Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

Samenvatting

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Samenvatting

Mycoheterotrofe planten vertonen een van de meest extreme vormen van mycorrhiza-afhankelijkheid, omdat ze hun autotrofe capaciteit volledig hebben verloren. Net zo essentieel als elke andere vitale hulpbron, zijn de schimmels waarmee deze planten nauw associëren essentieel voor hen. Daarom zijn enkele van de meest relevante technieken bij het bestuderen van mycoheterotrofe soorten degene die het onderzoek van geassocieerde schimmels mogelijk maken, met name die welke wortels en ondergrondse organen bewonen. In deze context worden vaak technieken toegepast voor het identificeren van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke endofytische schimmels. Het isoleren van schimmelendofyten biedt een middel om ze morfologisch te identificeren, hun diversiteit te analyseren en inocula te behouden voor toepassingen in de symbiotische ontkieming van orchideeënzaden. Het is echter bekend dat er een grote verscheidenheid aan niet-kweekbare schimmels is die plantenweefsels bewonen. Cultuuronafhankelijke moleculaire identificatietechnieken bieden dus een bredere dekking van soortendiversiteit en -overvloed. Dit artikel beoogt de methodologische ondersteuning te bieden die nodig is voor het opstarten van twee onderzoeksprocedures: een cultuurafhankelijke en een onafhankelijke. Met betrekking tot het cultuurafhankelijke protocol worden de processen voor het verzamelen en bewaren van plantenmonsters van verzamelplaatsen naar laboratoriumfaciliteiten gedetailleerd, samen met het isoleren van draadvormige schimmels uit ondergrondse en luchtorganen van mycoheterotrofe planten, het bijhouden van een verzameling isolaten, het morfologisch karakteriseren van hyfen door middel van een objectglaasjescultuurmethodologie en moleculaire identificatie van schimmels door totale DNA-extractie. De gedetailleerde procedures omvatten cultuuronafhankelijke methodologieën en omvatten het verzamelen van plantenmonsters voor metagenomische analyses en totale DNA-extractie uit achlorofylachtige plantenorganen met behulp van een commerciële kit. Ten slotte worden ook continuïteitsprotocollen (bijv. polymerasekettingreactie [PCR], sequencing) voorgesteld voor analyses, en technieken worden hier gepresenteerd.

Inleiding

Endofytische schimmels zijn per definitie schimmels die het inwendige van plantenorganen en -weefsels bewonen bij onopvallende infecties (d.w.z. zonder schade toe te brengen aan hun gastheer)^1,2. Deze schimmels kunnen neutraal of gunstig interageren met waardplanten, kunnen resistentie verlenen tegen ziekteverwekkers en ongunstige omgevingsomstandigheden, en kunnen bijdragen aan de synthese van nuttige verbindingen voor de plant (bijv. groeifactoren en andere fytohormonen)^1,3. Mycorrhiza-endofyten zijn schimmels die mycorrhiza-associaties met de plant tot stand brengen en deelnemen aan de overdracht van voedingsstoffen⁴. In Orchidaceae is de interactie met mycorrhiza-endofyten van fundamenteel belang voor het ontkiemen van zaden in de overgrote meerderheid van de soorten, en voor de vestiging van zaailingen in alle planten in de^familie5. In dergelijke contexten vertegenwoordigen mycoheterotrofe orchideeën een geval van totale afhankelijkheid van hun mycorrhiza-partners, aangezien ze gedurende hun hele levenscyclus afhankelijk zijn van de overdracht van minerale voedingsstoffen en koolstofverbindingen door deze schimmels⁶. Daarom is de isolatie en identificatie van associërende schimmels een fundamentele basis bij het onderzoeken van mycoheterotrofe levensstrategieën. Bovendien is er weinig bekend over de rol van schimmelendofyten in mycoheterotrofe planten of zelfs de werkelijke diversiteit van deze schimmels ^7,8.

Het onderzoek naar endofytische schimmels kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende technieken, die traditioneel als cultuuronafhankelijk of -afhankelijk worden omschreven, bijvoorbeeld: (a) directe observatie, (b) schimmelisolatie en morfologische en/of moleculaire identificatie, en (c) totale DNA-extractie van plantenweefsels en moleculaire identificatie⁹. In directe observatie (a) kunnen endofytische schimmels worden onderzocht terwijl ze zich nog in het inwendige van plantencellen en weefsels bevinden door middel van licht- of elektronenmicroscopie⁹, aangezien verschillende microscopieprotocollen worden beschreven door Pena-Passos et ^al.10. Door isolatiemethoden (b) kunnen endofyten van schimmels worden gekarakteriseerd op basis van hun kolonies, hyfen en morfologie van de voortplantings- of resistentiestructuur. Ook is het via isolatietechnieken mogelijk om de moleculaire identificatie van isolaten uit te voeren door middel van DNA-extractie, amplificatie van moleculaire identificatiesequenties (barcodes of vingerafdrukken) en sequencing¹¹. Deze laatste techniek (c) maakt de moleculaire identificatie van endofytische schimmels mogelijk door middel van DNA-extractie in het inwendige van plantenweefsels (metabarcoding), gevolgd door bibliotheekvoorbereiding en sequencing¹².

Bovendien kunnen schimmelisolaten worden toegepast in symbiotische kiemproeven, met behulp van zaden van autotrofe of mycoheterotrofe orchideeën. Een voorbeeld van een dergelijke toepassing is het onderzoek van Sisti et ^al.13, waarin de kieming en de beginstadia van de ontwikkeling van protocormen worden beschreven in Pogoniopsis schenckii, een mycoheterotrofe orchidee, in combinatie met enkele van zijn isolaten, bestaande uit niet-mycorrhiza-endofytische schimmels. Het toegepaste symbiotische kiemprotocol wordt gedetailleerd beschreven en gepresenteerd in een video van Pena-Passos et ^al.10. Het isoleren van schimmels in associatie met verschillende plantenorganen maakt divers onderzoek mogelijk met betrekking tot de aard van plant-schimmelinteracties (bijv. om ecologische of fysiologische aspecten van de associatie te begrijpen, evenals onderzoek naar de overdracht van voedingsstoffen van schimmels naar de plant)⁹.

De methodologieën die in sectie 1 worden gepresenteerd, zijn gebaseerd op een verzameling van ondergrondse orgaanmonsters, aangezien deze organen de meeste moeilijkheden opleveren bij het verzamelen, en ze zijn van groot belang omdat mycorrhiza-endofyten ze koloniseren. Beide opgenomen protocollen (stappen 1.1 en 1.2) kunnen echter worden toegepast op andere mycoheterotrofe plantenorganen (bijv. wortelstokken, bloemstengels en vruchten). De in stap 1.1 beschreven verzamelmethode is bedoeld voor het isoleren van endofytische schimmels (sectie 2), voor morfologische karakterisering (secties 4 en 5) en/of totale DNA-extractie voor isolaatidentificatie (sectie 6). Aan de andere kant wordt de in stap 1.2 beschreven verzamelmethode uitsluitend gebruikt voor de totale DNA-extractie van plantenweefsels voor metabarcodingtechnieken (punt 7). In hoofdstuk 3 worden vier methoden voor de opslag en conservering van draadvormige schimmels gepresenteerd, twee voor opslag op korte termijn (3-6 maanden) en de andere twee geschikt voor opslag op lange termijn (>1 jaar). De morfologische karakterisering (secties 4 en 5) kan in verband worden gebracht met moleculaire identificatie om deze te versterken en belangrijke informatie te verschaffen over de macro- en micromorfologie van schimmels. Figuur 1 geeft een overzicht van de collectieve methodologieën die daarna worden beschreven.

Figuur 1: Schematische samenvatting van de gepresenteerde methoden. Plantenverzameling en schimmelisolatie, conservering en moleculaire identificatie door middel van cultuurafhankelijke en -onafhankelijke methodologieën. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Verzameling van plantenmonsters

1. Monstername voor cultuurafhankelijke methoden
   1. Graaf voorzichtig de ondergrondse organen; Dit kunnen wortels, stengels, wortelstokken of opslagorganen van de te verzamelen plant zijn. Afgezien van zeer compacte bodems, verzamelt u deze monsters met de hand.
      OPMERKING: Het gebruik van hulpmiddelen zoals troffels of schepjes in deze stap is niet aan te raden, omdat dit de fragiele structuren van mycoheterotrofe planten kan beschadigen en weefselbesmetting door niet-endofytische schimmels kan veroorzaken.
   2. Verzamel zoveel mogelijk ondergrondse organen. Bewaar de monsters in papieren zakken in een gekoelde container (bijv. polystyreenschuimdoos of thermische zak met ijs). Als er ook luchtorganen worden verzameld, vervoer ze dan apart van de ondergrondse.
2. Monsterverzameling voor cultuuronafhankelijke methoden
   1. Graaf zorgvuldig de wortels van de te verzamelen plant volgens dezelfde aanbevelingen die zijn aangegeven in de OPMERKING van stap 1.1.1.
   2. Verzamel zoveel mogelijk ondergrondse organen. Bewaar de verzamelde monsters in cryobuizen in vloeibare stikstof (wenselijke optie) of gebruik centrifugebuisjes omgeven door droogijs (alternatieve optie). Onderhoud luchtorganen afzonderlijk, indien verzameld.

2. Isolatie van endofytische schimmels geassocieerd met plantenorganen¹⁴

NOTITIE: Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd.

1. Oppervlakkige ontsmetting van plantenorganen
   1. Was de verzamelde monsters (stap 1.1.2) onder stromend water en verwijder zoveel mogelijk substraat en ander vuil dat de monsters kunnen bevatten.
   2. Houd de gewassen monsters in een laminaire stroomkap gedurende 1 minuut ondergedompeld in 70% ethanol (een bekerglas of een glazen pot kan worden gebruikt).
   3. Breng de monsters over naar een andere container met natriumhypochloriet met 2% actief chloor gedurende 3 minuten.
   4. Vervang de monsters in een container met 70% ethanol en laat ze 1 minuut ondergedompeld blijven. Was daarna de monsters achtereenvolgens in twee containers met gedestilleerd water.
2. Installatie van plantenfragmenten in kweekmedium
   NOTITIE: Elke stap die in stap 2.2 wordt beschreven, moet worden uitgevoerd in een lamellenvormige stroomkap.
   1. Bereid voor de installatie petrischalen (8-10 cm in diameter) met 19,5 g/L aardappeldextrose-agar kweekmedium (PDA) + 7 g/L bacteriologische agar + 3 ml/L antibiotica (bijv. streptomycine, penicilline, tetracycline, ampicilline).
   2. Houd de petrischaaltjes met het kweekmedium 24 uur op 36 °C voordat u ze gebruikt om er zeker van te zijn dat er geen verontreiniging is. Gooi gerechten weg die besmet zijn met bacterie- of schimmelkolonies.
      OPMERKING: De toevoeging van antibiotica in het medium is essentieel in deze stap, omdat de organen sterk geïnfecteerd zijn door bacteriën die de schimmelgroei kunnen remmen. Controleer of de antibiotica tijdens het autoclaveren mogen worden verwarmd; sommige antibiotica moeten worden toegevoegd na afkoeling van het medium tot ongeveer 36 °C (voordat het in de schalen wordt geplaatst).
   3. Inoculeer onmiddellijk na de oppervlakkige ontsmetting van de monsters en nog steeds in een laminaire stroomkap, in PDA, enkele druppels van het gedestilleerde water uit de laatste container die is gebruikt om de monsters te wassen. Deze stap is belangrijk om de werkzaamheid van oppervlakkige ontsmetting van monsters te evalueren.
   4. Plaats de monsters in een lege geautoclaveerde schaal en gebruik een gevlamde scalpel en een pincet om de monsters in stukken te snijden tot een dikte van ongeveer 0,2 cm.
   5. Doorsnede cilindrische monsters in de lengterichting in twee helften, indien gewenst, om het oppervlak dat in contact komt met het medium te versterken. Om fruit en andere meer bolvormige organen beter bloot te leggen, hakt u de structuren in stukken of snijdt u ze grondig. De zaden kunnen ook belangrijke schimmelbronnen zijn, dus zorg ervoor dat de in stukken gesneden vrucht ze blootstelt aan het medium.
      OPMERKING: Alleen gezonde organen, zonder weefselbeschadiging of signalen van mogelijke ziekten of pathogene infecties, mogen worden gebruikt bij het isoleren van endofyten van schimmels.
   6. Verdeel vijf fragmenten van de ondergrondse organen in de petrischaaltjes met PDA + antibioticum. Zorg ervoor dat de fragmenten zo ver mogelijk van elkaar verwijderd zijn en ook de randen van de schaal niet raken. Plaats geen fragmenten op het medium. Bereid replica's voor van elk geïnstalleerd orgaan, uit voorzorg in geval van besmetting.
   7. Sluit de petrischaaltjes af met vershoudfolie en bewaar ze 5 dagen in het donker bij 25-27 °C (bij voorkeur in een broedmachine).
3. Isolatiefrequentie (IF) calculus¹¹
   1. Bereken na 5 dagen incubatie van orgaanfragmenten de IF op basis van het aantal geïncubeerde fragmenten dat schimmelkolonies vertoont die groeien gedeeld door het totaal van geïncubeerde fragmenten, zoals weergegeven in de volgende vergelijking:
      
4. Zuivering van schimmelisolaten door strepen en subculturing
   NOTITIE: Elke stap die in stap 2.4 wordt beschreven, moet worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap.
   1. Bereid petrischaaltjes (diameter 5 cm) met 5-7 g/l agar-agar (AA; alleen bacteriologische agar). Houd de vaat 24 uur op 36 °C om mogelijk besmette gerechten te verwijderen.
   2. Identificeer elke gekweekte schimmelkolonie met een code en bain de marges af aan de onderkant van de schaal (kan met een permanente marker). Onderscheid de kolonies op kleur, groeipatroon, textuur en margeformaat.
   3. Met een geautoclaveerde houten tandenstoker recupereert u met behulp van de fijne punt een kleine hoeveelheid mycelium uit een schimmelkolonie. Concentreer u bij voorkeur op de randen van de kolonie en kies een gebied dat zo ver mogelijk van een andere kolonie verwijderd is, zodat u niet meer dan één type kolonie tegelijk kunt recupereren.
   4. Gebruik dezelfde tandenstoker met mycelium aan de punt om de AA te strepen en drie striae (groeven) te produceren. Zorg ervoor dat elke stria zich op een afstand van 1 cm van een andere en de randen van de schaal bevindt. Schrijf de juiste code (met stickerpapier en potlood), sluit de schalen af en bewaar ze gedurende 3 dagen in het donker bij 25-27 °C.
   5. Bereid petrischaaltjes (diameter 8 cm) met 39 g/l PDA. Het is in dit stadium niet nodig om antibiotica toe te voegen.
   6. Nadat u de AA-schalen hebt geïncubeerd, observeert u ze nauwgezet tegen het licht (van een lamp of een raam), met als doel fijne hyfen te identificeren die individuele kolonies vormen. Baken de oppervlakte van een individuele kolonie per schaal af met behulp van een permanente marker aan de onderkant van de petrischaal.
   7. Gebruik in een laminaire stroomkap een geautoclaveerde tandenstoker om een deel van het medium met de kolonie te snijden en breng het gesneden volume over naar het midden van een nieuwe PDA-schaal.
   8. Identificeer de petrischaaltjes met de codes van de isolaten, sluit de schaaltjes af met huishoudfolie en bewaar ze 7-14 dagen in het donker bij 25-27 °C.

3. Conservering van gezuiverde schimmelisolaten

NOTITIE: Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd.

1. Conservering met Castellani's methode of in minerale olie (3-6 maanden)^11,15
   1. Bereid 2 ml microcentrifugebuisjes voor met 0,5 ml gedestilleerd water of met 0,5 ml minerale olie (afhankelijk van de gekozen methode). Zorg ervoor dat de buizen leeg zijn geautoclaveerd en dat het geautoclaveerde water en de olie worden toegevoegd aan de buizen in een laminaire stroomkap.
   2. Plaats de petrischalen met gezuiverde isolaten die al in PDA (39 g/L) zijn gekweekt gedurende 7-14 dagen in een laminaire stroomkap. Snijd met een geautoclaveerde tandenstoker kleine kubussen (0,5 cm x 0,5 cm in het bovenste gedeelte) van medium met de myceliumranden.
   3. Plaats vier tot zes kubussen in de microcentrifugebuisjes met gedestilleerd water (Castellani's methode) of minerale olie. Bewaar de buizen zo lang als nodig is in het donker, bij 25 °C, met inachtneming van de tijdsbeperkingen van de methode.
      OPMERKING: Voeg niet te veel blokjes toe aan de buizen en maak ze vol, omdat dit de kans op besmetting kan vergroten. Het is mogelijk om de buizen gekoeld te bewaren, wat de bewaring van sommige isolaten langer kan bevorderen. Currah et ^al.16 raden aan om replicaten van mycorrhiza-schimmelisolaten van tropische orchideeën zowel gekoeld als bij 25 °C te bewaren, omdat ze verloren kunnen gaan in koude opslag.
   4. Recupereer een kubus en plaats deze in het midden van een nieuwe PDA-schaal om een opgeslagen isolaat te laten groeien.
2. Cryopreservatie in ongepelde rijstkorrels (>1 jaar)¹⁷
   1. Was ongepelde rijstkorrels in stromend water en kook ze tot de rijstschil begint te openen. Verdeel de gekookte korrels in glazen reageerbuizen met een schroefdop en autoclaaf twee keer met een tussenpoos van 24 uur.
   2. Plaats de petrischalen met gezuiverde isolaten die al in PDA (39 g/L) zijn gekweekt gedurende 7-14 dagen in een laminaire stroomkap. Recupereer met een geautoclaveerde tandenstoker vijf kleine hyfenfragmenten uit de myceliumranden en inoculeer ze in de buis met geautoclaveerde rijstkorrels.
      OPMERKING: Het inoculeren van hyfen op verschillende punten en dieptes van de buis garandeert dat het isolaat de ongepelde rijstkorrels in minder tijd koloniseert.
   3. Incubeer de buisjes gedurende 14 dagen in het donker bij 25-27 °C. Roer de buizen door ze elke 3 dagen te vortexen om de korrels geïndividualiseerd te houden.
   4. Nadat je schimmelgroei in de rijstkorrels hebt waargenomen, verdeel je de korrels in een geautoclaveerde petrischaal bekleed met filtreerpapier om vocht te absorberen, over het papier zodat de korrels kunnen drogen. Bewaren in het donker bij 25-27 °C gedurende 2-3 dagen.
   5. Bereid cryobuisjes voor met 1/3 silicagel aan de onderkant en 1/3 glaswol boven de silica. Verdeel ten slotte 1/3 van de rijstkorrels met gekweekt schimmelmycelium. Bewaren bij -20 °C gedurende 24 uur.
   6. Bewaar de cryobuisjes na 24 uur zo lang als nodig is bij -80 °C, rekening houdend met de tijdsbeperkingen van de methode.
3. Cryopreservatie in vermiculiet met behulp van een cryoprotectant (>1 jaar)¹⁸
   1. Bereid een vloeibaar kweekmedium bestaande uit 0,2% gistextract en 2% glucose in gedestilleerd water. Stel de pH in op 5 en autoclaaf deze.
   2. Verdeel 0,2 g vermiculiet (gebruik fijne granulometrie) in cryobuisjes met een schroefdop en autoclaaf ze. Voeg 0,8 ml geautoclaveerd vloeibaar medium toe aan de cryobuisjes met vermiculiet.
   3. Plaats de petrischalen met gezuiverde isolaten die al in PDA (39 g/L) zijn gekweekt gedurende 7-14 dagen in een laminaire stroomkap. Recupereer met een geautoclaveerde tandenstoker drie tot vijf hyfenfragmenten van de myceliumranden en inoculeer langs de buis met vermiculiet + vloeibaar kweekmedium. Vergeet niet om de cryobuisjes te identificeren met de respectievelijke isolaatcode.
      OPMERKING: Het inoculeren van hyfen op verschillende punten en diepten van de cryobuis garandeert dat het isolaat het vermiculiet in minder tijd koloniseert.
   4. Bewaar de cryobuizen in het donker bij 25-27 °C totdat kolonisatie van de meeste vermiculietkorrels kan worden waargenomen, wat meestal ongeveer 14 dagen duurt.
   5. Bereid een cryoprotectieve oplossing bestaande uit 5% glycerol en 5% trehalose in gedestilleerd water en autoclaaf deze. Laat de oplossing afkoelen voordat u deze gebruikt.
   6. Nadat het vermiculiet in cryobuizen is gekoloniseerd door het respectieve schimmelisolaat, verdeel je 0,4 ml cryoprotectant in elke buis en bewaar je de cryobuizen gedurende 48 uur gekoeld bij 4 °C. Houd de cryobuizen daarna zo lang als nodig op -80 °C en houd daarbij rekening met de tijdsbeperkingen van de methode.

4. Macromorfologische karakterisering van draadvormige schimmels (koloniemorfologie)

1. Houd gedurende 7-14 dagen een fotografisch register bij van het mycelium dat in elke petrischaal wordt gekweekt met 39 g/l PDA. Vergeet niet om beide zijden van de kolonie te registreren, boven- en onderkant (achterkant). Als de schalen gemakkelijk worden gebruikt in sectie 6 of niet worden onderhouden, open dan de schalen wanneer u ze fotografeert om betere foto's te krijgen.
2. Als u geïnteresseerd bent in kwantitatieve gegevens over de morfologie van kolonies, repliceert de subcultuur de isolaten en houdt ze in dezelfde groeiomstandigheden en gedurende een constante periode om de koloniediameter te registreren en de groeisnelheid te berekenen (meestal in mm/u).
   OPMERKING: Meer geavanceerde kwantitatieve resultaten kunnen worden bereikt door verschillende soorten kweekmedia te gebruiken voor vergelijking¹⁹ en door rekening te houden met de statistische instrumenten om gegevens te behandelen.
3. Observeer de kolonies ook onder een stereomicroscoop om morfologische kenmerken te identificeren en in vergroting te fotograferen. Evalueer de kolonies op basis van hun macromorfologische kenmerken, zoals beschreven in de resultatensectie. Raadpleeg diverse bibliografische bronnen om de macromorfologie te categoriseren en te relateren aan moleculaire en/of morfologische identificatie.

5. Micromorfologische karakterisering van draadvormige schimmels (hyfale morfologie)

OPMERKING: De micromorfologische technieken worden vergeleken in de discussiesectie, rekening houdend met hun mogelijke toepassingen en nadelen.

1. Kweek de isolaten op petrischaaltjes met 39 g/L PDA gedurende 7-14 dagen. Voor het evalueren van vermeende mycorrhiza-schimmels van orchideeën, kweekt u de isolaten op 17 g/L maïsmeelagar (CMA; of een ander voedingsbeperkend medium) gedurende 3-7 dagen¹⁹.
2. Plaag monteren
   1. Werk in een laminaire stromingskap. Plaats een druppel van een gekozen vlek (stap 5.5) op een schoon glasplaatje.
   2. Gebruik een geautoclaveerde tandenstoker of een ander steriel materiaal om voorzichtig enkele hyfen uit het gegroeide isolaat te verwijderen en in de druppel vlek te plaatsen. Plaats een dekglaasje (bij voorkeur in een beginhoek van 45° om luchtbellen te voorkomen) en analyseer onder een lichtmicroscoop.
3. Plakband bevestiging
   OPMERKING: Deze techniek wordt meestal toegepast in schimmelculturen die gemakkelijk kunnen worden gebruikt in sectie 6 of niet worden onderhouden, aangezien het plakband niet kan worden geautoclaveerd en er verontreinigingen kunnen optreden na het uitvoeren van de methode.
   1. Plaats een druppel van een gekozen vlek (stap 5.5) op een schoon glasplaatje. Knip een strook transparant plakband in een maat die goed past bij het glasplaatje en de centrale vlekdruppel.
   2. Richt het kleverige oppervlak van de strip op het myceliumoppervlak. Druk niet en probeer wat hyfen te verzamelen zonder er te veel van te plakken.
   3. Plak de tape op het glasplaatje en zorg ervoor dat de vlek in contact komt met de verzamelde hyfen. Plaats een druppel water boven de tape en plaats een dekglaasje. Analyseer het objectglaasje onder een lichtmicroscoop.
4. Diacultuur van draadvormige schimmels²⁰
   1. Plaats in een grote petrischaal (bij voorkeur >9 cm in diameter): filtreerpapier aan de onderkant, een U-vormige glasstaaf of een aanpassing (het doel is om een verhoging voor het glasglaasje te maken), een glasplaatje en twee dekglaasjes. Hogere petrischalen vergemakkelijken de manipulatie. Autoclaaf deze kits van petrischaaltjes, één voor elk isolaat.
   2. Bereid een klein volume van 39 g/L PDA of 17 g/L CMA, voeg 10 g/L bacteriologische agar en autoclaaf toe (het volume voor één petrischaal is voldoende voor meer dan 30 isolaten). De cultuurmedia die in de diacultuur worden gebruikt, moeten harder zijn dan de gebruikelijke media. Autoclaaf 100 ml gedestilleerd water.
   3. Werk in een laminaire stromingskap. Plaats het vloeibare medium in een petrischaal, zodat er een laag van ongeveer 0,5 cm hoog ontstaat. Laat het medium stollen. Eenmaal stevig, gebruik je een steriele scalpel om vierkanten van het medium te snijden die 1 cm x 1 cm groot zijn.
   4. Open de petrischaalset in een laminaire stroomkap en gebruik een gevlamde pincet om het materiaal dat in de schaal is geautoclaveerd te ordenen. Schik het materiaal in de genummerde volgorde, zoals te zien is in figuur 2A, en plaats een vierkant kweekmedium op het objectglaasje. Voordat u het dekglaasje over het medium plaatst, gaat u verder met stap 5.4.5.
   5. Gebruik een geautoclaveerde tandenstoker om enkele hyfen uit een isolaat te recupereren en wrijf voorzichtig over de vier zijvlakken van het medium dat op het glasplaatje is geplaatst. Plaats een geautoclaveerd dekglaasje over het middelgrote vierkant met behulp van een gevlamde pincet.
   6. Gebruik een steriele pipetpunt om geautoclaveerd water in het filtreerpapier te plaatsen, om een vochtige kamer te creëren. Gebruik een volume om het papier te verzadigen zonder er te veel water in te doen. Sluit de petrischaal af met huishoudfolie en identificeer deze met de betreffende isolaatcode. Bewaar de vaat 3-7 dagen in het donker op 25-27 °C.
   7. Evalueer de groei van hyfen in het glasplaatje en het dekglaasje. Van elke objectglaasjeskweekset worden twee objectglaasjes gemaakt, één met behulp van het glasglaasje met hyfen en het geautoclaveerde dekglaasje, het tweede met het dekglaasje met hyfen en nog een glasplaatje.
   8. Nadat de groei van de hyfen is waargenomen, maakt u het vierkant van het medium voorzichtig los van het glasplaatje (Figuur 2B), monteert u de twee objectglaasjes met behulp van een gekozen vlek (stap 5.5) en analyseert u ze onder een lichtmicroscoop. Vergeet niet om de isolaatcode op de dia te identificeren. Om semi-permanente glaasjes te maken, verzegelt u het dekglaasje met doorzichtige nagellak.
   9. Om permanente objectglaasjes te maken, wast u de kleurstof van aangehechte hyfen na het kleuren zorgvuldig en laat u het glaasje drogen. Monteer met een snel montagemedium (lees voor details Pena-Passos et ^al.10).
      OPMERKING: Het nadeel van het produceren van een permanent objectglaasje met deze techniek is dat sporen en structuren die niet aan het glas zijn gehecht, kunnen worden gewassen.
5. Kleuringsmethoden en waarneming van hyfen
   1. Lactofenol katoen blauw (LPCB)21: Voeg 20 ml melkzuur, 40 ml glycerol en ²⁰ ml gedestilleerd water toe. Los 20 g fenolkristallen op in deze oplossing door ze zachtjes te verwarmen. Los 0,05 g methylblauw (katoenblauw of 2 ml 1% waterige oplossing) op. LPCB kan ook gemakkelijk worden gekocht, al voorbereid.
      LET OP: Fenol is zeer giftig en vluchtig; Manipuleer het uitsluitend in een zuurkast en draag handschoenen.
   2. Toluïdineblauw O¹⁰(TBO): Bereid 0,05% TBO in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 6,8).
   3. Congorood^22,23,24: Bereid een oplossing van 1% Congorood in gedestilleerd water en filtreer deze. Incubeer gedurende 5-10 min. Deze kleurstof kan ook worden toegepast voor fluorescentiemicroscopie²⁵.
   4. Raadpleeg bij het observeren en fotograferen van schimmeldraden onder een lichtmicroscoop diverse bibliografische bronnen om structuren te helpen identificeren (zie de discussie).

Figuur 2: Procedures voor het kweken van draadvormige schimmels . (A) Schematische configuratie van een objectglaasjeskweekset, waarbij de nummers de volgorde van rangschikking van de elementen aangeven. (B) Het losmaken van het vierkant van het kweekmedium nadat de groei van de hyfen is waargenomen in het glasplaatje en het dekglaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Totale DNA-extractie uit schimmelisolaten (zelfgemaakt protocol²⁶ met wijzigingen ²⁷)

NOTITIE: Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd. Draag handschoenen tijdens het hele protocol en voer enkele fasen uit in een zuurkast.

1. Bereid de extractiebuffer voor: 1% natriumdodecylsulfaat (SDS), 250 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 25 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Kweek de gezuiverde isolaten in 39 g/L PDA gedurende 7-14 dagen.
2. Schraap voorzichtig het mycelium uit een isolaat met een spatel of een lepel en breng de fragmenten over naar een geautoclaveerde vijzel, vermijd het overbrengen van het kweekmedium met het hyfenaggregaat. Maal het mycelium met vloeibare stikstof met een porseleinen stamper tot een fijn poeder. Laat het mycelium dat wordt vermalen niet smelten, voeg stikstof toe om dit te voorkomen.
3. Voeg 1 ml extractiebuffer toe aan een microcentrifugebuisje van 2 ml en plaats het gemalen monster tot de 1,5 ml-markering. Roer voorzichtig de inhoud van de buisjes om te homogeniseren.
4. Schud de buizen gedurende 5 s in een draaikolk en plaats ze gedurende 20 minuten in een thermoblok bij 65 °C. Homogeniseer de inhoud zorgvuldig door inversie om de 7-10 minuten.
5. Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng 800 μL over van de superieure fase naar een nieuwe microcentrifugebuis van 2 ml, voeg 800 μL fenol toe aan de buizen en meng de inhoud door inversie.
   LET OP: Fenol is een zeer giftig en vluchtig reagens; Het kan erytheem, gangreen en weefselnecrose veroorzaken. Bij inademing kan het kortademigheid en hoesten veroorzaken. De systemische absorptie kan de lever, de nieren en het centrale zenuwstelsel beschadigen. Manipuleer fenol uitsluitend in een zuurkast en draag handschoenen.
   NOTITIE: Gebruik vanaf de volgende stap handschoenen en voer het protocol uit in een zuurkast.
6. Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en breng 800 μl over van de bovenste fase naar een nieuw buisje van 2 ml, waarbij de overdracht van de inhoud van de inferieure fase zorgvuldig wordt vermeden.
7. Voeg 400 μL fenol en 400 μL chloroform toe aan de buisjes en meng de inhoud door inversie. Centrifugeer ze bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   LET OP: Chloroform is een zeer giftig en vluchtig reagens; Het kan irritatie en verwondingen veroorzaken bij contact met de huid en tast bij inademing het centrale zenuwstelsel en het cardiorespiratoire systeem, de lever en de nieren aan. Manipuleer chloroform uitsluitend in een zuurkast en draag handschoenen.
8. Recupereer 800 μL of minder uit de superieure fase naar een nieuwe buis van 2 ml. Voeg 800 μL chloroform toe, meng de inhoud door inversie en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 10.000 x g .
   OPMERKING: In deze stap mogen geen resten van de inferieure fase worden overgebracht naar nieuwe buizen. Wees dus extra voorzichtig bij het recupereren van de superieure fase.
9. Breng 600-800 μL over van de superieure fase naar een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 450 μL isopropanol toe. Meng de inhoud door inversie en incubeer bij 25 °C gedurende 5 min.
10. Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg met behulp van een micropipet. Pas op dat u de pellet die op de bodem van de buis is afgezet, niet weggooit.
11. Voeg 500 μL 80% ethanol toe en centrifugeer gedurende 5 minuten. Herhaal dit twee keer voor het geval de pellet niet geklaard is.
12. Verwijder de ethanol met behulp van een micropipet en droog de pellet gedurende 30-60 minuten bij 37 °C. Voeg 30-50 μL gedeïoniseerd water toe en eluer de pellet met behulp van een micropipet.
13. Houd de buisjes 's nachts op 4 °C voor volledige DNA-elutie en vries de inhoud in bij -20 °C.

7. Totale DNA-extractie uit plantenorganen voor metabarcoding-methodologie (commerciële kit)

OPMERKING: Voor de volgende methodologie is het noodzakelijk om de commerciële kit aan te schaffen die in de materiaaltabel wordt aangegeven als een DNA-extractiekit voor de bodem. Elk materiaal, elke oplossing en elk reagens dat in deze sectie wordt gebruikt, moet steriel zijn. Degenen die niet al gesteriliseerd kunnen worden gekocht, moeten gedurende 20 minuten bij 121 °C worden geautoclaveerd. Het wordt ten zeerste aanbevolen om handschoenen te dragen tijdens het hele protocol en de stappen kunnen worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap. Het beschreven protocol is gewijzigd van De Souza et ^al.12, van het protocol dat door de fabrikant is beschreven.

1. Maal met behulp van porseleinen vijzels de wortels die volgens stap 1.2 zijn verzameld in vloeibare stikstof en reduceer de monsters tot een fijn poeder. Voeg 0,3 g van de gemalen monsters toe aan de PowerBead-buisjes en schud voorzichtig om te homogeniseren.
2. Voeg 60 μL oplossing C1 (meegeleverd in de kit) toe aan de PowerBead-buisjes en meng de inhoud door inversie. Gebruik een weefselhomogenisator en cellyser (Tabel met materialen), bind de buizen stevig vast aan een geschikte steun, koppel de steun aan de vortex en start de apparatuur gedurende 10-20 minuten op maximale snelheid.
   NOTITIE: Als de C1-oplossing is neergeslagen, verwarm deze dan op 60 °C tot deze volledig is opgelost.
3. Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 25 °C. Breng 500 μl van het supernatans over in microcentrifugebuisjes van 2 ml. De overgedragen inhoud kan deeltjes zijn.
4. Voeg 250 μL oplossing C2 toe aan de buisjes en schud gedurende 5 s in een draaikolk. Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 1-2 minuten bij 10.000 x g bij 25 °C.
5. Breng meer dan 600 μl van het supernatans over in nieuwe buisjes van 2 ml, vermijd de pellet. Voeg 200 μL oplossing C3 toe en schud gedurende 5 s op een vortex.
6. Incubeer gedurende 5 minuten bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 25 °C. Zorg er in deze fase voor dat het supernatans geen deeltjes is.
7. Breng meer dan 750 μl van het supernatans over in nieuwe buisjes van 2 ml, vermijd de pellet. Homogeniseer de oplossing C4 goed, voeg 1.100 μL oplossing C4 toe aan de supernatant en schud gedurende 5 s in een vortex.
8. Laad 675 μL uit de inhoud van de buisjes in de MB Spin Columns, over het filter, en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 1 minuut bij 25 °C. Gooi de vloeibare inhoud weg.
9. Herhaal de vorige stap twee keer totdat alle inhoud van elke buis is verwerkt. Voeg vervolgens 500 μL oplossing C5 toe in het midden van het filter dat aanwezig is in de bovenste kolom van de buis en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 25 °C.
10. Gooi de vloeibare inhoud weg en centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden als in de vorige stap. Breng de bovenste kolom van de MB Spin Column voorzichtig over naar nieuwe microcentrifugebuisjes van 2 ml, zodat er geen vloeistof in de kolom druppelt.
11. Voeg 85-100 μL oplossing C6 toe aan het midden van het filter en wacht 1 minuut. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij 25 °C en gooi de MB Spin Column weg. Bewaar de buizen bij -80 °C.

8. DNA-kwantificering in een spectrofotometer (zie de materiaaltabel)

1. Open de software met behulp van de aangegeven spectrofotometer. Selecteer de optie Nucleïnezuur, kies de optie DNA en stel de concentratie in op ng/μL.
2. Voeg 1 μL gedeïoniseerd water toe aan de spectrofotometerdetector en kalibreer door de optie Blanco te selecteren. Veeg de detector na het lezen voorzichtig schoon met zacht tissuepapier.
3. Geef het veldmonster een naam met de isolaatcode van het af te lezen monster en plaats er 1 μL van in de apparatuurdetector. Selecteer de optie Meten; Er wordt een grafiek en een tabel met de resultaten gegenereerd.
4. Herhaal stap 8.3 totdat alle monsters zijn afgelezen. Het wordt aanbevolen om de tabel met de gegenereerde resultaten op te slaan voor record en analyse: selecteer de optie Rapporten en de locatie waar het .xml bestand wordt opgeslagen.
5. Voeg 5 μL gedeïoniseerd water toe aan de detector, wacht enkele minuten en veeg het voorzichtig af met zacht tissuepapier.

Resultaten

In het isolatieprotocol kunnen, gezien het feit dat er sprake is van verontreiniging door het water dat bij de laatste wasbeurt is gebruikt en de verontreiniging ook wordt gedetecteerd in de petrischalen met geïnoculeerde fragmenten, verschillende acties worden ondernomen, afhankelijk van het type verontreiniging (tabel 1). Deze procedure moet vanaf het begin worden herhaald in het geval van sterk sporulerende schimmelverontreinigingen, die ook een versnelde groei vertone...

Discussie

De oppervlakkige ontsmetting van plantenmonsters is een van de meest kritieke fasen in het gepresenteerde protocol. Geen contaminatie in de PDA-vaat met druppels van de laatste wasbeurt is zeer gewenst. Bacteriën worden vaak waargenomen als verontreinigingen in de isolatieschalen, meestal meer dan sporulerende schimmels in de lucht, aangezien endofytische bacteriën ook veel voorkomen in plantenweefsels ^3,11. De toevoeging van antibiotica in het kweekmedium bij he...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Kleefband			(van elk bedrijf, voor kleefbandmontage in micromorfologische analyses)
Ampicilline	Sigma-Aldrich	A5354	(voor installatie van plantfragmenten; andere antibiotica kunnen worden gebruikt - controleer stap 2.2.1)
Autoclaaf			(van elk bedrijf, voor sterilisatie van materialen in veel stappen)
Bacteriologische agar	Sigma-Aldrich	A1296	(voor veel stappen)
C1, C2, C3, C4, C5, en C6 oplossingen	Qiagen	12888-50	(aanschaft met DNeasy PowerSoil kit)
Centrifuge	Merck/Eppendorf	5810 G	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Centrifugebuizen	Merck	CLS430828	(voor monstersverzameling)
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Congo rood	Supelco	75768	(voor hyphaekleuring)
Cryotubes	Merck	BR114831	(voor veel stappen)
Ethanol	Supelco	100983	Het zal nodig zijn om de juiste verdunningen uit te voeren (voor veel stappen)
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Filterpapier	Merck	WHA10010155	(voor veel stappen)
Glasproefbuisjes	Merck	CLS7082516	(voor cryoconservering in ontschillde rijstkorrels)
Glazwol	Supelco	20411	(voor cryoconservering in ontschillde rijstkorrels)
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Of dextrose (voor cryoconservering in vermiculiet)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Of glycerine (voor cryoconservering in vermiculiet, voor het bereiden van LPCB)
Isopropanol	Sigma-Aldrich	563935	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Melkzuur	Sigma-Aldrich	252476	(voor het bereiden van LPCB - hyphaekleuring)
Lactofenolblauw oplossing (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(voor hyphaekleuring)
Laminaire stromingskast			(klasse I, van elk bedrijf, voor veel stappen)
Lichtmicroscoop			(van elk bedrijf, voor hyphae-observatie)
MB Spin Columns	Qiagen	12888-50	(aanschaft met DNeasy PowerSoil kit)
Methylblauw (katoenblauw)	Sigma-Aldrich	M5528	(voor het bereiden van LPCB - hyphaekleuring)
Microcentrifugebuis (1,5 ml)	Merck	HS4323	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Microcentrifugebuis (2 ml)	Merck	BR780546	(voor veel stappen)
Mineraaloliën			(voor conservering van schimmelisolaten)
Papieren zakjes			Gemiddelde grootte 150 mm x 200 mm (voor monstersverzameling)
Petrischaal (Glas, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclaveerbaar, voor schimmelslidecultuur, geef de voorkeur aan hogere)
Petrischaal (Glas, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(voor zuivering van schimmelisolaten); alternatief: polystyreen petrischalen (steriel, γ-bestraald, niet autoclaveerbaar)
Petrischaal (Glas, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(voor installatie van plantfragmenten); alternatief: polystyreen petrischalen (steriel, γ-bestraald, niet autoclaveerbaar)
Fenol	Sigma-Aldrich	P1037	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten, voor het bereiden van LPCB)
Porseleinen vijzel	Sigma-Aldrich	Z247464	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Porseleinen stamper	Sigma-Aldrich	Z247502	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Aardappeldextrose agar (PDA)	Millipore	P2182	(voor veel stappen)
PowerBead buizen	Qiagen	12888-50	(aanschaft met DNeasy PowerSoil kit)
Snel montagemedium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(voor schimmelslidecultuur)
Silicagel	Supelco	717185	(voor cryoconservering in ontschillde rijstkorrels)
Natriumchloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	(voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Natriumlaurylsulfaat (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten)
Natriumhypochloriet (met 2% actief chloor)			(commercieel product, voor oppervlakkige ontsmetting)
Bodem DNA extractiekit (DNeasy PowerSoil kit)	Qiagen	12888-50	(voor totale DNA-extractie uit plantenorganen)
Spectrofotometer - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific	ND2000CLAPTOP	(voor totale DNA-extractie uit plantenorganen)
Stereomicroscoop			(=dissectiemicroscoop, van elk bedrijf, voor macromorfologische analyses)
Tetracycline	Sigma-Aldrich	T7660	(voor installatie van plantfragmenten)
Thermoblok	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(of van andere bedrijven)
Weefselhomogenisator en cellyzer	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Geautomatiseerde weefselhomogenisator en cellyzer (voor totale DNA-extractie uit plantenorganen)
Toluidineblauw O	Sigma-Aldrich/Harleco