Methodenartikel

Een muisoormodel voor allergische contactdermatitis evaluatie

DOI:

10.3791/65120

⸱

24 maart 2023

 ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital of Yangzhou University, Yangzhou University, 2Department of Traditional Chinese and Western Medicine, Medical College, Yangzhou University, 3The Key Laboratory of Syndrome Differentiation and Treatment of Gastric Cancer of the State Administration of Traditional Chinese Medicine, Yangzhou University, 4Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases, Yangzhou University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de methoden voor het induceren van allergische contactdermatitis in muizenoren door 1-fluor-2,4-dinitrobenzeen (DNFB) en hoe de ernst van allergische contactdermatitis te evalueren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huid is de eerste verdedigingslinie van het menselijk lichaam en een van de meest blootgestelde organen aan milieuchemicaliën. Allergische contactdermatitis (ACD) is een veel voorkomende huidziekte die zich manifesteert als een lokale uitslag, roodheid en huidlaesies. Het optreden en de ontwikkeling van ACD worden beïnvloed door zowel genetische als omgevingsfactoren. Hoewel veel wetenschappers de afgelopen jaren een reeks modellen van ACD hebben geconstrueerd, zijn de experimentele protocollen van deze modellen allemaal verschillend, wat het voor lezers moeilijk maakt om ze goed vast te stellen. Daarom is een stabiel en efficiënt diermodel van groot belang om de pathogenese van atopische dermatitis verder te bestuderen. In deze studie beschrijven we een modelleringsmethode met behulp van 1-fluor-2,4-dinitrobenzeen (DNFB) om ACD-achtige symptomen in de oren van muizen te induceren en beschrijven we verschillende methoden voor het beoordelen van de ernst van dermatitis tijdens het modelleren. Dit experimentele protocol is in sommige experimenten met succes toegepast en heeft een zekere stimulerende rol op het gebied van ACD-onderzoek.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Allergische contactdermatitis (ACD) is een veel voorkomende huidziekte die wordt gekenmerkt door eczeemachtige symptomen op de contactplaats, oedeem en erytheem in matige gevallen, en papels, erosie, exsudatie of zelfs enorme littekens in ernstige gevallen1. Het treft tot 20% van de bevolking en kan mensen van elke leeftijd2 treffen. ACD komt vaak voor bij personen die herhaaldelijk zijn blootgesteld aan allergenen en kan worden veroorzaakt door de immuunrespons van het individu op een of meer allergenen in hun huis of werkplek3. Type IV vertraagde overgevoeligheid wordt beschouwd als het belangrijkste type immuunrespons in ACD4. In delen van de huid die herhaaldelijk zijn blootgesteld aan allergenen, hopen circulerende geheugen-T-cellen zich in grote aantallen op en induceren immuun- en ontstekingsreacties 3,5,6. Het doel van dit werk is om een betrouwbare laboratoriumtechniek voor te stellen voor verder onderzoek naar immunologische en ontstekingsreacties bij de ontwikkeling van ACD.

Het begin van ACD is meestal te wijten aan contactovergevoeligheid veroorzaakt door herhaalde blootstelling aan chemicaliën. Talrijke onderzoekers hebben in de loop van de afgelopen decennia verschillende ACD-diermodellen ontwikkeld in huismuizen7,8, cavia's 9,10 en andere dieren om het begin van de ziekte te simuleren. De meeste experimentele methoden bestaan uit twee fasen: abdominale sensibilisatie (inductie) en het geven van prikkels op de rug of de oorlel (stimulatie). Veel gebruikte chemische stoffen zijn voornamelijk 1-fluor-2,4-dinitrobenzeen (DNFB)/1-chloor-2,4-dinitrobenzeen (DNCB)8,9,11, oxazolon 12, urushiol 13, enz. Onder hen zijn DNFB en DNCB de meest gebruikte, voor het eerst gemeld in oktober 195810. Het nikkelsensibilisatiemodel14 en de fotoallergische contactdermatitis model15 worden ook vaak gebruikt.

We presenteren een experimentele methode voor het bouwen van het ACD-model. Deze methode wordt samengevat en geoptimaliseerd op basis van eerdere studies en na vergelijking met meerdere experimenten. In vergelijking met andere ACD-modellen heeft dit model enkele voordelen, zoals kleine individuele verschillen, korte experimentele perioden, een kleine hoeveelheid chemische stimulatie, enz. Bovendien is deze studie van toepassing op muizen, die niet alleen economisch zijn, maar ook meer opties hebben voor gen-knock-out of transgene muizenvoorbereiding16. We beschrijven ook de verschillende methoden die worden gebruikt om de ACD-voortgang in het experiment te volgen, zoals het meten van de oordikte, het gebruik van Evans blauwe kleurstof om inflammatoire exsudatie te meten, enz. Dit model kan niet alleen muizenoren, bloed, milt en andere monsters analyseren met laboratoriummiddelen om de pathogenese van ACD te verkennen, maar is ook van toepassing op de preklinische evaluatie van nieuwe therapeutische methoden, die een bepaalde promotionele betekenis heeft.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle verzorging en behandeling van de muizen waren in overeenstemming met de richtlijnen die zijn vastgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committee van Yangzhou University en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee onder de projectlicentie SYXK (SU) 2022-0044. BALB/c mannelijke en vrouwelijke muizen van 6-8 weken oud werden gebruikt in deze studie. Elke groep bestond uit zes muizen (zie Materiaaltabel). De kooien werden geplaatst in een temperatuurgeregelde kamer (22 ± 2 °C, 12 uur licht/donker cyclus) met vrije toegang tot voedsel en water. Een experimenteel stroomdiagram is weergegeven in figuur 1.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Begin met het modelleren na 1 week acclimatisatie aan de omgeving.
  2. Gebruik een ultraviolette lamp en 75% alcoholdesinfectiemiddel om de omgeving en het aanrecht te reinigen en te desinfecteren voordat u de muizen manipuleert.
    OPMERKING: Om de invloed van externe factoren te voorkomen, kan het markeren van de muizen voor identificatie niet op het muizenoor worden uitgevoerd; Vlekken op de rug of op de staart kunnen als alternatief worden gebruikt.
  3. Gebruik een klein wattenstaafje om zeepsop op de buik van de muizen aan te brengen (ongeveer 1-2 cm2 groot). Scheer het gebied in de richting van de haargroei met een mesje of scheerapparaat (zie materiaaltabel) aan het begin van het modelleren (dag 0; Figuur 2A).
    OPMERKING: Het gebruik van een recht scheermesje voor ontharing vereist een bekwame operator. Als het niet correct wordt uitgevoerd, kan dit huidirritatie veroorzaken. Overweeg het gebruik van ontharingscrème, tondeuses of een veiligheidsscheermes voor ontharing.
  4. Weeg de muis en vergelijk de gewichtsveranderingen tussen elke groep.

2. Abdominale sensibilisatie stimulatie

  1. Zorg voor het volledige herstel van eventuele kleine verwondingen aan de buikhuid veroorzaakt door scheren. Breng abdominale sensibilisatie aan 2 dagen na het scheren (dag 2).
  2. Bereid de 0,5% DNFB-oplossing: verdun DNFB met een aceton:olijfoliemengsel in een verhouding van 4:1 (bijv. 400 μL aceton gemengd met 100 μL olijfolie; zie materiaaltabel). Gebruik een pipetpistool om te blazen en meng 20 keer om de DNFB-oplossing grondig te mengen. Voor elke toediening van DNFB-oplossing aan de muis, blaas en meng het drie tot vijf keer.
    OPMERKING: Bereid de oplossing voor gebruik en wikkel deze in aluminiumfolie om deze te beschermen tegen direct zonlicht.
  3. Breng 25 μL van de 0,5% DNFB-oplossing aan op de huid van het geschoren gebied op de buik van de muizen met een pipettor (figuur 2B).
  4. Druppel de DNFB-oplossing over het midden van het scheergebied van de buik en spreid deze lichtjes uit met de gladde kant van de pipetterpunt om deze gelijkmatig te verspreiden.
  5. Plaats de muizen 30 s na DNFB-stimulatie in lege kooien zonder beddengoed om te voorkomen dat ze de DNFB-oplossing afwrijven. Wanneer de DNFB-oplossing volledig droog is (ongeveer 2 minuten), brengt u de muizen terug naar hun oorspronkelijke kooi.
  6. Draag handschoenen bij het hanteren van de DNFB-oplossing omdat deze sterk irriterend is voor de menselijke huid.

3. Oorsensibilisatie stimulatie

  1. Bereid een 0,2% DNFB-oplossing zoals hierboven, de mediumoplossing (een 4:1 mengsel van aceton en olijfolie) en zuiver water.
  2. Richt het muislichaam en maak de buitenrand van de oorschelp tijdens de hele operatie naar beneden gericht om te voorkomen dat de oplossing tijdens DNFB-stimulatie de gehoorgang binnendringt.
  3. Gebruik op dag 4, 6, 8 en 10 een pipettor om 20 μL van de 0,2% DNFB-oplossing of mediumoplossing langzaam en gelijkmatig aan te brengen op het binnenoppervlak van de linker oorschelpen van de muizen. Om te voorkomen dat de DNFB-oplossing in de gehoorgang terechtkomt, gebruikt u de gladde kant van de pipettorpunt om de DNFB-oplossing tijdens de toediening voorzichtig te verdelen. Laat de rechteroren onbehandeld (figuur 2C).
  4. Wacht tot de DNFB-oplossing droog is en plaats de muizen terug in de kooi (ongeveer 30 s).
  5. Draag handschoenen bij het hanteren van de DNFB-oplossing.

4. Registratie van muisgewicht en ACD-symptomen

  1. Weeg de muis elke dag, begin op dag 1 en vergelijk met het overeenkomstige gewicht op dag 0; evalueer het effect van ACD op het lichaamsgewicht van muizen als gewichtsverandering (g) ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
  2. Maak foto's met hoge resolutie van de oren van de muis om de klinische symptomen van ACD elke 2 dagen vast te leggen, te beginnen op dag 1.

5. Meting van de dikte van de oorschelp

  1. Meet de dikte van de oorschelp om de 2 dagen, te beginnen op dag 1. Meet en registreer beide oren in detail.
  2. Gebruik vernier remklauwen (zie materiaaltabel) om de dikte van de oorschelp elke dag op hetzelfde tijdstip te meten voor nauwkeurige resultaten (figuur 3A). Stop de remklauwen van de vernier om naar binnen te blijven klemmen wanneer er een lichte verstopping is, om weefselschade aan het muizenoor te voorkomen. Houd de positie vast en noteer de gegevens.
  3. Verzamel de dikte van drie verschillende locaties op elke oorschelp (figuur 3B). Noteer het gemiddelde van de drie gegevens als een geldige waarde. Evalueer de zwelling van het oor in micrometers (μm) ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).

6. Evaluatie van de mate van inflammatoire zwelling

  1. Bereid 0,5% Evans blauwe kleurstof (zie tabel van materialen) oplossing: verdun Evans blauwe kleurstof met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op dag 11. Draag te allen tijde een laboratoriumjas en handschoenen, omdat Evans blauwe kleurstof licht giftig is voor mensen.
  2. Immobiliseer de muizen met een fixator: open het deksel van de fixator (zie Tabel met materialen), houd de muizenstaart vast, maak de kop van de muis naar de fixator en laat de muis instinctief in de fixator klimmen. Bedek het deksel, laat de muizenstaart uit het gat op het deksel komen en pas de lengte van de fixator aan om de hele muizenstaart bloot te leggen.
  3. Veeg de staart herhaaldelijk af met een alcoholwatje of week het gedurende 30 s in warm water en knijp voorzichtig in de wortel van de staart om de aderen aan beide zijden te vullen en uit te breiden. Voer de injectie uit onder de bestraling van een koude lichtbron.
  4. Injecteer Evans blue dye-oplossing langzaam in de muizenstaartader met behulp van een insulinenaald van 1 mm. Wacht 15 minuten en maak dan foto's van de muizenoren.
    OPMERKING: Leg de muis op de tafel en houd deze voorzichtig vast om het oorgebied bloot te leggen voor beeldacquisitie. Kort na injectie met de Evans blauwe kleurstofoplossing en het observeren van overeenkomstige indicaties, gebruik cervicale dislocatie om de muis te euthanaseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onder herhaalde DNFB-stimulatie vertoonden de muizenoren van de DNFB-groep duidelijke klinische symptomen vergelijkbaar met ACD, met gevoelige gebieden die de typische symptomen van roodheid, droogheid en zelfs erosie en exsudatie vertoonden. Toediening van zuiver water door het oor (controlegroep) of oplosmiddelcontrole (mediumgroep) veroorzaakte echter geen vergelijkbare symptomen (figuur 4).

Ondertussen nam in de DNFB-groep, vergeleken met het onbehandelde rech...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol voor het induceren van ACD-achtige symptomen in de oren van muizen kan worden gebruikt om de pathofysiologie van ACD te bestuderen en als een screeningsinstrument voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen.

Er zijn twee belangrijke stappen om een ACD-model op te stellen: initiële sensibilisatie en daaropvolgende stimulatie. De buik is meestal de plaats van initiële sensibilisatie, maar de daaropvolgende stimulatieplaats werd iets anders gekozen. Eerdere studies...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC) aan N.-N. Y. (81904212); Jiangsu Traditionele Chinese Geneeskunde Wetenschap en Technologie Project (YB201995); en het Special Funding Project voor postdoctorale onderzoekers in China (2020T130562).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-Fluoro-2,4-dinitrobenzeen (DNFB)Merck200-734-31-Fluoro-2,4-dinitrobenzeen, ≥99%
AcetonSinopharm Chemical Reagent Co. LTD10000418≥99,5%
Aluminiumfolie CleanwrapCF-2
Evans blauwe kleurstofSolarbio314-13-6Kleurstofgehalte ca. 80%
MuisfixatorZHUYANBANGGEGD-SM1830
OlijfolieSolarbio8001-25-0500 ml
PipettipBiofountFT-20010 - 200 μl
PipettorEppendorf AG312300025020 - 200 μl
VeiligheidsscheermesjeShanghai Gillette Co. LTD74-S
SluithoogtemeterDelixi ElectricDECHOTVCS1200

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children. Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).
  2. Koppes, S. A., et al. Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis. Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).
  3. Martin, S. F., et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).
  4. Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J. Allergic contact dermatitis. International Immunopharmacology. 2 (2-3), 201-211 (2002).
  5. Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
  6. Gamradt, P., et al. Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).
  7. Fraginals, R., Blasi, N. A., Lepoittevin, J. P., Benezra, C. A successful murine model for contact sensitization to a sesquiterpene-alpha-methylene-gamma-butyrolactone: sensitization to alantolactone in four strains of mice. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (3), 473-477 (1991).
  8. Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).
  9. Polak, L., Scheper, R. J. Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).
  10. Witten, V. H., March, C. H. Studies of the mechanism of allergic eczematous contact dermatitis. II. Use of C14 labelled 2:4-dinitrochlorobenzene in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 31 (2), 97-102 (1958).
  11. Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice. The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).
  12. Rubic-Schneider, T., et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).
  13. Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol. The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).
  14. Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).
  15. Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).
  16. Qiu, Z., et al. A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis. The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397(2022).
  17. Kim, H., et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice. Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).
  18. Zhou, P., et al. Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice. Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).
  19. Donglang, G., et al. Comparative study on different skin pruritus mouse models. Frontiers in Medicine. 8, 630237(2021).
  20. Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis. Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DNFB inductiediermodelmeting van ooroedeemEvans Blue kleurstofoordikteinflammatoire zwellingmiltindexpreklinische evaluatie

Gerelateerde artikelen