Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Samenvatting

De meeste bacteriën, waaronder mycobacteriën, genereren extracellulaire blaasjes (EV's). Aangezien bacteriële EV's (bEV's) een subset van cellulaire componenten bevatten, waaronder metabolieten, lipiden, eiwitten en nucleïnezuren, hebben verschillende groepen de native of recombinante versies van bEV's geëvalueerd op hun beschermende potentie als subeenheid-vaccinkandidaten. In tegenstelling tot native EV's zijn recombinante EV's moleculair gemanipuleerd om een of meer immunogenen van belang te bevatten. In het afgelopen decennium hebben verschillende groepen verschillende benaderingen onderzocht voor het genereren van recombinante bEV's. Hier rapporteren we echter het ontwerp, de constructie en de verrijking van recombinante mycobacteriële EV's (mEV's) in mycobacteriën. Daarvoor gebruiken we Mycobacterium smegmatis (Msm), een avirulente bodemmycobacterie als modelsysteem. We beschrijven eerst de generatie en verrijking van native EV's van Msm. Vervolgens beschrijven we het ontwerp en de constructie van recombinante mEV's die ofwel mCherry bevatten, een rood fluorescerend reportereiwit, ofwel EsxA (Esat-6), een prominent immunogeen van Mycobacterium tuberculosis. Dit bereiken we door mCherry en EsxA N-termini afzonderlijk te fuseren met de C-terminus van een klein Msm-eiwit Cfp-29. Cfp-29 is een van de weinige overvloedig aanwezige eiwitten van MsmEV's. Het protocol voor het genereren en verrijken van recombinante mEV's uit Msm blijft identiek aan het genereren en verrijken van native EV's van Msm.

Inleiding

Ondanks de ontwikkeling en toediening van een breed scala aan vaccins tegen infectieziekten, vindt zelfs tot op de dag van vandaag ~30% van alle menselijke sterfgevallen nog steeds plaats door overdraagbare ziekten^. Vóór de komst van het tuberculosevaccin (tbc) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - was tuberculose doodsoorzaak nummer één (~10.000 tot 15.000/100.000 inwoners)². Met de toediening van BCG en gemakkelijke toegang tot eerste- en tweedelijns anti-tbc-medicijnen, is het aantal tbc-gerelateerde sterfgevallen in 2022 dramatisch gedaald tot ~1 miljoen/jaar in 2022 (d.w.z. ~15-20/100.000 inwoners¹). In tbc-endemische populaties van de wereld blijven tbc-gerelateerde sterfgevallen echter ~100-550/100.000 inwoners¹. Hoewel experts verschillende redenen erkennen die tot deze scheve cijfers leiden, lijkt BCG-gemedieerde bescherming die zelfs het eerste decennium van het leven niet duurt, de belangrijkste reden te zijn 3,4,5,6,7. Bijgevolg is er, gezien de vernieuwde 'Sustainable Development Goals' van de VN en de 'End TB Strategy' van de WHO, een gezamenlijke wereldwijde inspanning om een veel beter vaccinalternatief voor BCG te ontwikkelen dat misschien levenslange bescherming tegen tuberculose biedt.

Om dat doel te bereiken, evalueren verschillende groepen momenteel gemodificeerde/recombinante BCG-stammen, niet-pathogene en verzwakte mycobacteriële soorten anders dan BCG, en subeenheidkandidaten 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Doorgaans zijn subeenheidvaccins liposomen die selectief zijn geladen met enkele gezuiverde (~1-6) volledige of afgeknotte immunogene eiwitten van de ziekteverwekker. Echter, vanwege hun onechte vouwen in niet-inheemse conformaties en/of willekeurige niet-functionele interacties tussen de geladen eiwitten, missen subeenheden vaak native en germane epitopen en slagen ze er daarom niet in om het immuunsysteem voldoende te primen^14,19,20.

Bijgevolg zijn extracellulaire blaasjes (EV's) van bacteriën in een stroomversnelling gekomen als een veelbelovend alternatief 21,22,23,24,25,26. Doorgaans bevatten bacteriële EV's (bEV's) een subset van hun cellulaire componenten, waaronder enkele delen nucleïnezuren, lipiden en honderden metabolieten en eiwitten^27,28. In tegenstelling tot liposomen waar een paar gezuiverde eiwitten kunstmatig worden geladen, bevatten bEV's honderden natuurlijk geladen, native-gevouwen eiwitten met een betere neiging om het immuunsysteem te stimuleren, vooral zonder de boost/hulp van adjuvantia en Toll-like receptor (TLR) agonisten^27,28,29. Het is in deze onderzoekslijn dat wij en anderen het nut van mycobacteriële EV's hebben onderzocht als potentiële subunit-boosters voor BCG³⁰. Ondanks de bezorgdheid dat bEV's geen uniforme antigeenbelasting hebben, hebben EV's van verzwakte Neisseria meningitidis mensen met succes beschermd tegen serogroep B-meningokokken^31,32.

In ieder geval theoretisch zijn de beste EV's die BCG goed zouden kunnen stimuleren de EV's die zijn verrijkt met pathogene bacteriën. Het verrijken van EV's gegenereerd door pathogene mycobacterium is echter duur, tijdrovend en riskant. Bovendien kunnen door ziekteverwekkers gegenereerde EV's virulenter dan beschermend zijn. Gezien de potentiële risico's rapporteren we hier een goed getest protocol voor de verrijking van EV's gegenereerd door axenisch gekweekte Msm, een avirulente mycobacterie.

Ondanks het feit dat ze coderen voor verschillende orthologen van pathogene eiwitten, missen avirulente mycobacteriën verschillende vaccinantigenen/pathogene eiwitepitopen die nodig zijn om het immuunsysteem voldoende voor te bereiden op bescherming³³. Daarom hebben we ook onderzoek gedaan naar het construeren en verrijken van recombinante EV's van Msm door middel van moleculaire engineering, zodat een aanzienlijk deel van elk pathogeen eiwit dat van belang is en wordt uitgedrukt en vertaald in Msm, zijn EV's moet bereiken. We veronderstelden dat een of meer van de top 10 overvloedige eiwitten van Msm EV's, wanneer ze worden gefuseerd met het eiwit van belang, zullen helpen bij een dergelijke translocatie.

Terwijl we begonnen met het standaardiseren van de verrijking van mycobacteriële EV's (mEV's) in ons laboratorium, rapporteerden Prados-Rosales et al. in 2011 voor het eerst de visualisatie en verrijking van mEV's in vitro³⁰. Later, in 2014, publiceerde dezelfde groep een aangepaste versie van hun methode uit 2011³⁴. In 2015 rapporteerden Lee et al. ook een onafhankelijk gestandaardiseerde methode voor mEV-verrijking, opnieuw uit axenische culturen van mycobacteriën³⁵. Door beide protocollen 34,35 te combineren en enkele van onze wijzigingen op te nemen na grondige standaardisatie^, beschrijven we hier een protocol dat helpt bij het routinematig verrijken van mEV's uit axenische culturen van mycobacteriën³⁶.

Hier beschrijven we in het bijzonder de verrijking van Msm-specifieke EV's, wat een uitbreiding is van een gepubliceerd protocol³⁶ voor de verrijking van mycobacteriële EV's in het algemeen. We beschrijven ook hoe we recombinante mEV's (R-mEV's) kunnen construeren die het mCherry-eiwit bevatten (als een rode fluorescerende reporter) en EsxA (Esat-6)^37,38,39, een overheersend immunogeen en een potentiële subeenheid vaccinogeen van Mycobacterium tuberculosis. Het protocol voor het verrijken van de R-mEV's blijft identiek aan het protocol dat we hebben beschreven voor het verrijken van native EV's van Msm.

Protocol

1. Groeiomstandigheden van Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli en hun derivaten

1. Media
   1. Middlebrook 7H9 vloeibare bouillon
      1. Bereid 20% Tween-80 bouillonoplossing door het benodigde volume dubbel gedestilleerd water (ddw) in een glazen bekerglas voor te verwarmen tot ~45-50 ^°C in een magnetron, voeg het vereiste volume Tween-80 toe met behulp van een geschikte maatcilinder en roer continu op een kleine magnetische roerder om de 20% Tween-80 in een uniforme oplossing te brengen. Filtreer de 20% Tween-80 door een 0,22 um verwijderingsfilter en bewaar de lichtgele stockoplossing bij 4 ^°C.
         OPMERKING: Alle sporen van Tween-80 in de maatcilinder moeten in het bekerglas worden overgebracht voor een nauwkeurige eindconcentratie. Autoclaaf de voorbereide Tween-80-voorraad niet. Filter (gebruik 0,22 μM), steriliseer en bewaar bij 4 ^°C.
      2. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding van de 7H9 bouillon. Suspendeer 4,7 g 7H9 poeder in 900 ml ddw. Voeg 2 ml glycerol toe, meng de inhoud en autoclaaf bij 121 ^°C, 15 psi gedurende 20 minuten.
         NOTITIE: Voeg geen Middlebrook ADC-verrijking (ADC) en Tween-80 toe vóór het autoclaveren.
      3. Nadat de geautoclaveerde media zijn afgekoeld tot kamertemperatuur (RT, d.w.z. ~25 ^oC), voegt u in een standaard A2-type bioveiligheidskast aseptisch 10x voorraad van 100 ml ADC (laatste 1x) en 2,5 ml (laatste 0,05%) 20% Tween-80 toe. Filtreer het mengsel door een wegwerpfiltereenheid van 0,22 μm en bewaar de zeer lichte geelgroene, transparante stockoplossing bij 4 ^°C.
         OPMERKING: De pH van het medium moet ~6.6 tot 6.8 zijn (als <6.4 of >7.0 is, gooi het dan weg en maak het opnieuw). Bewaren bij 4 ^°C (3-4 weken stabiel). Het wordt ten zeerste aanbevolen om de 7H9-media (na toevoeging van ADC en Tween-80) twee keer te filteren door twee onafhankelijke wegwerpfiltereenheden van 0,22 μm.
   2. Sauton's (minimale media) vloeibare bouillon
      1. Los L-asparagine (0,4% m/v) en citroenzuur (0,2% m/v) op in 950 ml ddw. Voeg 1 ml vers bereide 1.000x bouillon (in ddw) dibasisch kaliumfosfaat toe (kleurloos; bouillon 10 g/20 ml; laatste 1x 0,5 g/l); magnesiumsulfaat-heptahydraat (kleurloos; voorraad 10 g/20 ml; laatste 1x 0,5 g/l); en ijzerammoniumcitraat (zeer lichtbruin; bouillon 1,6 g/40 ml; laatste 1x 0,04 g/l) en roer goed op een magneetroerder.
         OPMERKING: In het beste geval kunnen de 1.000x aandelen 2 weken oud zijn; indien ouder dan dat, bereid verse bouillons voor; bewaar ze bij RT in het donker (bijv. in een kast/plank). Als het ijzerammoniumcitraat donkerbruin is, gooi het dan weg en maak het vers. Het is het beste om de drie zouten toe te voegen in de volgorde die in stap 1.1.2.1 wordt vermeld. Draai de oplossing elke keer rond voordat u elke zoutoplossing toevoegt.
      2. Meet en noteer de pH met behulp van een pH-meter; Zorg ervoor dat het rond de 3.1 tot 3.2 ligt. Als de pH hoger is dan 3,7, gooi de bouillons dan weg en bereid ze vers voor. Om de pH op 7,4 te brengen, gebruikt u zoveel druppels 10 N natriumhydroxide als nodig is. Controleer de uiteindelijke pH terwijl u de oplossing/media continu roert op een magnetische roerder.
      3. Voeg 4,76 ml glycerol toe, 0,25 ml 20% Tween-80 (laatste 0,005%, zie ook opmerking bij stap 2.2.1.3) en vul dan het volume aan tot 1 L. Filter vervolgens tweemaal de 1 L medium met twee afzonderlijke verwijderingsfilters van 0,22 μm. Bewaar het heldere, kleurloze medium bij 4 ^°C (stabiel gedurende 2 weken).
         OPMERKING: Pas nadat de pH is aangepast aan 7.4, voeg glycerol toe. Anders worden de media troebel wit. Als het troebel is, gooi het dan weg (probeer het niet te verwarmen) en bereid het vers voor. Gebruik voor alle mEV's-bereidingen vers bereide Sauton's.
   3. Middlebrook 7H11 agar basis
      1. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding. Suspendeer 19 g 7H11 poeder in 900 ml ddw. Voeg 5 ml glycerol toe, draai op een magneetroerder om een uniforme suspensie te verkrijgen (lichtgroen; pH 6,6 tot 6,8; indien >7,2, gooi weg en bereid vers) en autoclaaf bij 121 ^°C, 15 psi, en gedurende 20 minuten.
         OPMERKING: Voeg geen ADC en 0.05% Tween-80 toe voor het autoclaveren.
      2. Wanneer het medium is afgekoeld tot ~50 ^oC, voeg dan aseptisch in een bioveiligheidskast van het type A2 100 ml ADC (naar RT gebracht) en 2,5 ml 20% (laatste 0,05%) Tween-80 (naar RT gebracht) toe. Onmiddellijk aseptisch doseren in petrischalen.
         OPMERKING: Platen zijn stabiel bij 4 ^°C gedurende ten minste 4-6 weken. Zorg ervoor dat de platen een nacht op RT staan voordat u de platen inpakt voor opslag van 4 ^°C. Anders komt er tijdens de incubatie bij 37 ^°C vocht vast te zitten in de platen.
   4. Miller Luria Bertani (LB) bouillon en Agar basis
      1. Volg de instructies van de fabrikant voor de bereiding. Om LB Bouillon te bereiden, suspendeert u 25 g poeder in 1.000 ml ddw en roert u gedurende 5 minuten zachtjes in een glazen bekerglas op een magneetroerder. Na uniforme suspensie, aliquoteert u de vereiste volumes in mediaflessen (bijv. 300 ml in een mediafles van 500 ml) en autoclaaf. Om LB Agar te bereiden, suspendeert u 40 g poeder in 1.000 ml ddw en autoclaaf (12 g poeder in 300 ml ddw in een glazen mediafles van 500 ml).
2. Groei-omstandigheden
   OPMERKING: Alle stappen van het bacteriekweekwerk moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast (type A2). Alle culturen moeten worden verwerkt met steriele buisjes, kolven en pipetpunten.
   1. Dag 1
      1. Voeg 1 ml glycerolvoorraad Msm (van -80 ^oC vriezer) toe aan 2 x 10 ml (in 50 ml steriele conische gecentrifugeerde buisjes) vers geautoclaveerde, gekoelde en voorverwarmde (~37 ^oC) 7H9 bouillon, draai driemaal, sluit de deksels en incubeer de buisjes een nacht bij 37 ^°C en 200-220 tpm (incubatorschudder).
         OPMERKING: Om Mycobacterium tuberculosis (Mtb) te kweken, volgt u vergelijkbare stappen, maar incubeert u de buisjes van 50 ml gedurende 4-6 dagen bij 37 ^°C en 120-150 tpm (couveuseschudder) in BSL3-instellingen. Volg ALLE internationale richtlijnen en bioveiligheidspraktijken van BSL3- en risicogroep 3-pathogenen bij het hanteren en weggooien van Mtb en zijn culturen. Gebruik een bioveiligheidskast van het type B2 voor het hanteren van Mtb en zijn culturen.
   2. Dag 2
      1. Wanneer OD 600 (een_600nm; celdensitometer) ~1,0 bereikt, centrifugeert u de Msm-culturen gedurende 10 minuten bij 3.200 × g en RT (tafelcentrifuge). Gooi de supernatanten weg met behulp van steriele pipetpunten van 1 ml.
         OPMERKING: De bovenstaande stap blijft hetzelfde voor Mtb-culturen, behalve dat het aantal dagen 4-7 is. Zorg ervoor dat u de bacteriekorrel niet aanraakt met de pipetpunt.
      2. Wassen: Voeg aan elke Msm-pellet 1 ml voorverwarmde Sauton's (at RT) media toe (stap 1.1.2) en resuspendeer voorzichtig met pipetpunten van 1 ml om een gelijkmatige suspensie te verkrijgen. Gebruik steriele pipetpunten om de volumes aan te vullen tot 10 ml (in elk) met hetzelfde medium. Centrifugeer de suspensies gedurende 10 minuten bij 3.200 × g en RT en gooi de supernatanten weg. Herhaal deze stap nog een keer.
         OPMERKING: De bovenstaande stap blijft hetzelfde voor Mtb-culturen.
      3. Resuspendeer de tweemaal gewassen Msm-cellen in 20 ml (elk) voorverwarmde Sauton's (voorverwarmd in een plaat of shaker-incubator) en meet de optische dichtheid van de cellen bij 600 nm. Inoculeer het vereiste volume Msm-culturen in steriele erlenmeyers van 1 L die ~330 ml steriele Sauton's bevatten, zodat de uiteindelijke OD₆₀₀ ~0,05 is.
         OPMERKING: Suspensies moeten altijd in een klein volume beginnen. Als het uiteindelijke volume in één stap direct aan de pellet wordt toegevoegd, blijven de cellen over als diffuse pellets (een indicator van slechte resuspensie). De enige manier om het probleem op te lossen, is door de culturen te verlagen en de resuspensie opnieuw uit te voeren zoals aanbevolen. De bovenstaande stap blijft hetzelfde voor Mtb-culturen.
   3. Dag 2/3
      1. Incubeer de cultuur van 330 ml in de incubatorschudder bij 200 tpm en 37 ^°C totdat de kweek OD_{600 ~0,3} bereikt. Was vervolgens de cellen één keer (vergelijkbaar met stap 1.2.2.2 maar met hetzelfde volume) en resuspendeer de pellet vervolgens in hetzelfde volume. Verdeel 50 ml van de geresuspendeerde culturen elk in zes steriele erlenmeyers van 1 liter, die elk 280 ml steriele voorverwarmde Sauton's bevatten met 1/10^van de normaal gebruikte (0,05%) Tween-80, d.w.z. 0,005% (zie ook de opmerking bij stap 2.2.1.3. om te begrijpen waarom 1/10^e). De uiteindelijke OD₆₀₀ moet ca. 0,05 bedragen.
         OPMERKING: Gebruik voor Mtb-culturen in plaats van erlenmeyers rolflessen (met een inhoud van 1/2/4 liter). Stel het kweekvolume per fles zo in dat wanneer het op het rolapparaat wordt bewaard, de cultuur de opening van de fles niet bereikt. Het werkelijke volume in de rolfles is afhankelijk van de capaciteit van de rolfles.
      2. Incubeer elk van de culturen van 330 ml in de incubatorschudder bij 200 tpm en 37 ^°C totdat OD₆₀₀ 2,0 tot 2,5 bereikt (~15-18 uur).
         OPMERKING: Zorg er voor Mtb-culturen voor dat de uiteindelijke OD₆₀₀ ~1.0-1.2 is (duurt ~5-8 dagen).

2. Verrijking van Msm-mEV's door gebruik te maken van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

1. Dag 4
   1. Centrifugeer de ~2 L Msm-culturen in het midden van de exponentiële fase in 6 x 400 ml steriele centrifugeflessen bij 4 ^°C gedurende 20 minuten bij ~8.000 × g (vloermodel centrifuge). Verzamel het gebruikte media-/cultuursupernatans in twee voorgekoelde, geautoclaveerde erlenmeyers van 1 liter en bewaar een aliquot van de pellet voor eventuele analytische procedures (zoals SDS-PAGE en western blotting - hier niet beschreven).
      NOTITIE: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd in koude (~ 4 °C) om de integriteit van de mEV's beter te behouden. De mEV's zijn vrij stabiel bij RT, maar koeling is een must voor stabiliteit op lange termijn (herhaaldelijk invriezen en ontdooien wordt niet aanbevolen). Tijdens axenische cultuurgroei distantiëren mEV's zich van het oppervlak van Msm/Mtb en hopen ze zich op in de bovenliggende/gebruikte media van de cultuur.
   2. Filtreer het Msm-cultuursupernatans eerst door de 0,45 μm verwijderingsfiltereenheid(en) en vervolgens door de 0,22 μm verwijderingsfiltereenheid(en) om alle sporen van bacteriën te verwijderen.
      OPMERKING: Directe filtratie door de 0.22 μm-filters verstikt vaak de filtereenheden (omdat de bacteriepellet kan worden verstoord tijdens het uitvoeren van stap 2.1.1.). Om Mtb-kweeksupernatanten te genereren, voert u drie filtraties van Mtb-culturen uit (d.w.z. de eerste filtratiestap met een wegwerpfiltereenheid van 0,45 μm; twee opeenvolgende filtratiestappen met wegwerpfiltereenheden van 0,22 μm) voordat de kweekfiltraten naar BSL-2-instellingen worden verplaatst.
2. Dag 4/5
   1. Gebruik de 30 kDa membraanconcentrators om het Msm-cultuurfiltraat (~2 L) te concentreren tot ~ 38 ml door het kweekfiltraat te centrifugeren bij 4 ^°C, 20 min en bij 3.200 × g.
      1. Was de concentrators eerst voor met steriel, koud ddw (~15 ml) (wassen op 4 ^°C, 5 minuten en op 3.200 × g).
      2. Wassen met ~15 ml voorgefilterde, koude Sauton's (zelfde omstandigheden als voor water (2.2.1.1.))) om alle sporen van chemicaliën (gebruikt tijdens de productie) te verwijderen.
      3. Aangezien ~130 centricons (indien slechts één gebruik) technisch vereist zijn om ~2 L kweekfiltraat te concentreren, moet u de centricons indien nodig minstens 3-4 keer hergebruiken. Volg deze stappen: concentreer 15 ml op 0,5 tot 1,0 ml (volg stap 2.2.1), breng het concentraat over in een schone, geautoclaveerde en koude ultracentrifugebuis van 38 ml en breng vervolgens het resterende niet-geconcentreerde kweekfiltraat opnieuw over naar de gebruikte centriconen voor herhalingsconcentratie.
         OPMERKING: Het gebruik van 24, 30 kDa concentrators om 2 L kweekfiltraat te concentreren duurt maximaal 6 uur. Bij het concentreren van het kweekfiltraat wordt de Tween-80 ook geconcentreerd en kan de concentrator blokkeren. Het gebruik van Tween-80 tot 0,005% final (in plaats van 0,05%) in de media van Sauton helpt deze blokkade te voorkomen. De verlaagde concentratie van Tween-80 heeft geen invloed op de uniforme suspensie van Msm tijdens de groei en veroorzaakt geen samenklontering van Msm-cellen. Omdat Mtb-cellen echter klonteren met 0,005% Tween-80, gebruikt u 0,05% Tween-80 voor Mtb-specifieke EV's.
   2. Breng het geconcentreerde Msm-cultuurfiltraat (~38 ml) over in een schone, gewassen (met ddw) en voorgekoelde polypropyleen centrifugebuis van 40-50 ml en onderwerp het aan een centrifugatie in twee stappen, eerst bij 4.000 × g en vervolgens bij 15.000 × g, beide stappen bij 4 ^°C gedurende 20 minuten (om al het vuil te verwijderen). Gebruik hiervoor een centrifuge van het vloertype.
3. Dag 5/6
   1. Breng het kweeksupernatans over in een voorgekoelde polypropyleen ultracentrifugebuis van 38,5 ml en draai het gedurende 4 uur bij 4 ^°C in een ultracentrifuge bij 100.000 × g.
      OPMERKING: Een zwenkbak werkt het beste bij deze snelheid. Zorg ervoor dat u de ultracentrifugebuis tot de rand vult en zorg voor een balans-ultracentrifugebuis van gelijkwaardig gewicht. Als een van beide buizen na het centrifugeren aan de zwenkbak vastzit (wat gebeurt als gevolg van condensatie), verwijder deze dan voorzichtig met een pincet van de rotor. Het wegvegen van het gecondenseerde vocht dat aan de buitenkant van de ultracentrifuge aanwezig is vóór het ultracentrifugeren, voorkomt plakken.
   2. Bewaar het supernatans in een voorgekoelde tube van 50 ml (zie toelichting). Keer de ultracentrifugebuis om op een vers, pluisvrij absorberend papier om sporen van het supernatant te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 600 μL HEPES-bufferoplossing (50 mM HEPES en 150 mM NaCl, pH 7,4; filtreer en steriliseer voor gebruik).
      OPMERKING: Sla het supernatans alleen op als back-up. De inheemse mEV-pellet verschijnt als een geleiachtige vlek met een diameter van 5-7 mm, dof grijsgeel tot doorschijnend. Als er geen pellet zichtbaar is, herhaal dan stap 2.3.1 door de opgeslagen supernatant opnieuw te gebruiken. Als er na herhaling van stap 2.3.1 geen pellet verschijnt, gooi deze dan weg en start opnieuw vanaf stap 1.2. De pellet heeft tijd nodig om te resuspenderen. Het wordt aanbevolen om de HEPES-buffer toe te voegen en deze een nacht bij 4 ^°C te laten staan om deze gemakkelijk opnieuw te kunnen suspen. Resuspendeer voorzichtig maar met herhaald pipetteren (gebruik P200-tips voor een betere resuspensie) tot een gelijkmatige resuspuur.
4. Dag 6
   1. Onderwerpt de geresuspendeerde pellet aan een centrifugatie op basis van dichtheidsgradiënt op basis van 'jodixanol'.
      1. Leg de geresuspendeerde pellet op de bodem van de 13 ml schone, gewassen (met ddw) en voorgekoelde ultraheldere polypropyleen ultracentrifugebuis en meng voorzichtig (gebruik een pipet van 1 ml) met ~4 ml inerte dichtheidsgradiënt 'jodixanol'-oplossing (in de handel verkrijgbaar als een ~60% w/v-oplossing). Na het aanbrengen van de geresuspendeerde pellet op de bodem van de buis (tot een maximum van 5 ml), bedek vervolgens met 1 ml (w/v) elk van 40%, 30%, 20% en 10% subvoorraden 'jodixanol' in de respectievelijke volgorde (bereid subvoorraden (met HEPES-buffer) uit 60% voorraad). Voeg vervolgens 4 ml 6% subvoorraad (bereid uit 60% bouillon met HEPES-buffer) toe aan de bovenkant om de buis te vullen.
         NOTITIE: Bereid het verloop vlak voor gebruik voor; Nooit bewaren en gebruiken.
      2. Weeg de buis voorzichtig (zonder te schudden) in een glazen bekerglas en breng deze voorzichtig over in de rotor van de zwenkbare emmer.
         OPMERKING: Wegen is noodzakelijk om te balanceren met een dummy-buis (ook gewogen).
      3. Dompel het gedurende 16 uur bij 4 ^°C bloot aan ultracentrifugatie bij 141.000 × g.
5. Dag 7
   1. Verwijder voorzichtig het buisje (zie opmerking bij stap 2.3.1) en vang fracties van 1 ml op in vers geautoclaveerde microcentrifugebuisjes; let op de 4e^tot 6e^fracties , die meestal de Msm-mEV's bevatten.
      OPMERKING: De mEV's van deze fracties fractioneren normaal gesproken in drie of vier mEV-banden (één is de hoofdband) die dof wit van kleur zijn. De R-mEV's die mCherry bevatten, fractioneren in de 5e tot 7e^{fractie en} zien er donkerpaars^tot magenta uit. De Mtb EV's fractioneren meestal in de 5e^tot 7e^fractie. De scheiding van de mEV's in de gradiënt hangt af van de gebruikte gradiëntconcentratie en hoe goed de gradiënt gelaagd is. Als mEV's gedeeltelijk scheuren, kunnen ze in eerdere fracties uiteenvallen. Als de na stap 2.3.2 verkregen pellet niet goed wordt geresuspendeerd, vormen de blaasjes ook dichte micropellets die als latere fracties uiteenvallen. We raden aan om de fracties alleen nauwkeurig te verzamelen als de gebruiker wil evalueren welke van de fracties van 1 ml de mEV's bevatten. Gebruikers kunnen op basis van hun gemak in kleinere of grotere fracties aliquoteren. Wanneer we ze voor bepaalde toepassingen gebruiken, bijvoorbeeld door ze te testen als een potentiële subeenheidvaccinbooster voor BCG, beperken we onze verzameling van de mEV's tot minder dan 250 μL van de fracties (waar mEV's fractioneren), zodat we specifiek alleen de mEV-banden kunnen verzamelen en verwerken zoals aangegeven in 2.7.5. Dit helpt om alle sporen van jodixanol die onze stroomafwaartse experimenten kunnen verstoren, effectiever te verwijderen.
6. Dag 8
   1. Pool de mEVs-bevattende fracties, verdun met HEPES-buffer tot 38 ml en herhaal de ultracentrifugatie bij 4 ^°C gedurende 16 uur bij 100.000 × g. Resuspendeer de pellet (zoals in stap 2.3.2 met dezelfde waarschuwingen) in HEPES-buffer of in een buffer die stroomafwaartse experimenten (hier niet beschreven) zoals eiwitschatting, nano-tracking-analyses, negatieve kleuring, transmissie-elektronenmicroscopie, western blotting en immuun-goudetikettering vereisen.
      NOTITIE: Voor een betere resuspensie sonificeert u de mEV-bevattende buis gedurende 10 minuten met behulp van een ultrasone waterbadsonicator. Langer sunicen kan leiden tot scheuren en verlies van intacte mEV's. Indien goed opgehangen, is sonicatie niet nodig. Alle stappen van 2,1 tot 2,6 zijn identiek, terwijl ze door Mtb gegenereerde EV's verrijken.

3. Bouw en verrijking van recombinante mEV's.

OPMERKING: Een van de 10 meest voorkomende eiwitten (geïdentificeerd door massaspectrometrie) van Msm EV's is Cfp-29³⁰. Gezien zijn kleine formaat (29 kDa), eenvoudige secundaire structuur 40, lokalisatie naar het membraan 41 en de neiging om te worden uitgescheiden in gebruikte media in axenische culturen (bijv. als een kweekfiltraateiwit; uitgescheiden door zowel Msm als Mtb^42,43, is het hier gebruikt om een rode fluorescerende reporter en een interessant eiwit (EsxA_Mtb) in mEV's af te leveren. Om dit te bereiken,

1. Gebruik geschikte voorwaartse en achterwaartse primers (tabel 1; compatibel om direct te worden gekloond in een shuttlevector zoals pMV261) voor het amplificeren van cfp-29 van Msm. Met behulp van ~50 ng Msm-genoom-DNA met een hoog molecuulgewicht (~>20 kb) als sjabloon, PCR-amplificeert u het cfp-29-genfragment met een high-fidelity proeflees-DNA-polymerase (zoals Phusion of Q5). Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor PCR.
   OPMERKING: Ontwerp de nodige beperkingsplaatsen in primers voor eenvoudig klonen in elke alternatieve shuttlevector van belang. De PCR-omstandigheden en het volume zijn afhankelijk van het type en merk DNA-polymerase dat wordt gebruikt. Het volume van het reactiemengsel zal variëren afhankelijk van de hoeveelheid DNA-sjabloon en de hoeveelheid proeflezen van DNA-polymerase. Volg de aanbevelingen van de fabrikant voor PCR-omstandigheden, succes van amplificatie en eliminatie van niet-specifiek gloeien van primers.
2. PCR zuivert het geëlueerde amplicon met een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit en verifieert de lengte van het amplicon door middel van standaard agarosegelelektroforese. Verteer het gezuiverde amplicon.
   1. Schat de hoeveelheid gezuiverd amplicon op een spectrofotometer. Gebruik ten minste 2 μg cfp-29 amplicon voor de spijsvertering.
   2. Eerst verteren met BstB1 bij 65 °C gedurende 1 uur (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant), de reactietemperatuur verlagen tot RT en vervolgens verteren met HindIII gedurende 1 uur bij 37 ^°C (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant).
   3. PCR zuivert en elueert het verteerde amplicon in 50 μL geautoclaveerde nucleasevrije ddw.
   4. Schat de concentratie en opbrengst van het verteerde amplicon met behulp van een spectrofotometer. Bewaren bij -20 ^°C tot het afbinden. OPMERKING: Controleer na PCR de ampliconlengte (~798 + 50 bp) en de opbrengst door 10 μL van het PCR-reactiemengsel te elektroforeseren op een agarosegel van 1%. Hoewel dubbele vertering niet mogelijk is met deze combinatie van enzymen, voorkomt een compatibele buffer herhaalde PCR-zuivering en het daaropvolgende verlies van verteerd amplicon. De concentratie van verteerde amplicon varieert met de kit die wordt gebruikt voor PCR-zuivering. Het varieert ook met de lengte (in bp) van eventuele alternatieve vectoren naar keuze.
3. Gebruik de voorwaartse en achterwaartse primers (tabel 1), een proeflezen van DNA-polymerase en ~ 50 ng Mtb-genoom-DNA, PCR-amplificatie esxA- of esxA-3X FLAG-tag-specifiek amplicon. Gebruik ~5 ng van geschikt plasmide-DNA om mCherry te PCR-amplificeren. Plasmide en sequentiedetails staan in aanvullend bestand 1.
   OPMERKING: Gebruik een Glycine, Glycine, Glycine, Glycine, Serine ^44,45(^G4S) linker tussen cfp-29 en mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; voor de start van mCherry helpt de G4S-linker mCherry om geen valse niet-functionele vouwen te ondergaan (inclusief die aangedreven door Cfp-29). Raadpleeg cfp-29, hsp60 promotor, mCherry en esxA-sequenties in aanvullend bestand 1. Plasmiden die als sjablonen voor mCherry dienen, zijn verkrijgbaar bij verschillende plasmide-opslagplaatsen/banken. Er zijn verschillende versies (licht gewijzigde sequenties) van mCherry beschikbaar die gewijzigde voorwaartse en achterwaartse primersequenties vereisen. De primers (tabel 1) helpen bij het versterken van de in aanvullend bestand 1 genoemde mCherry. Fusie van de N-terminus van mCherry/esxA/esxA::3XFLAG naar het C-terminale uiteinde van Cfp-29 werkt goed.
4. Verteer 1 μg DNA van de mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplicons en zuiver verteerd DNA.
   1. Vermaal elke amplicon dubbel met HindIII en HpaI gedurende 1 uur bij 37 ^°C (of volgens de aanbevelingen van de fabrikant).
   2. Gebruik een in de handel verkrijgbare PCR-zuiveringskit en de aanbevelingen van de fabrikant voor het zuiveren van het verteerde amplicon. Elute het verteerde amplicon in 50 μL geautoclaveerd nucleasevrij ddw.
   3. Schat de concentratie en opbrengst van het verteerde amplicon met behulp van een spectrofotometer. Bewaren bij -20 ^°C tot het afbinden.
5. Verteer 2 μg pMV261-Kan^R (aanvullend bestand 1) of een geschikte kloonvector met het (de) enzym(en) naar keuze.
   1. Eerst verteren met BstB1 bij 65 °C gedurende 1 uur (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant), de reactietemperatuur verlagen tot RT en vervolgens verteren met HindIII gedurende 1 uur bij 37 ^°C (type en hoeveelheid buffer en enzym - volgens de aanbevelingen van de fabrikant).
   2. Gel zuiveren en elueren in 50 μL geautoclaveerde nucleasevrije ddw.
   3. Schat de concentratie en opbrengst van de verteerde vector met behulp van een spectrofotometer. Bewaren bij -20 ^°C tot het afbinden.
      OPMERKING: Klonen in één stap met twee fragmenten is mogelijk met de bovenstaande primers voor pMV261. Elke alternatieve shuttle-vector die overleeft als een episoom zal werken. Integratieve plasmiden zullen ook werken, maar de opbrengst van recombinante eiwitten zal relatief lager zijn per celbasis.
6. Ligate en transformeren in een compatibele stam van E. coli.
   1. Gebruik voor ligatie 125 ng van de vector. Gebruik op de juiste manier verteerde mCherry/esxA/esxA::3XFLAG-amplicons in een molaire verhouding van 1:3. Ligatie 's nachts met T4 DNA-ligase (hoeveelheid volgens de aanbevelingen van de fabrikant) bij 16 °C in een gekoeld circulatiewaterbad.
      OPMERKING: Gebruik geschikte controles, zoals alleen vector, met en zonder T4-DNA-ligase om de efficiëntie van de spijsvertering te evalueren en de efficiëntie van het kloonsucces te voorspellen.
   2. Transformatie
      1. Ontdooi NEB5α chemisch competente cellen aliquots (~100 μL per transformatie) op ijs gedurende 15 minuten. Meng twee keer voorzichtig met een steriele pipetpunt. Voeg ligatiemix (tot 20 μL) toe aan de koude competente cellen.
      2. Meng voorzichtig pipetcellen + geligeerd DNA. Incubeer het mengsel nog eens 30 minuten op ijs.
      3. Zorg voor een hitteschok bij 42 °C (in een circulerend waterbad) gedurende 60 s en breng onmiddellijk terug naar ijs gedurende nog eens 15 minuten.
      4. Herstel de getransformeerde cellen door 1 ml SOC-bouillon toe te voegen (2% trypton, 0,5% gistextract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ en 20 mM glucose) en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur bij 200 tpm.
      5. Centrifugeer de teruggewonnen bacteriën in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (3000 × g, RT en 10 min), gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 200 μL steriele, voorverwarmde, vers bereide LB-media en verdeel de suspensie op vers gegoten LB Miller-agarplaten met de vereiste antibiotica in de juiste concentraties.
      6. Incubeer de petrischaaltjes in een bordenincubator die vooraf is ingesteld op 37 ^°C.
7. Screenen (hier niet gedetailleerd) op mogelijke klonen, verifiëren (door middel van kolonie-PCR-/restrictie-enzymen-gebaseerd)⁴⁶ en sequentie (Sanger-sequencing) om fusie te bevestigen.
8. Extraheer plasmide-DNA (~200 ng/1-2 μL; elke in de handel verkrijgbare kit) van de bevestigde kloon (E. coli-achtergrond ) en transformeer deze in vers gemaakte elektrocompetente cellen van Msm.
9. Bereiding van Msm elektrocompetente cellen
   1. Vers gekweekte Msm (zoals in de stappen 1.2.1 en 1.2.2). Was de vers gekweekte Msm zoals in stap 1.3.3 en 1.3.4 (behalve 7H9 + ADC + Tween-80 (rijk) in plaats van Sauton's).
   2. Voeg een aliquot van de gewassen Msm-cellen toe aan een uiteindelijke OD 600 van ~0,05 in een steriele erlenmeyer van₅₀₀ ml met 150 ml rijke media.
   3. Incubeer in de incubatorschudder bij 200 tpm en 37 ^°C tot de kweek OD_{600 ~0,8} tot 1,0 (~12-14 uur) bereikt.
   4. Breng de cultuur over in een voorgekoelde centrifugefles van 400 ml en incubeer gedurende 60-90 minuten op ijs. Pelleteer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten bij 4.000 × g bij 4 ^°C.
   5. Was de cellen twee keer (elke wasbeurt met 150 ml, bij 4.000 × g, 4 ^°C en 15 min) met ijskoud, steriel (geautoclaveerd) 10% glycerol.
      LET OP: Bij elke wasbeurt komt de pellet los. Wees voorzichtig bij het weggooien van het hele supernatans (na elke wasbeurt). Anders gaat het grootste deel van de cellen verloren in het afgedankte supernatant.
   6. Was de cellen nog een keer met 75 ml ijskoude, steriele 10% glycerol met 0,005% Tween-80.
   7. Resuspendeer de celpellet in 7,5 ml 10% glycerol met 0,005% Tween-80 en aliquot in aliquots van 400 μl.
      OPMERKING: Hoewel Msm-elektrocompetente cellen minimaal 4 maanden competent zijn, geven vers bereide elektrocompetente cellen de beste resultaten. Bij gebruik van oude competente cellen verschijnen een paar niet-roze kolonies (blanken) als valse transformanten. Hoe ouder de competente cellen, hoe meer de witte kolonies.
10. Transformatie van Msm
    1. Ontdooi de Msm-competente cellen aliquot op ijs.
       OPMERKING: Ontdooien bij RT en het transformeren van dergelijke cellen levert minder efficiëntie op.
    2. Voeg 1-2 μL plasmide-DNA (~200 ng totaal) toe aan de koude competente cellen, meng voorzichtig met een steriele pipetpunt van 1 ml en breng over in een voorgekoelde steriele elektroporatiecuvet van 2 mm.
    3. Breng de gesloten cuvette met Msm-competente cellen + plasmide-DNA-mix over in de muis van de elctroporator, sluit het deksel voorzichtig en pas een puls (exponentieel vervaltype) toe op 2,5 kV (spanning), 25 μF (capaciteit) en 1000 Ω (weerstand).
    4. Voeg onmiddellijk 1 ml voorverwarmd steriel rijk (7H9 + ADC + Tween-80) medium toe aan de cuvette, meng voorzichtig met een steriele pipetpunt van 1 ml en breng de volledige inhoud over in een steriele buis van 10 ml.
    5. Incubeer de inhoud gedurende 3 uur in een incubatorschudder ingesteld op 37 ^°C en 200 tpm. Draai de inhoud in een microcentrifugebuis (4.000 × g, RT en 10 min), gooi het supernatant weg, resuspendeer de pellet in 200 μL steriel voorverwarmd rijk medium en verdeel de suspensie op vers gegoten 7H11-agarplaten met ADC, Tween-80 en de vereiste antibiotica in de juiste concentraties.
       OPMERKING: Gebruik voor Msm, indien nodig, hygromycine, kanamycine en aprramycine in de eindconcentraties van respectievelijk 50 μg/ml, 25 μg/ml en 50 μg/ml. Msm per se is NIET resistent tegen deze antibiotica. Gebruik deze antibiotica alleen bij gebruik van plasmiden met de juiste resistente genen voor de selectie/groei van transformanten/recombinante Msm-kolonies.
    6. Incubeer de petrischaaltjes in een bordenincubator die vooraf is ingesteld op 37 ^°C. Meestal verschijnen transformanten tussen 3-5 dagen.
       OPMERKING: Als een eiwit van belang giftig is voor Msm, kunnen de transformanten later opduiken of niet opduiken. Kloon in dergelijke gevallen afgekapte versies van de volledige lengte.
    7. Maak glycerolvoorraden van de opkomende Msm-kolonies na verificatie op positieve klonen (zelfde als stap 3.7)
11. Om R-mEV's te verrijken die mCherry- of EsxA-eiwitten bevatten, kweekt u eerst R-Msm die mCherry of exsA of esxA::3X FLAG tot expressie brengt door de stappen 1.2.1 tot en met 1.2.3 te volgen en vervolgens de stappen 2.1 tot en met 2.6 te volgen. om R-mEV's te verrijken. De R-mEV's elueren in de 4e-7e^fracties na de spin van de dichtheidsgradiënt (stap 2.5). De R-mEV's pelleteren na de eerste ultracentrifugatiestap (2.3.1). Nadat u identiek bent aan stap 2.3.1, controleert u of de R-mEV's zichtbaar zijn als een donkerpaarse tot magenta pellet met een diameter van 5-7 mm onderaan in het midden van de ultracentrifuge.
12. Voer westerse analyses⁴⁷ uit (hier niet gedetailleerd) om eiwit(en) van belang te detecteren binnen de verrijkte R-mEV's.

Resultaten

We gebruiken M. smegmatis (Msm) als model mycobacterium om de verrijking van zowel native als recombinante mEV's (R-mEV's) aan te tonen. Dit schematisch samengevatte mEV's verrijkingsprotocol (Figuur 1) werkt ook voor de verrijking van R-mEV's van Msm en native EV's van Mtb (met kleine aanpassingen zoals in protocolnotities van 1.2). Voor de visualisatie van de verrijkte mEV's moeten ze negatief worden gekleurd onder een transmissie-elektronenmicroscoop³⁶ (

Discussie

Aangezien het ontwikkelen van een nieuw tbc-vaccin dat superieur is aan BCG en het kan vervangen, een formidabele uitdaging blijft, streven verschillende groepen als alternatief naar de ontdekking van verschillende subeenheid tbc-vaccins die de potentie van BCG kunnen vergroten en de beschermende duur kunnen verlengen^48,49. Gezien de toenemende aandacht voor bacteriële EV's (bEV's) als potentiële subeenheden en als natuurlijke hulpstoffen^50,51

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A2 type Biosafety Cabinet	Thermo Fisher Scientific, USA		1300 series
Bench top Centrifuge	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Cell densitometer	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Citric Acid	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Dibasic Potassium Phosphate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Double Distilled Water	Merck, USA		~18.2 MW/cm @ 25 oC
Electroporation cuvettes	Bio-Rad, USA		2 mm
Electroporator	Bio-Rad, USA		Electroporator
EsxA-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit polyclonal
Ferric Ammonium Citrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Floor model centrifuge	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Glassware	Borosil, INDIA		1 L Erlenmeyer flasks
Glycerol	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES and Sodium Chloride	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Incubator shakers	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagine	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Broth and Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Magnetic stirrer	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Ab	Abcam, UK		Rabbit monoclonal
Microwave	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Broth	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Broth
Middlebrook ADC enrichment	BD, USA		BBL Middlebrook ADC enrichment
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		a derivative of DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Available as 60% stock solution (in water)
PCR purification kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Plasmid DNA mini kit	Hi Media, INDIA		Hi Media
Plate incubator	Thermo Fisher Scientific, USA		New Series
Plasmid pMV261	Addgene, USA * *The   plasmid   is   no   more available in this plasmid bank		Shuttle vector
Proof-reading DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polymerase
Q5 Proof-reading DNA Polymerase	NEB, USA		NEB
Refrigerated circulating water bath	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC broth	Hi Media, INDIA		Hi Media
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligase	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Ultracentrifuge tubes - 14 mL	Beckman Coulter, USA		Polyallomer type – ultra clear type in SW40Ti rotor
Ultracentrifuge tubes - 38 mL	Beckman Coulter, USA		Polypropylene type– cloudy type for SW28 rotor
Ultrasonics cleaning waterbath sonicator	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator - bench top model
0.22 µm Disposable filters	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Centricon concentrators	Merck, USA		Amicon Ultra centrifugal filters - Millipore
3X FLAG antibody	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Centrifuge bottles	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
50 mL Centrifuge tubes	Corning, USA		Sterile, pre-packed
Bacteria
Strain
Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alpha (a derivative of DH5α).
Msm expressing cfp29::mCherry	This study		MC2  155
Msm expressing cfp29::esxA	This study		MC2  155
Msm expressing cfp29::esxA::3X FLAG	This study		MC2  155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA		MC2  155