Dit protocol richt zich op het gebruik van flowcytometrie en het tellen van kralen om bacteriële sporen te kwantificeren die zijn gelabeld met ethidiumbromide. De methode is ook efficiënt voor het analyseren van de covalente koppeling van eiwitten op het oppervlak van intacte sporen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Verbetering van Bacillus subtilis sporentelling en labelanalyse in flowcytometrie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De sporen van Bacillus subtilis zijn al voorgesteld voor verschillende biotechnologische en immunologische toepassingen; Er is echter een toenemende behoefte aan de ontwikkeling van methodologieën die de detectie van geïmmobiliseerde antigenen op het oppervlak van sporen verbeteren, samen met hun kwantificering. Op flowcytometrie gebaseerde analyses zijn eerder voorgesteld als snelle, betrouwbare en specifieke benaderingen voor het detecteren van gelabelde cellen van B. subtilis. Hierin stellen we het gebruik van flowcytometrie voor om de weergave-efficiëntie van een fluorescerend antilichaam (FA) op het oppervlak van de spore te evalueren en het aantal sporen te kwantificeren met behulp van telkralen.
Hiervoor gebruikten we ethidiumbromide als DNA-marker en een allophycocyanine (APC)-gelabeld antilichaam, dat aan de sporen was gekoppeld, als oppervlaktemarker. De kwantificering van sporen werd uitgevoerd met behulp van telkralen, aangezien deze techniek een hoge nauwkeurigheid aantoont bij de detectie van cellen. De gelabelde sporen werden geanalyseerd met behulp van een flowcytometer, die de koppeling bevestigde. Als gevolg hiervan werd aangetoond dat DNA-etikettering de nauwkeurigheid van kwantificering door flowcytometrie verbeterde, voor de detectie van ontkiemde sporen. Er werd waargenomen dat ethidiumbromide niet in staat was om slapende sporen te labelen; Deze techniek zorgt echter voor een nauwkeurigere bepaling van het aantal sporen met fluorescerend eiwit gekoppeld aan hun oppervlak, wat helpt bij de ontwikkeling van studies die zich richten op het gebruik van sporen als biotechnologisch platform in verschillende toepassingen.
Inleiding
Bacillus subtilis is een staafvormige, grampositieve bacterie die in staat is om slapende sporen te produceren wanneer de omgevingsomstandigheden geen celgroeitoelaten1. Sporen zijn uiterst stabiele celvormen en die van verschillende soorten, waaronder B. subtilis, worden veel gebruikt als probiotica voor menselijk en dierlijk gebruik. Vanwege zijn resistentie- en veiligheidseigenschappen is de spore van B. subtilis, die heterologe eiwitten vertoont, voorgesteld als een mucosale adjuvans, een vaccinafgiftesysteem en een enzym-immobilisatieplatform 3,4
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en software die in dit protocol worden gebruikt.
1. Instelling van de flowcytometrie
- Uitlijning van optische parameters van flowcytometer gekoppeld aan een computer
- Log in op de Cytometer-software.
- Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer | Opstarten en een paar minuten wachten | Schone modus | Zit vloeistoffen.
OPMERKING: Luchtbellen en obstructies werden verwijderd tijdens het initiatieproces van de cytometer, voorafgaand aan de monsterverwerving....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In geautoclaveerde sporenmonsters (AS) werden respectievelijk 2 × 103 sporen/μl en 1 × 103 sporen/μl gedetecteerd met behulp van telkralen en de Petroff-Hausser-methode (Figuur 2).
Figuur 1: Algemeen schema voor de kwantificering van sporen. (A) Sporen gelabeld met EtBr .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Traditionele methoden, zoals het tellen van kolonies, zijn niet alleen tijdrovend, maar vereisen ook levensvatbare cellen en maken het niet mogelijk om geïnactiveerde sporen te kwantificeren5. De Petroff-Hausser-kamer is een alternatieve methodologie, maar vereist een ervaren microscopist om deze uit te voeren. Flowcytometrie is hiervoor een nuttig alternatief gebleken.
Genovese et al.12 beschreven het gebruik van flowcytometrie voor de kwantific.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas met middelen van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). De auteurs danken het Programma voor Technologische Ontwikkeling in Hulpmiddelen voor Gezondheid PDTIS-FIOCRUZ voor het gebruik van zijn faciliteiten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyreen buis, 12 x 75 mm, zonder deksel, niet-steriel |
Referenties
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
