Methodenartikel

Antisense oligonucleotiden als hulpmiddel voor langdurige knockdown van nucleaire lncRNA's in menselijke cellijnen

DOI:

10.3791/65124

⸱

1 september 2023

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer, Instituto Nacional de Cancerología-Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnológico de Monterrey

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de functie van lncRNA's in tijdsafhankelijke processen zoals chromosomale instabiliteit te analyseren, moet een langdurig knockdown-effect worden bereikt. Daartoe wordt hier een protocol gepresenteerd dat gemodificeerde antisense-oligonucleotiden gebruikt om gedurende 21 dagen een effectieve knockdown in cellijnen te bereiken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) spelen een sleutelregulerende rol in genexpressie op transcriptieniveau. Experimenteel bewijs heeft aangetoond dat een aanzienlijk deel van het lncRNA zich bij voorkeur ophoopt in de kern. Voor de analyse van de functie van nucleaire lncRNA's is het belangrijk om deze transcripten in de kern efficiënt uit te schakelen. In tegenstelling tot het gebruik van RNA-interferentie, een technologie die afhankelijk is van de cytoplasmatische uitschakelingsmachinerie, kan een antisense-oligonucleotide (ASO)-technologie RNA-knockdown bereiken door RNase H te rekruteren naar de RNA-DNA-duplexen voor nucleaire RNA-splitsing. In tegenstelling tot het gebruik van CRISPR-Cas-tools voor genoomengineering, waar mogelijke veranderingen in de chromatinetoestand kunnen optreden, maken ASO's de efficiënte knockdown van nucleaire transcripten mogelijk zonder het genoom te wijzigen. Desalniettemin is een van de grootste obstakels voor ASO-gemedieerde knockdown het tijdelijke effect. Voor de studie van langdurige effecten van lncRNA-uitschakeling is een efficiënte knockdown voor een lange tijd nodig. In deze studie werd een protocol ontwikkeld om gedurende meer dan 21 dagen een knockdown-effect te bereiken. Het doel was om de cis-regulerende effecten van lncRNA-knockdown op het aangrenzende coderende gen RFC4 te evalueren, dat verband houdt met chromosomale instabiliteit, een aandoening die alleen wordt waargenomen door tijd en celveroudering. Er werden twee verschillende menselijke cellijnen gebruikt: PrEC, normale primaire prostaatepitheelcellen, en HCT116, een epitheelcellijn geïsoleerd uit colorectaal carcinoom, die een succesvolle knockdown in de geteste cellijnen bereikte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het overgrote deel van het menselijk genoom wordt getranscribeerd, wat aanleiding geeft tot een grote verscheidenheid aan transcripten, waaronder lncRNA's, die in aantal het aantal geannoteerde coderende genen in het menselijke transcriptoom overschrijden1. LncRNA's zijn transcripten langer dan 200 nucleotiden die niet coderen voor eiwitten 2,3 en die onlangs zijn onderzocht op hun belangrijke regulerende functies in de cel4. Het is aangetoond dat hun functies afhankelijk zijn van hun subcellulaire lokalisatie5, zoals de kern waar een aanzienlijk deel van de lncRNA's zich ophoopt en actief deelneemt aan transcriptieregulatie6 en voor het onderhoud van de nucleaire architectuur7, naast andere biologische processen 8,9,10.

Voor de functionele karakterisering van nucleaire lncRNA's moeten methoden worden gebruikt die in staat zijn om knockdown (KD) in de kern te induceren, en ASO's zijn een krachtig hulpmiddel om nucleaire transcripten tot zwijgen te brengen. Over het algemeen zijn ASO's enkelstrengs DNA-sequenties met een lengte van ~ 20 basenparen die binden aan complementair RNA door Watson-Crick-basenparen 11,12,13 en de functie van het RNA kunnen wijzigen via mechanismen die afhankelijk zijn van hun chemische structuur en modificaties 13,14. ASO-chemiemodificaties kunnen worden onderverdeeld in 2 hoofdgroepen: backbone-modificaties en 2' suikerringmodificaties15, die beide bedoeld zijn om de stabiliteit te vergroten door een hoge resistentie tegen nucleasen te verlenen, maar ook om het beoogde biologische effect te versterken13,16. Onder de backbone-modificaties worden fosforamidaatmorfolino (PMO), thiofosphoramidaat en morfolinobindingen veel gebruikt voor doeleinden zoals interferentie bij splicing17,18 door te dienen als sterische blokkers19, maar niet om degradatie van het transcript te induceren. Een andere modificatie van de ruggengraat is de fosforothioaat (PS)-binding, een van de meest gebruikte modificaties in ASO's. In tegenstelling tot de eerder genoemde wijzigingen, interfereren PS-bindingen niet met RNase H-rekrutering12,20, waardoor RNA-knockdown mogelijk is. Er is echter ook een grote verscheidenheid aan 2' suikerringmodificaties21; niettemin, met het oog op RNA-knockdown, behoren tot de modificaties die efficiënte uitschakelingseffecten induceren, gesloten nucleïnezuren (LNA's)22, 23 en 2'-O-methylmodificatie24. Hoewel LNA's hebben bewezen zeer effectief te zijn voor knockdown in vergelijking met andere modificaties25, kunnen ze ongewenste effecten veroorzaken zoals hepatotoxiciteit26 en apoptose-inductie in vivo en in vitro27.

Met het oog op RNA-knockdown kunnen ASO's met de juiste modificaties die eerder zijn genoemd, RNase H1 en H2 20,28 rekruteren, en deze enzymen worden gerekruteerd voor DNA-RNA-hybriden en splitsen het doel-RNA, waardoor de ASO13 vrijkomt. De RNA-producten van deze splitsing worden vervolgens verwerkt door de RNA-bewakingsmachine, wat resulteert in RNA-degradatie29 zonder het genomische gebied van belang te wijzigen, in tegenstelling tot andere technieken zoals CRISPR-Cas-systemen, waar modificaties in de chromatinetoestand ongewenste biologische effecten kunnen veroorzaken30. Ondanks de voordelen van ASO-technologie zijn de tijdelijke uitschakelingseffecten als gevolg van celdeling of ASO-degradatie in de loop van de tijd een obstakel dat moet worden overwonnen bij het bestuderen van tijdsafhankelijke processen zoals chromosomale instabiliteit (CIN)31.

In het bijzonder wordt CIN gedefinieerd als een verhoogde snelheid van veranderingen in het aantal en de structuur van chromosomen in vergelijking met die van normale cellen32 en komt voort uit fouten in de chromosoomscheiding tijdens mitose, wat leidt tot genetische veranderingen die in de loop van de tijd intratumorheterogeniteit veroorzaken33. CIN kan dus niet alleen worden geëvalueerd door een aneuploïde karyotype te vinden. Voor de juiste studie en evaluatie van CIN in celcultuur is het belangrijk om de cellen in de loop van de tijd te volgen. Voor onderzoek naar de effecten van een lncRNA KD op CIN is een methodologie nodig die een langdurig KD-effect mogelijk maakt. Voor dit doel werden ASO's gebruikt in dit protocol, waarbij lncRNA-RFC4 met succes werd uitgeschakeld in de menselijke cellijnen HCT115 en PrEC gedurende respectievelijk 18 en 21 dagen. Dit transcript is een niet-gekarakteriseerd lncRNA van 1,2 kb lang en de genomische locatie bevindt zich op chromosoom 3 (q27.3). Het grenst aan het eiwitcoderende gen RFC4, een gen dat geassocieerd is met CIN bij verschillende soorten kanker bij de mens 34,35,36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Dit protocol is alleen bedoeld om te worden uitgevoerd door laboratoriumpersoneel met ervaring in laboratoriumveiligheidsprocedures. Het is essentieel om de veiligheidsinformatiebladen van alle reagentia en materialen die in dit protocol worden gebruikt, goed te lezen voordat u begint met het hanteren van gevaarlijke materialen en apparatuur. Het is essentieel om alle veiligheidseisen die zijn aangegeven in het laboratoriumveiligheidshandboek van uw instelling gedurende het hele protocol te lezen, te begrijpen en na te leven. De verwijdering van al het biologische en chemische afval moet worden uitgevoerd volgens het handboek voor afvalbeheer en -verwijdering van de instelling. Als er niet met zorg en volgens veilige laboratoriumpraktijken met materialen en apparatuur wordt omgegaan, kunnen materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, ernstig letsel veroorzaken. Volg altijd de handleiding en veiligheidsprocedures van de instelling voor veiligheidslaboratorium.

1. Ontwerp van ASO's

  1. Ontwerp ASO's handmatig zoals hieronder beschreven.
    1. Verkrijg de volledige sequentie van het doeltranscript en analyseer deze in de RNAfold WebServer, Universiteit van Wenen37 (Materiaaltabel), met behulp van de standaardparameters op de website om de secundaire structuur met minimale vrije energie (MFE) te verkrijgen.
    2. Wanneer de resultaten klaar zijn, gaat u naar MFE gewone structuurtekening en klikt u op Weergeven in Forna om de MFE secundaire structuur op de website te openen, en de software toont de voorspelde secundaire structuur van het geanalyseerde transcript.
    3. Selecteer uit de voorspelde MFE secundaire structuur een gebied met een lengte van 20 bp in het RNA, waarbij G-strings (sequenties van 3 guanines op een rij) worden vermeden bij het ontwerpen van de oligonucleotiden. Gebruik voor de selectie van het beste doelgebied voor de ASO de regio's waarvan wordt voorspeld dat ze een lagere kans op interne basenparing hebben (Figuur 1).
    4. Maak uit het geselecteerde gebied van 20 bp de omgekeerde complementreeks. Maak handmatig de omgekeerde aanvulling of gebruik de online tool voor omgekeerde aanvulling (Materiaaltabel). De omgekeerde complementsequentie is de ASO die voor het experiment moet worden gesynthetiseerd.
    5. Analyseer de ASO-sequentie met behulp van Nucleotide Blast NCBI (blastn) en UCSC Genome Browser on Human (GRCh38/hg38). Zorg ervoor dat ASO's geen homologie vertonen met andere transcripten of andere genomische regio's in het menselijk genoom.
      OPMERKING: ASO-synthese en -zuivering werden uitgevoerd door een commercieel bedrijf (Materiaaltabel).
  2. Zorg ervoor dat de gesynthetiseerde oligonucleotiden de volgende kenmerken hebben.
    1. Zorg ervoor dat PS langs de hele sequentie van het oligonucleotide38 bindt (Figuur 2A). Zorg ervoor dat ASO's chimeer zijn, met 5 nucleotiden die de 5'- en 3'-uiteinden flankeren met suikerringen gemodificeerd met 2'-O-methyl (Figuur 2B).
    2. Zorg ervoor dat de 10 nucleotiden in het midden een ongemodificeerde suikerring hebben om de RNase H-binding te ondersteunen (Figuur 2C).
    3. Vraag het bedrijf om zuivering uit te voeren met behulp van standaard ontzouting en omgekeerde fase (RP) HPLC39.
    4. Bestel ASO-levering in gevriesdroogd formaat.
  3. Los de gevriesdroogde ASO's op in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium en magnesium tot een eindconcentratie van 200 μM. Bewaren bij -20 °C.
  4. Bereid de werkoplossing van ASO door het geconcentreerde materiaal te verdunnen tot een concentratie van 20 μM. Bereid de verdunning met DPBS. Bewaren bij -20 °C.
    OPMERKING: Voor deze studie werden twee ASO's ontworpen die gericht zijn op lncRNA-RFC4. Voor de optimalisatie van de ASO-concentratie voor transfectie en efficiëntie werd het protocol van Zong et al.40 gevolgd. Twee ASO's zijn ontworpen en experimenteel geoptimaliseerd volgens het protocol van Zong: ASO-lncRFC4 en ASO-lncRFC4-2. Na optimalisatie werd één effectieve ASO gericht tegen lncRNA-RFC4, ASO-lncRFC4, geselecteerd voor het verlengde knockdown-protocol (aanvullende figuur 1). Als positieve controle werd een eerder bevestigde efficiënte ASO gericht tegen lncRNA MALAT18 gebruikt: ASO-MALAT1. Voor de negatieve controle werd een ASO gericht tegen het Escherichia coli lacZ-gen, ASO-lacZ (NCBI-toetredingsnummer: FN297865), ontworpen.

2. Voorbereiding van cellen

NOTITIE: Werk in de celkweekkap telkens wanneer cellijnen, oplossingen, materiaal of een ander product dat moet worden gebruikt tijdens de manipulatie van de celcultuur wordt gehanteerd. Gebruik bij het manipuleren van vloeistoffen voor celkweek altijd gesteriliseerde serologische pipetten of micropipetten met gesteriliseerde punten. Voldoe en volg altijd alle veiligheidseisen die zijn aangegeven in het laboratoriumveiligheidshandboek van de instelling gedurende het hele protocol.

  1. Bereid de volledige celkweekmedia voor elke cellijn voor zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid voor HCT116 McCoy's 5A-medium voor met 10% foetaal runderserum (FBS).
    2. Bereid voor PrEC prostaatepitheelcelbasale medium voor met de prostaatepitheelcelgroeikit.
  2. Gebruik drie kweekplaten van 100 mm (55cm2 oppervlakte) voor KD-experimenten, één voor elk oligonucleotide dat moet worden gebruikt: ASO gericht op het lncRNA, ASO voor gebruik als positieve controle (ASO-MALAT1) en ASO voor gebruik als negatieve controle (ASO-lacZ).
  3. Gebruik twee kweekplaten van 35 mm (9 cm2 in oppervlakte) die als controlepunten voor KD tussen celpassages moeten worden gebruikt, waarvan er één zal worden getransfecteerd met volledige transfectiemedia voor ASO-lncRFC4 en de andere voor ASO-lacZ.
    OPMERKING: De transfectie werd gepland volgens de lipide-gebaseerde transfectiereagens (zie Lijst van Materialen) de procedures en de protocollen van de fabrikant die eerder worden gerapporteerd41,42.
  4. Zaadcellen tot een dichtheid van 1 x 104 cellen/cm2 in celkweekschaaltjes. Incubeer bij 37 °C in de incubator met 5% CO2 in de lucht totdat de cellen 50% samenvloeien (wanneer 50% van het oppervlak bedekt is door de celmonolaag). Met een samenvloeiing van 50% zijn cellen klaar om te worden getransfecteerd voor dit protocol.
    OPMERKING: Voor transfectie van ASO-lncRFC4 en ASO-lacZ werden één 100 mm schotel en één 35 mm schotel gezaaid. Voor transfectie van ASO-MALAT1 werd alleen een schotel van 100 mm gezaaid (Figuur 3A).

3. Transfectie

  1. Verwarm het verlaagde serummedium tot 37 °C voor aanvang van de procedure.
  2. Voor transfectie met ASO-lacZ en ASO-lncRFC4, volg de stappen die hieronder worden beschreven.
    OPMERKING: Transfectie met ASO-lacZ en ASO-lncRFC4 is gepland voor cellen met een oppervlakte van 55 cm2; Wanneer verschillende ruimtes worden gebruikt, kunnen de volumes dienovereenkomstig worden aangepast. Deze procedure moet worden uitgevoerd voor elke ASO die onder dezelfde omstandigheden wordt gebruikt.
    1. Bereid buis 1 in de celkweekkap voor door 43,75 μl ASO (20 μM) op te lossen in 1,4 ml warm gereduceerd serummedium in een conische centrifugebuis van 15 ml.
    2. Bereid buis 2 in de celkweekkap voor door 18,66 μL op lipiden gebaseerd transfectiereagens te mengen met 1,4 ml warm gereduceerd serummedium in een 1,5 ml RNase-vrije microfugebuis.
    3. Incubeer de buisjes 1 en 2 in de celkweekkap bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    4. Voeg de oplossing in buis 2 (transfectiereagens + gereduceerd serum) langzaam en druppelsgewijs rechtstreeks toe aan buis 1 (ASO + gereduceerd serum) om te voorkomen dat de reagentia over het oppervlak van de buis worden verspreid.
    5. Incubeer het mengsel in buis 1 gedurende 20 minuten in de kweekkap bij kamertemperatuur.
    6. Voeg warm, verminderd serummedium toe aan tube 1 tot een eindvolume van 8,75 ml.
      OPMERKING: De definitieve transfectiemedia bevatten ASO bij een concentratie van 100 nM.
    7. Verwijder de kweekmedia uit de celkweekschaal die de te transfecteren cellen bevat en voeg 7,5 ml van de transfectiemedia toe aan de 100 mm kweekplaat en 1 ml aan de 35 mm kweekplaat direct in de celmonolaag, druppel voor druppel. Zorg ervoor dat de media gelijkmatig over het hele oppervlak worden verdeeld door de schaal voorzichtig te schudden.
    8. Incubeer in een broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 in lucht gedurende 6 uur.
    9. Na 6 h van incubatie in de transfectiemedia, voegt 7,5 ml volledige media toe aan de cellen in de 100 mm kweekplaat en 1 ml volledige media aan de cellen in de 35 mm kweekplaat. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Voor transfectie met ASO-MALAT1, voer de experimenten uit zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: Transfectie met ASO-MALAT1 is gepland voor cellen met een oppervlakte van 55 cm2.
    1. Bereid buis 1 voor in de celkweekkap door 37,5 μl ASO (20 μM) op te lossen in 1,2 ml warm gereduceerd serummedium in een conische centrifugebuis van 15 ml.
    2. Bereid buis 2 voor door 16 μL transfectiereagens op basis van lipiden te mengen met 1,2 ml warm gereduceerd serummedium.
    3. Incubeer de buisjes 1 en 2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in de celkweekkap.
    4. Voeg de oplossing in buis 2 (transfectiereagens op basis van lipiden + gereduceerd serum) langzaam en druppelsgewijs rechtstreeks toe aan buis 1 (ASO + gereduceerd serum) om te voorkomen dat de reagentia over het oppervlak van de buis worden verspreid.
    5. Incubeer het mengsel in buis 1 gedurende 20 minuten in de kweekkap bij kamertemperatuur.
    6. Voeg warm, verminderd serummedium toe aan tube 1 tot een eindvolume van 7,5 ml. De uiteindelijke transfectiemedia bevatten ASO bij een concentratie van 100 nM.
    7. Verwijder de cultuurmedia uit de celcultuurschaal die de te transfecteren cellen bevat en voeg 7,5 ml van de transfectiemedia direct toe aan de celmonolaag druppelsgewijs om ervoor te zorgen dat het medium gelijkmatig langs de gehele oppervlakte wordt verdeeld door het zachte schudden van de schaal.
    8. Incubeer bij 37 °C in een broedmachine met 5% CO2 in de lucht gedurende 6 uur.
    9. Na 6 uren van incubatie met de transfectiemedia, voegt 7,5 ml volledige media aan de cellen toe en incubeert in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
  4. Beoordeel cellen microscopisch elke 12-24 uur totdat de cellen klaar zijn voor de volgende transfectieronde.
    OPMERKING: Vervolgens moet transfectie worden uitgevoerd wanneer cellen samenvloeiing van 70% bereiken. Vervang indien nodig de media door een compleet kweekmedium.
  5. Wanneer de cellen 70% confluent in de schaal van de celcultuur zijn, herhaal de procedure (stappen 3.1 tot 3.4) en voer de volgende ronde van transfectie uit.
    OPMERKING: Na de tweede transfectie moeten cellen elke 12-24 uur microscopisch worden beoordeeld. Celoogst en passage moeten worden uitgevoerd wanneer cellen een samenvloeiing van 80%-85% bereiken. Vervang indien nodig de media door een compleet kweekmedium.

4. Celoogst en passage

OPMERKING: De oogst en het passage van de cel worden uitgevoerd na elke 2 rondes van transfectie en na de2e,4e, en 6ste rondes van transfectie. De gemiddelde tijd voor oogst in HCT116-cellen was 6 dagen na de 1e, 3een 5e transfecties, en voor PrEC-cellen was de gemiddelde tijd 7 dagen na de 1e, 3e en 5etransfecties. Het tijdstip voor transfectie verschilt voor beide cellijnen die in dit protocol worden gebruikt. Voor HCT116 worden de2e,3e,4e, 5e en 6e transfecties respectievelijk 3, 6, 9, 12 en 15 dagen na de eerste transfectie uitgevoerd. Voor PrEC, worden de 2de, 3ste, 4de, 5ste, en 6de transfecties uitgevoerd 3, 7, 10, 14 en 18 dagen na de eerste transfectie, respectievelijk. Raadpleeg de tijdlijn in Figuur 3 om tijdstippen voor transfectie, passage en oogst te controleren.

  1. Voer het oogsten en passeren van cellen uit voor de KD-experimenten in kweekplaten van 100 mm, zoals hieronder beschreven.
    1. Ga verder met het oogsten van cellen en passage wanneer cellen een samenvloeiing van 80%-85% bereiken.
    2. Verwarm het volledige medium en was de oplossingen tot 37 °C. Verwarm het dissociatiereagens tot kamertemperatuur. Verwarm de neutraliserende oplossing voor het dissociatiereagens tot kamertemperatuur.
      OPMERKING: Wasoplossingen, dissociatiereagentia en neutraliserende oplossingen verschillen voor de twee cellijnen die in dit protocol worden gebruikt. HCT116-cellen worden gewassen met PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) en gedissocieerd met trypsine-EDTA-oplossing. Neutralisatie van het dissociatiereagens wordt uitgevoerd met volledige kweekmedia voor HCT116-cellen. Voor PrEC wordt HEPES-gebufferde zoutoplossing gebruikt als wasoplossing. Trypsine-EDTA wordt gebruikt als dissociatiereagens. Gebruik voor neutralisatie van het dissociatiereagens trypsine-neutraliserende oplossing.
    3. Verwijder in de kweekkap de kweekmedia uit de celkweekschaal en was voorzichtig met 3 ml wasoplossing, gevolgd door het weggooien van de wasoplossing. Herhaal deze stap 2x.
    4. Voeg 2 ml dissociatiereagens volgens de cellijn toe aan de celmonolaag en incubeer gedurende 3-5 minuten bij 37 °C. Beoordeel de cellen elke 2 minuten totdat de dissociatie is voltooid.
    5. Voeg 2 ml neutraliserende oplossing toe, afhankelijk van de cellijn, en breng het volledige volume van de celsuspensie van het celkweekschaaltje over in een conische centrifugebuis van 15 ml.
    6. Neem voor RNA-extractie 500 μL van de celsuspensie en breng deze over naar een centrifugebuis van 1,5 ml. Plaats de buis op ijs en ga verder met stap 5.1 voor RNA-extractie en RT-qPCR.
    7. Centrifugeer de rest van de celsuspensie bij 120 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande weg.
    8. Resuspendeer de celpellet in 2 ml volledige kweekmedia en ga verder met het tellen van de cellen volgens de standaardprocedures.
    9. Voor karyotypering zaadcellen tot een dichtheid van 1 x 104 cellen/cm2 in een celkweekschaaltje met een diameter van 35 mm (oppervlakte van 9cm2), incuberen in een incubator bij 37 °C bij 5% CO2 in lucht gedurende 24 uur en overgaan tot karyotypering volgens standaardprocedures.
    10. Om de KD-experimenten in de volgende cellulaire passage voort te zetten, zaaien cellen tot een dichtheid van 1 x 104 cellen/cm2 in een nieuw celkweekschaaltje met een diameter van 100 mm. Dit gerecht zal passage nummer 2 zijn voor het experiment. Incubeer bij 37 °C in de incubator met 5% CO2 in de lucht tot de cellen 50% samenvloeien.
      LET OP: Indien gewenst kunnen de overige cellen volgens de standaardprocedures worden gebruikt voor eiwitextractie en/of invriezen.
    11. Herhaal de stappen 3.1 tot 4.1.10 voor transfectie en oogsten van passage 2 en van passage 3.
  2. Volg de volgende procedure voor het oogsten van cellen voor de controlepunten van de KD-experimenten in 35 mm kweekschaaltjes.
    OPMERKING: De oogst voor het eerste controlepunt in het experiment KD wordt uitgevoerd 2 dagen na de2e en 4e transfectieprocedures.
    1. Verwarm het complete medium en de wasoplossingen tot 37 °C. Verwarm het dissociatiereagens tot kamertemperatuur. Verwarm de neutraliserende oplossing voor het dissociatiereagens tot kamertemperatuur.
    2. Verwijder in de kweekkap de kweekmedia uit de celkweekschaal en was voorzichtig met 0,5 ml wasoplossing en gooi de wasoplossing weg. Herhaal deze stap 2x.
    3. Nadat de wasoplossingen zijn weggegooid, voegt u 0,5 ml dissociatiereagens toe, afhankelijk van de cellijn, en incubeert u gedurende 3-5 minuten bij 37 °C. Beoordeel de cellen elke 2 minuten totdat de dissociatie is voltooid.
    4. Voeg 0,5 ml neutraliserende oplossing toe volgens de cellijn en breng het hele volume van de celsuspensie over van de celkweekschaal naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats deze op ijs.
    5. Ga verder met stap 5.1 voor RNA-extractie en qPCR.

5. RNA-extractie en RT-PCR

  1. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Was de celpellet met 600 μL koude PBS (4 °C).
  2. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    Gebruik de celpellet voor RNA-extractie volgens de standaardprocedures.
  3. Ga over tot DNase-behandeling van het gezuiverde RNA volgens de standaardprocedure die in het laboratorium wordt gevolgd. Bewaar op het pauzepunt gezuiverd RNA gedurende lange perioden bij -80 °C.
  4. Gebruik het RNA voor standaard cDNA-synthese bij elk verkregen RNA-monster. Bewaar cDNA op het pauzepunt gedurende lange perioden bij -20 °C.
  5. Voer standaard qPCR uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Voor qPCR amplificeren oligonucleotiden de volgende transcripten: lncRNA van belang, MALAT1 en een constitutief tot expressie gebracht gen als interne controle (Tabel 1). Voor dit protocol werd de uitdrukking RPS28 gebruikt als interne controle.
    2. Voer qPCR-reacties uit om de interne controle, het lncRNA van belang en MALAT1 te amplificeren met behulp van cDNA uit het ASO-LacZ-monster. Dit monster wordt gebruikt om de expressie van de andere monsters te normaliseren.
    3. Voer qPCR-reacties uit om de interne controle RPS28 en het lncRNA van belang te amplificeren met behulp van cDNA uit het ASO-lncRNA-monster.
    4. Voer qPCR-reacties uit om de interne controles RPS28 en MALAT1 te amplificeren met behulp van cDNA uit het ASO-MALAT1-monster. Volg de instellingen van de reactie en de omstandigheden van de thermocycler zoals beschreven in tabel 2.
    5. Analyseer qPCR-gegevens door ΔΔCt-normalisatie van de expressie van het transcript van belang ten opzichte van de interne controle, en normaliseer vervolgens de expressie van het transcript van belang (lncRNA of MALAT1) ten opzichte van de expressie van hetzelfde transcript in het ASO-LacZ-monster om het relatieve expressieniveau van het transcript te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het huidige protocol werd het gebruik van ASO's aangepast aan de KD van een nucleair lncRNA gedurende een langere tijd in de humane cellijnen PrEC en HCT116.

Zeker, het KD-experiment was succesvol in de cellijn PrEC gedurende 21 dagen van het experiment, zoals waargenomen in figuur 4. Om deze bewering te bevestigen, analyseerden we, naast het analyseren van expressie in de dagen van celpassatie (Figuur 4

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals eerder vermeld, hebben lncRNA's belangrijke regulerende functies in de cel; Ontregeling van deze transcripten kan dus betrokken zijn bij ziekten. Kanker is zo'n ziekte die wordt gekenmerkt door lncRNA-ontregeling43,44. Bij deze ziekte is bekend dat lncRNA's een belangrijke regulerende rol spelen als oncogenen45 of tumorsuppressoren46. Sommigen van hen zijn betrokken bij de ont...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Montiel-Manriquez, Rogelio is een doctoraatsstudent van Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en heeft CONACyT-fellowship ontvangen met CONACyT CVU-nummer: 581151.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15ml Centrifuge Tubes - 15ml Conical TubesThermo Fisher Scientific339650
Corning 100 mm TC-behandelde kweekschaalCorning 430167Oppervlakte: 55 cm2
Corning 35 mm TC-behandelde kweekschaalCorning 430165Oppervlakte: 9 cm2
DPBS, zonder calcium, zonder magnesiumThermo Fisher Scientific14190144
Fetaal bovien serum (FBS)ATCC30-2020
HCT 116 cellijnATCCCCL-247
HEPES, 1M BufferoplossingThermo Fisher Scientific15630122
Integrated DNA Technologies NANAhttps://www.idtdna.com/
Lipofectamine RNAiMAX ReagensThermo Fisher Scientific13778150
McCoy's 5A medium ATCC30-2007
Normale menselijke primaire prostaat epitheelcellen (HPrEC)ATCCPCS-440-010
Nucleotide Blast NCBI NANAhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Opti-MEM Medium met verminderd serumThermo Fisher Scientific31985070
PBS (10X), pH 7,4Thermo Fisher Scientific
Prostaat epitheelcel basaal mediumATCCPCS-440-030
Prostaat epitheelcel groeikitATCCPCS-440-040
Omgekeerd complement online toolNANAhttps://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html
RNAfold WebServerNANAhttp://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNase-vrije Microfuge Tubes, 1,5 mLThermo Fisher ScientificAM12400
TrypLE Express Enzym (1X), zonder fenolroodThermo Fisher Scientific12604013Trypsine-EDTA oplossing
Trypsine neutralisatieoplossingATCCPCS-999-004
Trypsine-EDTA voor primaire cellenATCCPCS-999-003
UCSC Genome Browser, Human (GRCh38/hg38)NANAhttps://genome.ucsc.edu/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (Database issue), D308-D314 (2018).
  2. Kopp, F., Mendell, J. T. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs. Cell. 172 (3), 393-407 (2018).
  3. Palazzo, A. F., Koonin, E. V. Functional Long Non-coding RNAs Evolve from Junk Transcripts. Cell. 183 (5), 1151-1161 (2020).
  4. Ransohoff, J. D., Wei, Y., Khavari, P. A. The functions and unique features of long intergenic non-coding RNA. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 143-157 (2017).
  5. Chen, L. L. Linking Long Noncoding RNA Localization and Function. Trends in Biochemical Sciences. 41 (9), 761-772 (2016).
  6. Basu, S., Larsson, E. A Catalogue of Putative cis-Regulatory Interactions Between Long Non-coding RNAs and Proximal Coding Genes Based on Correlative Analysis Across Diverse Human Tumors. G3: Genes|Genomes|Genetics. 8 (6), 2019-2025 (2018).
  7. Petermann, F., et al. The Magnitude of IFN-γ Responses Is Fine-Tuned by DNA Architecture and the Non-coding Transcript of Ifng-as1. Molecular Cell. 75 (6), 1229.e5-1242.e5 (2019).
  8. Tripathi, V., et al. The Nuclear-Retained Noncoding RNA MALAT1 Regulates Alternative Splicing by Modulating SR Splicing Factor Phosphorylation. Molecular Cell. 39 (6), 925-938 (2010).
  9. Chen, L. L., Carmichael, G. G. Decoding the function of nuclear long non-coding RNAs. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 357-364 (2010).
  10. Vance, K. W., Ponting, C. P. Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs. Trends in Genetics. 30 (8), 348-355 (2014).
  11. Ren, H., Zhang, Z., Zhang, W., Feng, X., Xu, L. Prodrug-type antisense oligonucleotides with enhanced nuclease stability and anti-tumour effects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 162, 105832(2021).
  12. Kole, R. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. DRUG DISCOVERY. 16, (2012).
  13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Antisense Oligonucleotides: Treating Neurodegeneration at the Level of RNA. Neurotherapeutics. 10 (3), 486-497 (2013).
  14. Le, B. T., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Angiogenic Factors as Potential Cancer Therapeutics. Molecular Therapy Nucleic Acids. 14, 142-157 (2019).
  15. Shadid, M., Badawi, M., Abulrob, A. Antisense oligonucleotides: absorption, distribution, metabolism, and excretion. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 17 (11), 1281-1292 (2021).
  16. Roberts, T. C., Langer, R., Wood, M. J. A. Advances in oligonucleotide drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (10), 673-694 (2020).
  17. Havens, M. A., Hastings, M. L. Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6549-6563 (2016).
  18. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), e2114886119(2022).
  19. Lim, K. H., et al. Antisense oligonucleotide modulation of non-productive alternative splicing upregulates gene expression. Nature Communications. 11 (1), 3501(2020).
  20. Crooke, S. T. Molecular Mechanisms of Antisense Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 70-77 (2017).
  21. Monia, B. P., Johnston, J. F., Sasmor, H., Cummins, L. L. Nuclease Resistance and Antisense Activity of Modified Oligonucleotides Targeted to Ha. Journal of Biological Chemistry. 271 (24), 14533-14540 (1996).
  22. Grünweller, A., et al. Comparison of different antisense strategies in mammalian cells using locked nucleic acids, 2′-O-methyl RNA, phosphorothioates and small interfering RNA. Nucleic Acids Research. 31 (12), 3185-3193 (2003).
  23. Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. 32 (9), 1948-1957 (2018).
  24. Yoo, B. H., Bochkareva, E., Bochkarev, A., Mou, T. C., Gray, D. M. 2′-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research. 32 (6), 2008-2016 (2004).
  25. Chu, H. P., et al. TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres. Cell. 170 (1), 86.e16-101.e16 (2017).
  26. Kasuya, T., et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides. Scientific Reports. 6 (1), 30377(2016).
  27. Swayze, E. E., et al. Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals. Nucleic Acids Research. 35 (2), 687-700 (2007).
  28. Hyjek, M., Figiel, M., Nowotny, M. RNases H: Structure and mechanism. DNA Repair. 84, 102672(2019).
  29. Lima, W. F., De Hoyos, C. L., Liang, X., Crooke, S. T. RNA cleavage products generated by antisense oligonucleotides and siRNAs are processed by the RNA surveillance machinery. Nucleic Acids Research. 44 (7), 3351-3363 (2016).
  30. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology. 31 (9), 822-826 (2013).
  31. Drews, R. M., et al. A pan-cancer compendium of chromosomal instability. Nature. 606 (7916), 976-983 (2022).
  32. Benhra, N., Barrio, L., Muzzopappa, M., Milán, M. Chromosomal Instability Induces Cellular Invasion in Epithelial Tissues. Developmental Cell. 47 (2), 161.e4-174.e4 (2018).
  33. Gronroos, E., López-García, C. Tolerance of Chromosomal Instability in Cancer: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Cancer Research. 78 (23), 6529-6535 (2018).
  34. Liu, L., et al. An RFC4/Notch1 signaling feedback loop promotes NSCLC metastasis and stemness. Nature Communications. 12 (1), 2693(2021).
  35. Shiomi, Y., Nishitani, H. Control of Genome Integrity by RFC Complexes; Conductors of PCNA Loading onto and Unloading from Chromatin during DNA Replication. Genes. 8 (2), (2017).
  36. Carter, S. L., Eklund, A. C., Kohane, I. S., Harris, L. N., Szallasi, Z. A signature of chromosomal instability inferred from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers. Nature Genetics. 38 (9), 1043-1048 (2006).
  37. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA Websuite. Nucleic Acids Research. 36 (suppl_2), W70-W74 (2008).
  38. Wan, W. B., et al. Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages. Nucleic Acids Research. 42 (22), 13456-13468 (2014).
  39. Kanavarioti, A. HPLC methods for purity evaluation of man-made single-stranded RNAs. Scientific Reports. 9 (1), 1019(2019).
  40. Zong, X., et al. Knockdown of Nuclear-Retained Long Noncoding RNAs Using Modified DNA Antisense Oligonucleotides. Nuclear Bodies and Noncoding RNAs: Methods and Protocols. , 321-331 (2015).
  41. Zhao, M., et al. Lipofectamine RNAiMAX: An Efficient siRNA Transfection Reagent in Human Embryonic Stem Cells. Molecular Biotechnology. 40 (1), 19-26 (2008).
  42. Nuclear bodies and noncoding RNAs: methods and protocols. , Humana Press. New York. (2015).
  43. CAWG Drivers and Functional Interpretation Group. Cancer LncRNA Census reveals evidence for deep functional conservation of long noncoding RNAs in tumorigenesis. Communications Biology. 3 (1), 56(2020).
  44. Schmitt, A. M., Chang, H. Y. Long Noncoding RNAs in Cancer Pathways. Cancer Cell. 29 (4), 452-463 (2016).
  45. Hosono, Y., et al. Oncogenic Role of THOR, a Conserved Cancer/Testis Long Non-coding RNA. Cell. 171 (7), 1559.e20-1572.e20 (2017).
  46. Cho, S. W., et al. Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element. Cell. 173 (6), 1398.e22-1412.e22 (2018).
  47. Ding, W., Ren, J., Ren, H., Wang, D. Long Noncoding RNA HOTAIR Modulates MiR-206-mediated Bcl-w Signaling to Facilitate Cell Proliferation in Breast Cancer. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  48. Huo, H., et al. Long non-coding RNA NORAD upregulate SIP1 expression to promote cell proliferation and invasion in cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 106, 1454-1460 (2018).
  49. Prensner, J. R., et al. The Long Non-Coding RNA PCAT-1 Promotes Prostate Cancer Cell Proliferation through cMyc. Neoplasia. 16 (11), 900-908 (2014).
  50. Li, H., et al. Long noncoding RNA NORAD, a novel competing endogenous RNA, enhances the hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition to promote metastasis in pancreatic cancer. Molecular Cancer. 16, (2017).
  51. Li, Q., et al. High expression of long noncoding RNA NORAD indicates a poor prognosis and promotes clinical progression and metastasis in bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 36 (6), 310.e15-310.e22 (2018).
  52. Katayama, H., et al. Long non-coding RNA HOTAIR promotes cell migration by upregulating insulin growth factor-binding protein 2 in renal cell carcinoma. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
  53. Ling, H., et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24, underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer. Genome Research. 23 (9), 1446-1461 (2013).
  54. Lee, S., et al. Noncoding RNA NORAD Regulates Genomic Stability by Sequestering PUMILIO Proteins. Cell. 164 (1-2), 69-80 (2016).
  55. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  56. Iwamoto, N., et al. Control of phosphorothioate stereochemistry substantially increases the efficacy of antisense oligonucleotides. Nature Biotechnology. 35 (9), 845-851 (2017).
  57. Naeem, M., Majeed, S., Hoque, M. Z., Ahmad, I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 9 (7), 1608(2020).
  58. Vicente, M. M., Chaves-Ferreira, M., Jorge, J. M. P., Proença, J. T., Barreto, V. M. The Off-Targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, (2021).
  59. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 4, e264(2015).
  60. Shen, X., Corey, D. R. Chemistry, mechanism, and clinical status of antisense oligonucleotides and duplex RNAs. Nucleic Acids Research. 46 (4), 1584-1600 (2018).
  61. Stein, C. A., Subasinghe, C., Shinozuka, K., Cohen, J. S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Research. 16 (8), 3209-3221 (1988).
  62. Crooke, S. T., Vickers, T. A., Liang, X. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions. Nucleic Acids Research. 48 (10), 5235-5253 (2020).
  63. Manoharan, M. 2′-Carbohydrate modifications in antisense oligonucleotide therapy: importance of conformation, configuration and conjugation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1489 (1), 117-130 (1999).
  64. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnology. 10 (1), 9(2010).
  65. Bassett, A. R., et al. Considerations when investigating lncRNA function in vivo. eLife. 3, e03058(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Knockdown van nucleair lncRNAlange niet coderende RNA sRNase H rekruteringlangdurige RNA knockdowncis regulatorische effectenchromosomale instabiliteitPrEC cellenHCT116 cellen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen