Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Mycoheterotrofe planten vertonen een van de meest extreme vormen van mycorrhiza-afhankelijkheid, omdat ze hun autotrofe capaciteit volledig hebben verloren. Net zo essentieel als elke andere vitale hulpbron, zijn de schimmels waarmee deze planten nauw associëren essentieel voor hen. Daarom zijn enkele van de meest relevante technieken bij het bestuderen van mycoheterotrofe soorten degene die het onderzoek van geassocieerde schimmels mogelijk maken, met name die welke wortels en ondergrondse organen bewonen. In deze context worden vaak technieken toegepast voor het identificeren van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke endofytische schimmels. Het isoleren van schimmelendofyten biedt een middel om ze morfologisch te identificeren, hun diversiteit te analyseren en inocula te behouden voor toepassingen in de symbiotische ontkieming van orchideeënzaden. Het is echter bekend dat er een grote verscheidenheid aan niet-kweekbare schimmels is die plantenweefsels bewonen. Cultuuronafhankelijke moleculaire identificatietechnieken bieden dus een bredere dekking van soortendiversiteit en -overvloed. Dit artikel beoogt de methodologische ondersteuning te bieden die nodig is voor het opstarten van twee onderzoeksprocedures: een cultuurafhankelijke en een onafhankelijke. Met betrekking tot het cultuurafhankelijke protocol worden de processen voor het verzamelen en bewaren van plantenmonsters van verzamelplaatsen naar laboratoriumfaciliteiten gedetailleerd, samen met het isoleren van draadvormige schimmels uit ondergrondse en luchtorganen van mycoheterotrofe planten, het bijhouden van een verzameling isolaten, het morfologisch karakteriseren van hyfen door middel van een objectglaasjescultuurmethodologie en moleculaire identificatie van schimmels door totale DNA-extractie. De gedetailleerde procedures omvatten cultuuronafhankelijke methodologieën en omvatten het verzamelen van plantenmonsters voor metagenomische analyses en totale DNA-extractie uit achlorofylachtige plantenorganen met behulp van een commerciële kit. Ten slotte worden ook continuïteitsprotocollen (bijv. polymerasekettingreactie [PCR], sequencing) voorgesteld voor analyses, en technieken worden hier gepresenteerd.
Inleiding
Endofytische schimmels zijn per definitie schimmels die het inwendige van plantenorganen en -weefsels bewonen bij onopvallende infecties (d.w.z. zonder schade toe te brengen aan hun gastheer)1,2. Deze schimmels kunnen neutraal of gunstig interageren met waardplanten, kunnen resistentie verlenen tegen ziekteverwekkers en ongunstige omgevingsomstandigheden, en kunnen bijdragen aan de synthese van nuttige verbindingen voor de plant (bijv. groeifactoren en andere fytohormonen)1,3. Mycorrhiza-endofyten zijn schimmels die mycorrhiza-associaties met de plant ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Verzameling van plantenmonsters
- Monstername voor cultuurafhankelijke methoden
- Graaf voorzichtig de ondergrondse organen; Dit kunnen wortels, stengels, wortelstokken of opslagorganen van de te verzamelen plant zijn. Afgezien van zeer compacte bodems, verzamelt u deze monsters met de hand.
OPMERKING: Het gebruik van hulpmiddelen zoals troffels of schepjes in deze stap is niet aan te raden, omdat dit de fragiele structuren van mycoheterotrofe planten kan beschadigen en weefselbesmetting door niet-endofytische schimmels kan veroorzaken. - Verzamel zoveel mogelijk ondergrondse organen. Bewaar de monsters in papieren zakken i....
- Graaf voorzichtig de ondergrondse organen; Dit kunnen wortels, stengels, wortelstokken of opslagorganen van de te verzamelen plant zijn. Afgezien van zeer compacte bodems, verzamelt u deze monsters met de hand.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In het isolatieprotocol kunnen, gezien het feit dat er sprake is van verontreiniging door het water dat bij de laatste wasbeurt is gebruikt en de verontreiniging ook wordt gedetecteerd in de petrischalen met geïnoculeerde fragmenten, verschillende acties worden ondernomen, afhankelijk van het type verontreiniging (tabel 1). Deze procedure moet vanaf het begin worden herhaald in het geval van sterk sporulerende schimmelverontreinigingen, die ook een versnelde groei vertone.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De oppervlakkige ontsmetting van plantenmonsters is een van de meest kritieke fasen in het gepresenteerde protocol. Geen contaminatie in de PDA-vaat met druppels van de laatste wasbeurt is zeer gewenst. Bacteriën worden vaak waargenomen als verontreinigingen in de isolatieschalen, meestal meer dan sporulerende schimmels in de lucht, aangezien endofytische bacteriën ook veel voorkomen in plantenweefsels 3,11. De toevoeging van antibiotica in het kweekmedium bij he.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen en geen belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
We danken de financiering van FAPESP (2015/26479-6) en CNPq (447453/2014-9). JLSM bedankt CNPq voor productiviteitssubsidies (303664/2020-7). MPP bedankt Capes (master's degree scholarship, proces 88887.600591/2021-00) en CNPq.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Kleefband | (van elk bedrijf, voor kleefbandmontage in micromorfologische analyses) | ||
| Ampicilline | Sigma-Aldrich | A5354 | (voor installatie van plantfragmenten; andere antibiotica kunnen worden gebruikt - controleer stap 2.2.1) |
| Autoclaaf | (van elk bedrijf, voor sterilisatie van materialen in veel stappen) | ||
| Bacteriologische agar | Sigma-Aldrich | A1296 | (voor veel stappen) |
| C1, C2, C3, C4, C5, en C6 oplossingen | Qiagen | 12888-50 | (aanschaft met DNeasy PowerSoil kit) |
| Centrifuge | Merck/Eppendorf | 5810 G | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Centrifugebuizen | Merck | CLS430828 | (voor monstersverzameling) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Congo rood | Supelco | 75768 | (voor hyphaekleuring) |
| Cryotubes | Merck | BR114831 | (voor veel stappen) |
| Ethanol | Supelco | 100983 | Het zal nodig zijn om de juiste verdunningen uit te voeren (voor veel stappen) |
| Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Filterpapier | Merck | WHA10010155 | (voor veel stappen) |
| Glasproefbuisjes | Merck | CLS7082516 | (voor cryoconservering in ontschillde rijstkorrels) |
| Glazwol | Supelco | 20411 | (voor cryoconservering in ontschillde rijstkorrels) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Of dextrose (voor cryoconservering in vermiculiet) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Of glycerine (voor cryoconservering in vermiculiet, voor het bereiden van LPCB) |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Melkzuur | Sigma-Aldrich | 252476 | (voor het bereiden van LPCB - hyphaekleuring) |
| Lactofenolblauw oplossing (LPCB) | Sigma-Aldrich | 61335 | (voor hyphaekleuring) |
| Laminaire stromingskast | (klasse I, van elk bedrijf, voor veel stappen) | ||
| Lichtmicroscoop | (van elk bedrijf, voor hyphae-observatie) | ||
| MB Spin Columns | Qiagen | 12888-50 | (aanschaft met DNeasy PowerSoil kit) |
| Methylblauw (katoenblauw) | Sigma-Aldrich | M5528 | (voor het bereiden van LPCB - hyphaekleuring) |
| Microcentrifugebuis (1,5 ml) | Merck | HS4323 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Microcentrifugebuis (2 ml) | Merck | BR780546 | (voor veel stappen) |
| Mineraaloliën | (voor conservering van schimmelisolaten) | ||
| Papieren zakjes | Gemiddelde grootte 150 mm x 200 mm (voor monstersverzameling) | ||
| Petrischaal (Glas, 120 mm x 20 mm) | Merck/Pyrex | SLW1480/10D | (autoclaveerbaar, voor schimmelslidecultuur, geef de voorkeur aan hogere) |
| Petrischaal (Glas, 50 mm x 17 mm) | Merck/Aldrich | Z740618 | (voor zuivering van schimmelisolaten); alternatief: polystyreen petrischalen (steriel, γ-bestraald, niet autoclaveerbaar) |
| Petrischaal (Glas, 80 mm x 15 mm) | Merck/Brand | BR455732 | (voor installatie van plantfragmenten); alternatief: polystyreen petrischalen (steriel, γ-bestraald, niet autoclaveerbaar) |
| Fenol | Sigma-Aldrich | P1037 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten, voor het bereiden van LPCB) |
| Porseleinen vijzel | Sigma-Aldrich | Z247464 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Porseleinen stamper | Sigma-Aldrich | Z247502 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Aardappeldextrose agar (PDA) | Millipore | P2182 | (voor veel stappen) |
| PowerBead buizen | Qiagen | 12888-50 | (aanschaft met DNeasy PowerSoil kit) |
| Snel montagemedium (Entellan) | Sigma-Aldrich | 1.0796 | (voor schimmelslidecultuur) |
| Silicagel | Supelco | 717185 | (voor cryoconservering in ontschillde rijstkorrels) |
| Natriumchloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Natriumdodecylsulfaat (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | Natriumlaurylsulfaat (voor totale DNA-extractie uit schimmelisolaten) |
| Natriumhypochloriet (met 2% actief chloor) | (commercieel product, voor oppervlakkige ontsmetting) | ||
| Bodem DNA extractiekit (DNeasy PowerSoil kit) | Qiagen | 12888-50 | (voor totale DNA-extractie uit plantenorganen) |
| Spectrofotometer - Nanodrop 2000/2000c | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | (voor totale DNA-extractie uit plantenorganen) |
| Stereomicroscoop | (=dissectiemicroscoop, van elk bedrijf, voor macromorfologische analyses) | ||
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | (voor installatie van plantfragmenten) |
| Thermoblok | Merck/Eppendorf | EP5362000035 | (of van andere bedrijven) |
| Weefselhomogenisator en cellyzer | SPEX SamplePrep | 2010 Geno/Grinder - Geautomatiseerde weefselhomogenisator en cellyzer (voor totale DNA-extractie uit plantenorganen) | |
| Toluidineblauw O | Sigma-Aldrich/Harleco |
Referenties
- de Azevedo, J. L. Endophytic microorganisms. Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).
- Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. An overview of endophytic microbes: endophytism defined. Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).
- Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer
