ferritine en LAMP2 nam toe nadat de lysosomale afbraak van ferritine werd geblokkeerd door de toevoeging van bafilomycine A1, in overeenstemming met zijn vermogen om lysosomale V-ATPase-enzymen te remmen en zo ferritinofagie7 te blokkeren (Figuur 2). Daarnaast worden de softwarematige celherkenning, evenals de ferritine- en LAMP2-herkenning, als voorbeeld getoond (Figuur 2).

In dit verband moet worden opgemerkt dat de hier geschetste CellProfiler-pijplijn uiterst veelzijdig is en kan worden aangepast aan aanvullende en/of alternatieve uitlezingen, bijvoorbeeld om de effecten van bepaalde BPAN-mutaties op celgroei, mitochondriën of andere organellen te beoordelen in de context van functionele eencellige markersystemen.

figure-results-1
Figuur 1: Experimenteel overzicht. Grafische weergave van (A) het proces van ferritinofagie en (B) de experimentele workflow om ferritinofagie te beoordelen in primaire huid-afgeleide menselijke fibroblasten, zoals beschreven in dit protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve afbeeldingen. Primaire van de huid afgeleide menselijke fibroblasten in controlemedium (gevoede omstandigheden) in de (A) afwezigheid of (B) aanwezigheid van bafilomycine A1 werden onderworpen aan een indirecte immunofluorescentieanalyse met behulp van anti-ferritine en anti-LAMP2-antilichamen, terwijl de celkernen werden gekleurd met DAPI. Er worden voorbeeldige fluorescentiebeelden gepresenteerd die zijn verkregen met confocale laserscanmicroscopie-automatisering (schaalbalken: 10 μm). Veranderingen in de abundantie en colokalisatie van ferritine en LAMP2 konden worden waargenomen bij lysosomale remming bij toediening van bafilomycine A1. De op CellProfiler gebaseerde analyse wordt ook weergegeven, met de software-afgeleide beeldoverlays van celherkenning (paars), kernen (blauw), ferritine (groen), LAMP2 (rood) en co-lokaliserende ferritine/LAMP2 (geel) puncta. (C) Vergrote beeldsecties (schaalbalk = 10 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: De confocale laserscanmicroscopie-instellingen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: De numerieke CellProfiler-instellingen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: De CellProfiler-pijplijn die in dit onderzoek is gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Weergave van de CellProfiler-pijplijn (zie aanvullend bestand 1) met schermafbeeldingen die in opeenvolgende volgorde zijn gemaakt (zie tabel 2). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Deze methode, die gebruikmaakt van geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie in combinatie met open-access CellProfiler-gebaseerde beeldanalyse9 om de intracellulaire lokalisatie van belangrijke ferritinofagiefactoren te beoordelen, is ontworpen om waardevolle informatie te verstrekken over de werkzaamheid van lysosomale ferritineklaring via selectieve autofagie, ook wel ferritinofagiegenoemd 7. Dit protocol maakt het mogelijk om grote monstersets met meerdere cellijnen en behandelingen tegelijk te hanteren en om gewenste uitlezingen te beoordelen, zoals ferritine puncta-getallen en ferritine puncta-getallen die colocaliseren met LAMP2, wat een typische lysosomale marker is voor het beoordelen van de ferritinofagieflux. Hier moet echter worden benadrukt dat nauwkeurige, geautomatiseerde beeldanalyse afhangt van de beeldkwaliteit, die op zijn beurt afhangt van de specificiteit van het antilichaam en de optimale beeldvorming. Daarom mag softwarematige beeldanalyse alleen worden uitgevoerd met afbeeldingen van hoge kwaliteit.

De modulatie van het ijzergehalte in cellen kan waardevolle informatie opleveren over de mechanismen die worden geactiveerd om de ijzerhomeostase in de context van ziekte te reguleren. Dit artikel beschrijft een methode om BPAN-ziekten te bestuderen in cellen van patiënten die zijn behandeld met ijzerladende en ijzerchelaatvormers. Deferasiox (DFX) is een bekende ijzerchelator die op grote schaal wordt gebruikt in het veld10. Bij het aanbrengen vangt het het vrije ijzer op in het cytoplasma en veroorzaakt het een cellulaire reactie op ijzeruithongering. Aangezien het doel van deze studie was om ferritinofagie te beoordelen, was het beroven van de cellen van ijzer een eenvoudige manier om de afbraak van ferritine via autofagie te bevorderen als een compensatiemechanisme om de cellulaire ijzerpool aan te vullen. IJzerammoniumcitraat (FAC) daarentegen wordt gebruikt om cellen met ijzer te laden. Cellen activeren de ferritinesynthese als reactie op te hoge en dus toxische cytosolische ijzerconcentraties11. IJzerammoniumcitraat bevordert dus de ferritinesynthese en de insluiting van ijzer in de ferritine-heteropolymeren, die op hun beurt ferritinofagie kunnen activeren.

Om de ferritinofagische flux te bestuderen, kleuren we in dit protocol selectief de belangrijkste spelers in het proces - ferritine en de lysosomen (hier gemarkeerd door LAMP2) - en beoordelen we hun colokalisatie. Een hoog percentage colokaliserende puncta is een indicatie van effectieve lysosomale afbraak van ferritine. Om de informatie die uit dergelijke experimenten wordt gehaald te maximaliseren, kunnen extra kleurstoffen of markerantilichamen worden gebruikt.

Merk op dat er technische uitdagingen zijn die inherent zijn aan deze methode. Primaire fibroblasten afkomstig van verschillende menselijke donoren kunnen zich in vitro vermenigvuldigen en anders groeien. Daarom moeten voor vergelijkbare resultaten verschillende cellen bij dezelfde doorgang worden gezaaid. Daarom is het raadzaam om een testexperiment uit te voeren voordat u verder gaat met dit protocol om de verdubbelingstijden van de te gebruiken cellen of cellijnen te onderzoeken.

Deze methode is niet beperkt tot de studie van ferritinofagie; Door simpelweg de gebruikte behandelingen en antilichamen te veranderen, kan het opnieuw worden gebruikt om verschillende andere selectieve autofagieroutes te beoordelen; mitofagie kan bijvoorbeeld worden onderzocht door CCCP te gebruiken als mitochondriale stressinductor en optineurine-, LC3- en LAMP2-antilichamen voor de kleuring12.

Over het algemeen vormt de combinatie van geautomatiseerde beeldacquisitie en CellProfiler-analyse een krachtig hulpmiddel voor de high-throughput functionele beoordeling van afzonderlijke menselijke fibroblasten. Dit is vooral relevant voor het bestuderen van ziekten bij de mens, waarvoor de analyse en vergelijking van grote cohorten van patiëntcellen en gezonde donorcellen van groot belang zijn.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Duitse Onderzoeksstichting) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (project E03). Figuur 1 is gemaakt met behulp van BioRender.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cellijnen
Primaire huid-afgeleide humane fibroblasten Huidbiopsie, gezonde menselijke donor, Biobank University Clinic Tübingen, Ethische goedkeuring 389/2019BO2F-CO-60, passage 9
Celcultuur behandelingenEindconcentratie (verbinding)
ControlemediumDMEM 10%FCS(alleen DMSO)
Controlemedium + bafilomycineA1DMEM 10%FCS100 nM bafilomycine A1
Controlemedium + deferasiox (DFX)DMEM 10%FCS30 µM DFX
Controlemedium + DFX + bafilomycineA1DMEM 10%FCS30 µM DFX, 100 nM bafilomycine A1
Controlemedium + ferric ammonium citrate (FAC)DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC
Controlemedium + FAC + bafilomycineA1DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomycine A1
Materiaal
Albumine [BSA] Fractie VAppliChemA1391
Alexa 488 geit a-konijnLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 geit a-muisLife TechnologiesA-11003
Bafilomycine A1Sigma Aldrich196000
BioLite Celcultuur behandelde 10cm schotelsThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS geen calcium noch magnesiumGibco14190094
Foetaal bovien serum (FCS)Gibco10437-028
Ferric ammonium citrate (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITINE (Menselijke Milt)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco’sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U/mL penicilline, 100 mg/mL streptomycine)Life Technologies15140-122
Trypsin-EDTA (0,05%) met fenol roodGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 wel glasbodem #0 platenCellvisP96-0-N
Oplossing
3,7% paraformaldehyde (PFA)PFA opgelost in PBS, pH 7,5 
Bafilomycine A1 100 mM stockBafilomycine A1 verdund in DMSO
Ferric ammonium citrate (FAC) 100 mg/mL stockFAC verdund in geautoclaveerde gedistilleerd water
PBS/TPBS, aangevuld met 10% Tween20 
PBS/T + BSAPBS, aangevuld met 10% Tween20, 1% BSA 
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel Versie 16.50Microsoft Office Plus 365

Referenties

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
  6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

Herprints en machtigingen

Tags

IJzerhomeostaselysosomale ferritine afbraakautofagie genmutatiehigh throughput imagingconfocale microscopieCellProfiler analyseimmunokleuringLAMP2 marker
Ferritinofagie: beoordeling van de selectieve afbraak van ijzer door autofagie in menselijke fibroblasten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.