Methodenartikel

Verbetering van Bacillus subtilis sporentelling en labelanalyse in flowcytometrie

DOI:

10.3791/65141

⸱

30 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de diagnóstico e controle de doenças infecciosas na Amazônia, Instituto Leônidas e Maria Deane - Fiocruz Amazônia, 2Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro - Fiocruz Amazônia, 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia PPGH-UEA/HEMOAM, 5Department of Biology, Federico II University, 6Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), 7Laboratório de Imunologia Celular Aplicada à saúde, Fundação Oswaldo Cruz, FIOCRUZ Rondônia, 8Centro Multiusuário para Análises de Fenômenos Biomédicos (CMABio-UEA), Universidade Estadual do Amazonas, 9Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol richt zich op het gebruik van flowcytometrie en het tellen van kralen om bacteriële sporen te kwantificeren die zijn gelabeld met ethidiumbromide. De methode is ook efficiënt voor het analyseren van de covalente koppeling van eiwitten op het oppervlak van intacte sporen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De sporen van Bacillus subtilis zijn al voorgesteld voor verschillende biotechnologische en immunologische toepassingen; Er is echter een toenemende behoefte aan de ontwikkeling van methodologieën die de detectie van geïmmobiliseerde antigenen op het oppervlak van sporen verbeteren, samen met hun kwantificering. Op flowcytometrie gebaseerde analyses zijn eerder voorgesteld als snelle, betrouwbare en specifieke benaderingen voor het detecteren van gelabelde cellen van B. subtilis. Hierin stellen we het gebruik van flowcytometrie voor om de weergave-efficiëntie van een fluorescerend antilichaam (FA) op het oppervlak van de spore te evalueren en het aantal sporen te kwantificeren met behulp van telkralen.

Hiervoor gebruikten we ethidiumbromide als DNA-marker en een allophycocyanine (APC)-gelabeld antilichaam, dat aan de sporen was gekoppeld, als oppervlaktemarker. De kwantificering van sporen werd uitgevoerd met behulp van telkralen, aangezien deze techniek een hoge nauwkeurigheid aantoont bij de detectie van cellen. De gelabelde sporen werden geanalyseerd met behulp van een flowcytometer, die de koppeling bevestigde. Als gevolg hiervan werd aangetoond dat DNA-etikettering de nauwkeurigheid van kwantificering door flowcytometrie verbeterde, voor de detectie van ontkiemde sporen. Er werd waargenomen dat ethidiumbromide niet in staat was om slapende sporen te labelen; Deze techniek zorgt echter voor een nauwkeurigere bepaling van het aantal sporen met fluorescerend eiwit gekoppeld aan hun oppervlak, wat helpt bij de ontwikkeling van studies die zich richten op het gebruik van sporen als biotechnologisch platform in verschillende toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus subtilis is een staafvormige, grampositieve bacterie die in staat is om slapende sporen te produceren wanneer de omgevingsomstandigheden geen celgroeitoelaten1. Sporen zijn uiterst stabiele celvormen en die van verschillende soorten, waaronder B. subtilis, worden veel gebruikt als probiotica voor menselijk en dierlijk gebruik. Vanwege zijn resistentie- en veiligheidseigenschappen is de spore van B. subtilis, die heterologe eiwitten vertoont, voorgesteld als een mucosale adjuvans, een vaccinafgiftesysteem en een enzym-immobilisatieplatform 3,4.

Om sporen van B. subtilis te verkrijgen, is het noodzakelijk om het bloot te stellen aan nutriëntendeprivatie met behulp van een speciaal kweekmedium. Na het verkrijgen en zuiveren van deze sporen, moet men ze kwantificeren om de testefficiëntie te verbeteren 5,6. Zo worden bepaalde methoden toegepast om de concentratie van de verkregen sporen te analyseren. Er kan gebruik worden gemaakt van het tellen van platen en een Petroff-Hausser-kamer, ook wel telkamer genoemd. De laatste is oorspronkelijk ontwikkeld om de concentratie van bloedcellen te bepalen; Het is echter mogelijk om het te gebruiken op het gebied van microbiologie voor het tellen van sporen 7,8. Ondanks dat het de standaardmethode is die wordt gebruikt voor het tellen van cellen, is het lezen arbeidsintensief omdat deze methode volledig handmatig is en de nauwkeurigheid ervan afhangt van de ervaring van de operator.

Op flowcytometrie gebaseerde (FC) analyses zijn eerder voorgesteld als snelle, betrouwbare en specifieke benaderingen voor het detecteren van gelabelde cellen van Bacillus spp. Het gebruik van flowcytometrie telparels heeft de reproduceerbaarheid gegarandeerd bij het tellen van cellen bij routineonderzoeken (absoluut aantal CD4- en CD8 T-lymfocyten) en bij de ontwikkeling van onderzoek met deeltjes die kunnen worden gedetecteerd en geteld met behulp van flowcytometrie9. Godjafrey en Alsharif suggereerden het gebruik van telkralen voor FC-kwantificering van niet-gelabelde sporen10. Het gebruik van flowcytometrie werd beschreven voor de monitoring van sporulatie in Bacillus spp. via het labelen van het sporen-DNA 10,11,12,13. Nog een andere studie gebruikte FC om de hoeveelheid fluorescerend gelabelde eiwitten op het sporenoppervlak te evalueren15.

Deze studie was gericht op het gebruik van commerciële telkralen om een standaard van reproduceerbaarheid te garanderen met betrekking tot het tellen van gebeurtenissen met behulp van flowcytometrie. Hierin suggereren we het gebruik van telkralen voor het tellen van cellen in FC om de sporentelling te verfijnen en de koppelingsefficiëntie van fluorescerend gelabelde antilichamen op het sporenoppervlak te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, instrumenten en software die in dit protocol worden gebruikt.

1. Instelling van de flowcytometrie

  1. Uitlijning van optische parameters van flowcytometer gekoppeld aan een computer
    1. Log in op de Cytometer-software.
    2. Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer | Opstarten en een paar minuten wachten | Schone modus | Zit vloeistoffen.
      OPMERKING: Luchtbellen en obstructies werden verwijderd tijdens het initiatieproces van de cytometer, voorafgaand aan de monsterverwerving.
  2. Kwaliteitscontrole
    1. Gebruik het kwaliteitscontrolereagens om de spanningen van de fotomultiplicatorbuizen aan te passen en hun gevoeligheid te evalueren.
      1. Bereid het reagens voor kwaliteitscontrole voor in een polystyreenbuis.
      2. Om de basislijn te bepalen, bereidt u de suspensiekorrels voor door 0,5 ml verdunningsmiddel (10 mM gefilterd PBS, pH 7) en 3 druppels parels toe te voegen aan de gelabelde buis.
      3. Meng de injectieflacon met kralen door deze voorzichtig om te keren.
    2. Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer | CST om verbinding te maken met de CST-interface. Wacht een paar minuten en observeer de boodschap cytometer losgekoppeld.
    3. Bevestig de polystyreenbuis met het kwaliteitscontrolereagens aan de flowcytometersonde.
  3. Verificatie van de configuratie van de cytometer
    1. Controleer in het venster Systeemoverzicht of de configuratie van de cytometer geschikt is voor het experiment.
    2. Selecteer de batch-ID van de opzetkralen die overeenkomt om te controleren of de geselecteerde lot-ID van de opzetkralen overeenkomt met de huidige partij CS&T-onderzoekskralen.
  4. Prestatiecontrole
    1. Selecteer de optie Prestaties controleren en klik op Uitvoeren.
    2. Na voltooiing van de prestatiecontrole worden de prestatieresultaten weergegeven. Bekijk het prestatierapport van de cytometer. Klik op Voltooien om de prestatiecontrole te voltooien of verwijder het buisje uit de cytometer en bekijk de resultaten in het venster Systeemoverzicht .
    3. Bekijk het eindresultaat van de morfometrische en fluorescentiegevoeligheidsanalyse die zal verschijnen in de | systeemsamenvatting | cytometerprestatieresultaat | met de status: GESLAAGD

2. Bereiding van de sporen

  1. Spoel de sporen na sporulatie 3x af met ultrapuur ijskoud water door centrifugatie bij 17.949 × g gedurende 10 min.
  2. Resuspendeer de pellet die is verkregen bij de laatste centrifugatie met 10 ml ultrapuur water.
  3. Autoclaaf de sporen gedurende 45 minuten bij 121 ºC voor inactivatie van de vegetatieve cellen.
    OPMERKING: Eerdere tests die door onze groep zijn uitgevoerd en waarbij verschillende inactiveringsmethoden werden vergeleken, toonden aan dat de in stap 2.3 genoemde omstandigheden een hoog rendement vertoonden, waarbij geen kolonievorming werd aangetoond in de uitplatingsanalysemethode op het LB-agarmedium.

3. Kwantificering van geautoclaveerde sporen met behulp van flowcytometrie

  1. Neem 50 μl geautoclaveerde sporen en incubeer ze beschermd tegen licht met ethidiumbromide (EtBr, 10 mg/ml verdund in water) bij een verdunningsfactor van 0,05% v/v gedurende 30 minuten (figuur 1A).
  2. Was de sporen 3x met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugatie bij 17.949 × g gedurende 10 min en resuspendeer in 1x PBS.
  3. Voeg 10 μL korrels toe, volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor verdunning.
  4. Analyseer het monster met behulp van een flowcytometer zoals beschreven in stap 4.
    OPMERKING: Het is belangrijk om te benadrukken dat de kralen zo homogeen mogelijk moeten worden gepipetteerd, aangezien er verschillen werden waargenomen in de berekeningen wanneer deze stap niet goed werd uitgevoerd.

4. Analyse met behulp van flowcytometrie

  1. Log in op de Cytometer-software.
  2. Selecteer in de softwarewerkruimte de optie Cytometer | Schone modus | Zit vloeistoffen.
  3. Pas aan de werkruimte aan om de analyse in flowcytometrie te bepalen.
    1. Definieer de poorten voor de analyses (Figuur 2).
      1. Definieer de poortstrategie op basis van de morfometrische en fluorescentiekenmerken van de deeltjes op basis van de negatieve controle (ongemarkeerde sporen).
    2. Als u de celmorfometrie wilt bepalen, kiest u Dotplot-afbeelding voor analyses van FSC-A-parameters op de x-as en SSC-A op de y-as.
    3. Om de fluorescentie te bepalen, kiest u FL3 Dotplot-plots op de y-as met FL5 op de x-as en maakt u de poorten in vier kwadranten.
  4. Gebruik een polystyreenbuis van 12 x 75 mm met stop met niet-gelabelde monsters, eerder gelabeld met eenkleurige EtBr, eenkleurige APC en meerkleurige EtBr+ APC.
  5. Meng de buis met de negatieve controle heel voorzichtig en bevestig deze aan de sonde van de flowcytometer.
  6. Klik op Verwerven.
  7. Stel het vermogen van de lasers in door te navigeren naar Cytometer | Parameters | FSC (375) en SSC (275).
  8. Stel de drempelwaarde in op (500) Cytometer | Drempel.
  9. Om autofluorescentie te verwijderen, analyseert u het kleurstofvrije monster dat alleen sporen bevat.
  10. Pas de spanningen voor de filterdetectoren aan: FL3 (603) en FL5 (538) om negatieve en positieve populaties te onderscheiden met betrekking tot de gekozen fluorescentie in de controles. Cytometer | Parameters.
  11. Cytometer | Vergoeding | Stel de offset van de FL5/FL3-instellingen in op 1.0.
  12. Configureer het apparaat na morfometrie en fluorescentieanalyse voor acquisitie 30.000 gebeurtenissen | Experimenteer | Lay-out van experimenten | Acquisitie |30.000 evenementen....
  13. Nadat u de parameters hebt aangepast, verkrijgt u gegevens voor de monsters die zijn gelabeld en kralen bevatten in de flowcytometer.
  14. Bereken de sporenconcentratie zoals beschreven in de instructies van de fabrikant met behulp van vergelijking (1).
    figure-protocol-1(1)
    OPMERKING: Voor dit onderzoek werd de kwantificeringsmethode van de kraal vergeleken met de Petroff-Hausser telkameranalyse. Bovendien werd de etikettering van geautoclaveerde sporen vergeleken met de etikettering van niet-geautoclaveerde sporen.

5. Schatting van de eiwitkoppelingsindex op een sporenoppervlak met behulp van flowcytometrie

  1. Oogst door centrifugatie van 50 μl sporen (103/μl) 17.949 × g gedurende 10 minuten en resuspendeer vervolgens met 25 μl 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) (300 mM)).
  2. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 25 μL N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) (50 mM) toe aan de sporensuspensie en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Was de sporen 3x met 1x PBS door middel van centrifugeren zoals beschreven in stap 5.1.
  5. Voeg fluorescerend eiwit toe en laat de monsters een nacht bij 15 °C staan.
    OPMERKING: Het fluorescerende eiwit dat in dit werk werd gebruikt, was een APC-gelabeld anti-humaan IL-10-antilichaam. Dit antilichaam werd gebruikt als model voor studie, hoewel de toepassing van andere fluorescerende moleculen mogelijk is omdat EDC/NHS een covalente ligatie bevorderen tussen -COOH- en -NH2-groepen die aanwezig zijn in eiwitten op het sporenoppervlak.
  6. Was de sporen volgens stap 5.3.
  7. Voeg 10 mg/ml ethidiumbromide verdund tot 1:50 toe en laat 1 uur op ijs staan en beschermd tegen licht (figuur 1B).
  8. Was de sporen volgens stap 5.3.
  9. Herhaal stap 4.
  10. Om de fluorescentie te bepalen, wijzigt u de parameters FL3 op de X-as en FL5 op de Y-as van de dotplot.
  11. Analyseer het monster met behulp van een flowcytometer met de blauwe laser (488 nm) in FL3 (670 LP-filter) en de rode laser (633 nm) in FL5 (660/20-filter), zoals beschreven in stap 4.
    OPMERKING: Dezelfde monsters werden geanalyseerd op immunofluorescentie op objectglaasjes onder een microscoop, met een vergrotingsbereik van 1.000 x en met behulp van de volgende filters: FITC 480/30 nm (groen) en TRITC 540/25 nm (rood).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In geautoclaveerde sporenmonsters (AS) werden respectievelijk 2 × 103 sporen/μl en 1 × 103 sporen/μl gedetecteerd met behulp van telkralen en de Petroff-Hausser-methode (Figuur 2).

figure-results-1
Figuur 1: Algemeen schema voor de kwantificering van sporen. (A) Sporen gelabeld met EtBr ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionele methoden, zoals het tellen van kolonies, zijn niet alleen tijdrovend, maar vereisen ook levensvatbare cellen en maken het niet mogelijk om geïnactiveerde sporen te kwantificeren5. De Petroff-Hausser-kamer is een alternatieve methodologie, maar vereist een ervaren microscopist om deze uit te voeren. Flowcytometrie is hiervoor een nuttig alternatief gebleken.

Genovese et al.12 beschreven het gebruik van flowcytometrie voor de kwantific...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas met middelen van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). De auteurs danken het Programma voor Technologische Ontwikkeling in Hulpmiddelen voor Gezondheid PDTIS-FIOCRUZ voor het gebruik van zijn faciliteiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(N-hydroxysuccinimide) (NHS)Sigma130672
Anti-human fluorescent antibodyBioLegend501410APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibodyThermo ScientificA32723Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II BDFlow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)BD642412Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3BD643629Software
Centrifuge MegaFuge 8RThermo Scientific75007213
Counting BeadsBD340334TruCount Tubes
Eclipse 80iNikonFluorescent Microsope
Ethidium BromideLudwig Biotec
Phosphate buffered salineSigma-AldrichA4503
Plastic MicrotubesEppendorf
Polystyrene tubeFalcon3520085 mL polystyreen buis, 12 x 75 mm, zonder deksel, niet-steriel

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
  2. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
  3. Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115(2014).
  4. Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
  5. Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
  6. Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
  7. Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99(2016).
  8. Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
  9. Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
  10. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
  11. Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989(2019).
  12. Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336(2021).
  13. Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
  14. Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
  15. Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102(2019).
  16. Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Bacillus subtilis sporenfluorescerende antilichaamlabelingtelkralenethidiumbromide kleuringrustende sporengekiemde sporendetectie van oppervlakteantigenenkoppeling van fluorescerende eiwitten

Gerelateerde artikelen