Formulering en karakterisering van bioactieve stof die nanoschijven bevat

Summary

Hier beschrijven we de productie en karakterisering van bioactieve stoffen die nanoschijven bevatten. Amfotericine B nanoschijven worden als voorbeeld genomen om het protocol stapsgewijs te beschrijven.

Abstract

De term nanoschijf verwijst naar een discreet type nanodeeltje dat bestaat uit een tweelaags lipide, een steigereiwit en een geïntegreerd bioactief middel. Nanoschijven zijn georganiseerd als een schijfvormige lipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door het steigereiwit, meestal een lid van de uitwisselbare apolipoproteïnefamilie. Talrijke hydrofobe bioactieve stoffen zijn efficiënt opgelost in nanoschijven door hun integratie in het hydrofobe milieu van de lipide bilayer van het deeltje, wat een grotendeels homogene populatie deeltjes oplevert in het bereik van 10-20 nm in diameter. De formulering van nanoschijven vereist een nauwkeurige verhouding van individuele componenten, een geschikte sequentiële toevoeging van elke component, gevolgd door badsonificatie van het formuleringsmengsel. Het amfipathische scaffold-eiwit maakt spontaan contact met en reorganiseert het gedispergeerde dubbellaagse mengsel van lipide / bioactieve stof om een discrete, homogene populatie van nanoschijfdeeltjes te vormen. Tijdens dit proces gaat het reactiemengsel over van een ondoorzichtig, troebel uiterlijk naar een geklaard monster dat, wanneer het volledig is geoptimaliseerd, geen neerslag oplevert bij centrifugeren. Karakteriseringsstudies omvatten de bepaling van de oplosefficiëntie van bioactieve stoffen, elektronenmicroscopie, gelfiltratiechromatografie, ultraviolet zichtbare (UV / Vis) absorptiespectroscopie en / of fluorescentiespectroscopie. Dit wordt normaal gesproken gevolgd door een onderzoek naar biologische activiteit met behulp van gekweekte cellen of muizen. In het geval van nanoschijven die een antibioticum bevatten (d.w.z. het macrolide polyeenantibioticum amfotericine B), kan hun vermogen om de groei van gist of schimmels te remmen als functie van concentratie of tijd worden gemeten. Het relatieve gemak van formulering, veelzijdigheid met betrekking tot componenten, deeltjesgrootte op nanoschaal, inherente stabiliteit en waterige oplosbaarheid maakt talloze in vitro en in vivo toepassingen van nanoschijftechnologie mogelijk. In dit artikel beschrijven we een algemene methodologie om nanoschijven die amfotericine B bevatten te formuleren en te karakteriseren als het hydrofobe bioactieve middel.

Introduction

Ontluikende discoïdale lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL's) zijn van nature voorkomende voorlopers van het veel overvloedigere bolvormige HDL dat aanwezig is in de menselijke bloedsomloop. Deze ontluikende deeltjes, ook wel pre-ß HDL genoemd, bezitten unieke en onderscheidende structurele eigenschappen¹. Inderdaad, in plaats van te bestaan als een sferoïdaal deeltje, zijn ontluikende HDL's schijfvormig. Uitgebreide structurele karakteriseringsstudies op natuurlijke en gereconstitueerde discoïdale HDLs hebben aangetoond dat ze bestaan uit een fosfolipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door een amfipathisch uitwisselbaar apolipoprot....

Protocol

1. Transformatie, expressie en zuivering van steigereiwitcomponent

1. BL21 bacteriële transformatie met apoE4-NT bevattend plasmide
   1. Ontdooi een buisje BL21 (DE3) competente cellen op ijs gedurende 10 min.
   2. Zodra al het ijs is gesmolten, mengt u voorzichtig en voorzichtig pipet 50 μL van de cellen in een transformatiebuis op ijs.
   3. Voeg 5 μL met 50 ng plasmide-DNA (voor sequentie, zie aanvullende tabel 1) toe aan het celmengsel. Veeg voorzichtig vier of vijf keer over de buis om te mengen. Niet vortexen.
   4. Leg het mengsel 30 minuten op ijs.
   5. Hitteschok het mengsel bij precies 42 °C ge....

Results

Bioactief middel nanoschijf formuleringsproces
In de beschreven ampB-nanoschijfformuleringsprocedure wordt de reactie als voltooid beschouwd wanneer het uiterlijk van het monster overgaat van troebel naar helder (figuur 1). Deze verandering geeft aan dat nanoschijven zijn gevormd en dat het bioactieve middel is opgelost. Vaak absorberen bioactieve stoffen licht in het zichtbare golflengtegebied (bijv. AmpB, curcumine, luteïne, co-enzym Q₁₀) en in deze gevallen .......

Discussion

Formulering van een bioactief middel dat nanoschijven bevat, biedt een handige methode om anders onoplosbare hydrofobe verbindingen op te lossen. Omdat de nanoschijven van het bioactieve middel van het product volledig oplosbaar zijn in waterige media, bieden ze een nuttige toedieningsmethode voor een breed scala aan hydrofobe moleculen (tabel 1). Deze omvatten kleine moleculen, natuurlijke en synthetische drugs, fytonutriënten, hormonen, enz. De formuleringsstrategie volgt meestal een standaardprotocol .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 competent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifuge bottles	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flask	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath	VWR	N/A	ND Formulaton
Heating and Nitrogen module	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulation
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulation
Nitrogen gas	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vector	GenScript	N/A	Transformation
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes	Fisher Brand	14385 928A	Spectral Analysis
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	68100	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	88243	Purification
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Purification
Sodium Phosphate dibasic	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Sodium Phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	Purification
Spectra/POR Weighted Closures	Spectrum Medical Industries	132736	Purification
Spectrophotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	spectral analysis
Tabletop Centrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spectral Analysis
Vacuum filter	Millipore	9004-70-0	Expression & Purification
Vacuum pump	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purification
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Yeast	N/A	BY4741	Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose	BD	242820	Yeast Viability Assay