Fabricage van pulsatiele polymere microdeeltjes die rabiësantigeen inkapselen

Samenvatting

Deze methode beschrijft de inkapseling van het rabiësantigeen in biologisch afbreekbare polymere microdeeltjes met structurele en materiaaleigenschappen die pulsatiele afgifte na een vooraf bepaalde vertraging mogelijk maken. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) beoordeling van het antigeen dat uit de deeltjeskern wordt gehaald, bevestigt de aanwezigheid van intact trimerisch rabiësvirus glycoproteïne door deeltjesfabricage.

Samenvatting

De huidige richtlijnen voor rabiës na blootstelling profylaxe vereisen meerdere injecties toegediend over meerdere weken. Dit kan onevenredig belastend zijn voor mensen die in lage- en middeninkomenslanden (LMIC's) wonen, waar de meerderheid van de dodelijke blootstellingen aan hondsdolheid voorkomt. Verschillende strategieën voor medicijnafgifte zijn onderzocht om vaccinregimes te condenseren tot een enkele injectie door antigenen in polymere deeltjes in te kapselen. Harde stressoren tijdens het inkapselingsproces kunnen echter denaturatie van het ingekapselde antigeen veroorzaken. Dit artikel beschrijft een methode voor het inkapselen van het rabiësvirus (RABV)-antigeen in polymere microdeeltjes die afstembare pulsatiele afgifte vertonen. Deze methode, genaamd Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED), genereert microdeeltjes met behulp van zachte lithografie om inverse polydimethylsiloxaan (PDMS) mallen te maken van een multi-foton, 3D-geprinte mastermal. Poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) films worden vervolgens compressiegegoten in de PDMS-mallen om cilinders met open gezicht te genereren die worden gevuld met geconcentreerde RABV met behulp van een piëzo-elektrische doseerrobot. Deze microstructuren worden vervolgens verzegeld door de bovenkant van de deeltjes te verwarmen, waardoor het materiaal kan stromen en een continue, niet-poreuze polymere barrière kan vormen. Postfabricage wordt een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) specifiek voor de detectie van intact trimerisch rabiësvirus glycoproteïne gebruikt om het hoge herstel van immunogeen antigeen uit de microdeeltjes te bevestigen.

Inleiding

Vaccinatie is een uiterst effectief hulpmiddel voor de gezondheidszorg, omdat het tussen 2000 en 2019 meer dan 37 miljoen sterfgevallen heeft voorkomen¹. Ondanks deze effectiviteit blijven door vaccins te voorkomen ziekten een aanzienlijk risico vormen voor de wereldwijde gezondheid, vooral in lage- en middeninkomenslanden (LMIC's) waar hoge percentages van niet- en ondervaccinatie bijdragen aan 1,5 miljoen door vaccins te voorkomen sterfgevallen per jaar². Rabiës is geen uitzondering op deze verschillen. Ondanks zijn status als de meest dodelijke ziekte die de mensheid kent, bijna universeel dodelijk, is hondsdolheid volledig behandelbaar en wordt het geclassificeerd als uitgeroeid in veel landen met een hoog inkomen. In plaats daarvan wordt de last van hondsdolheid onevenredig gedragen door mensen die in delen van Azië en Afrika wonen, waar de ziekte verwoestende gevolgen heeft voor mens en vee ^3,4.

Vaccinatie is van cruciaal belang voor het beheersen van de wereldwijde impact van hondsdolheid⁵. De kosten van vaccinatie verbieden wijdverspreide implementatie van pre-exposure profylaxe (PrEP), gezien de algehele lage incidentie van de ziekte. Bovendien wordt in LMIC's het nut van profylaxe na blootstelling (PEP) beperkt door sociaaleconomische druk op patiënten die gezondheidszorg zoeken. Logistieke factoren, zoals reisafstand tot toegangspunten tot de gezondheidszorg, gederfde lonen tijdens het verkrijgen van een behandeling, de kosten van de behandeling, afspraken die de dagelijkse activiteiten verstoren en vergeetachtigheid, resulteren in PEP-nalevingspercentages zo laag als 60% ^6,7. Dit hoge verloop van patiënten biedt een kans voor het verfijnen van benaderingen om hiaten in de vaccinatie tegen hondsdolheid aan te pakken om de ziekte te bestrijden.

Single-injection (SI) vaccinatiesystemen die de afgifte van antigenen regelen, zijn onderzocht als manieren om volledige immunisatie in één injectie te verkrijgen. Het elimineren van de noodzaak van meerdere bezoeken aan een zorgverlener vermindert de lasten die individuen ervan weerhouden adequate zorg te zoeken. Om SI-vaccinatie te bereiken, wordt een antigeen meestal ingekapseld in een biologisch afbreekbare polymere matrix die vaak de vorm aanneemt van injecteerbare microdeeltjes. Eenmaal geïnjecteerd, degradeert het polymeer en geeft het gesekwestreerde antigeen af. Tot op heden zijn twee primaire releasestrategieën gevolgd om SI-vaccinatie te bereiken. Bij één benadering wordt het antigeen gedurende een langere periode continu vrijgegeven. Hoewel bedoeld om de immunogeniciteit van een enkele injectie te verbeteren, is het onduidelijk of deze aanpak voldoende is om een beschermende immuunrespons tegen het rabiësvirus (RABV) bij mensen op te wekken⁸. In de andere wordt het antigeen vrijgegeven na een vooraf bepaalde vertraging om een conventioneel en bewezen prime-boost-vaccinregime na te bootsen. Sproeidrogen en op emulsie/solventverdamping gebaseerde microdeeltjesfabricagemethoden vertonen de eerste strategie en zijn gebruikt om zowel modelvaccins⁹ als zeer stabiele antigenen, zoals tetanustoxoïde¹⁰, met succes in te kapselen. Deze inkapselingsmethoden omvatten echter stressoren, waaronder warmte, oplosmiddelinteractie en fysieke krachten, die antigenen kunnen denatureren¹¹.

Particles Uniformly Liquified and Sealed to Encapsulate Drugs (PULSED) is een recent ontwikkelde fabricagemethode die kan worden gebruikt om biologische geneesmiddelen in biologisch afbreekbare microdeeltjes in te kapselen. Micromolding wordt gebruikt om deeltjes te genereren die worden gevuld met een vloeibare lading en worden verwarmd om het polymeer opnieuw te laten stromen en het centrale depot van lading volledig in te kapselen in een aaneengesloten laag van het biologisch afbreekbare polymeer. Deze microstructuur resulteert in de pulsatiele afgifte van de lading, na een duur die afhankelijk is van de afbraaksnelheid van de polymere schil¹². Dit manuscript toont de inkapseling van geïnactiveerde RABV in microdeeltjes bestaande uit poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA), een biologisch afbreekbaar polymeer dat wordt gebruikt in veel door de FDA goedgekeurde formuleringen¹³, met behulp van de PULSED-fabricagemethode om stabiel RABV-antigeen in te kapselen zoals geëvalueerd door een enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA). Door PLGA-deeltjes te combineren met verschillende molecuulgewichten en/of eindgroepen, heeft deze aanpak het potentieel om het huidige rabiësvaccinatietijdsverloop na een enkele injectie na te bootsen.

Protocol

1. Deeltjesmaster schimmel generatie

OPMERKING: Het 3D-printproces kan worden uitgevoerd met elke 3D-printer met voldoende ruimtelijke resolutie; het huidige protocol beschrijft echter het proces voor een multi-foton 3D-printer.

1. Ontwerp microdeeltjesstructuren met behulp van een CAD-programma (Computer-aided Design).
   OPMERKING: De ontwerpspecificaties zijn als volgt: 308 deeltjes (diameter = 400 μm, hoogte = 500 μm en wanddikte = 100 μm) zijn gerangschikt in een array van 22 bij 14, met een afstand van 600 μm ertussen. Het ontwerp bevat ook een vierpuntige ster en een vijfpuntige ster als fiducicalen direct buiten de array (aanvullende figuur 1).
2. Exporteer het definitieve ontwerp als een STL-bestand (Supplementary Coding File 1) en upload het bestand naar software die de afdrukparameters kan definiëren zoals hieronder weergegeven. Sla het vervolgens op als een bestand dat compatibel is met de 3D-printer (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: Snijafstand = 5 μm, broedafstand = 1 μm, schaalcontour = 50 μm, basisschijftelling = 5 μm, steiger = hol, scanmodus = galvo, z-as = microscoop z-drive, scansnelheid = 100.000, vermogen = 100.
3. Voorbehandel een siliciumdruksubstraat (zie materiaaltabel) met behulp van een plasmareinigingsproces (gas: Ø₂; vermogen: 200 watt; temperatuur: 25 °C; debiet: 20; tijd: 5 min), dompel het substraat vervolgens onmiddellijk onder in een oplossing van 30 ml ethanol en 60 μl 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylaat in een glazen petrischaal. Dek af met aluminiumfolie en laat 's nachts incuberen.
   OPMERKING: Deze stap verhoogt de hechting van de afdruk op het substraat, wat belangrijk is tijdens PDMS-scheiding (stap 2.6).
4. Upload het afdrukbestand naar de multi-foton 3D-printer, breng de printhars aan op het behandelde substraat, laad de 10x lens (zie Materiaaltabel) en print de microstructuren.
5. Als u klaar bent, dompelt u de afdruk gedurende 45 minuten onder in propyleenglycolmethyletheracetaat (zie materiaaltabel) om onbelichte fotoresist te verwijderen en dompelt u de afdruk vervolgens gedurende 5 minuten onder in isopropylalcohol. Laat de mastermal na uitharden door deze gedurende 120 minuten bloot te stellen aan UV-licht bij 254 nm.
   OPMERKING: Indien beschikbaar, kan UV-licht in het bereik van 405 tot 365 nm gedurende ~ 20 minuten worden gebruikt om de geprinte structuren na uitharding te gebruiken.

2. Polydimethylsiloxaan (PDMS) schimmel generatie

1. Behandel het oppervlak van de 3D-geprinte mastermal door deze in een vacuümkamer te plaatsen met een glazen dia met 40 μL trichloor (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluorooctyl) (zie materiaaltabel) silaan toegevoegd aan het oppervlak. Trek aan het vacuüm (relatieve druk: -20 in. Hg) gedurende 1 uur.
   OPMERKING: Deze stap zorgt voor een eenvoudige scheiding bij het ontvormen (stap 2.6).
2. Terwijl het hoofdmatrijsoppervlak wordt behandeld, mengt u de polydimethylsiloxaan (PDMS) prepolymeerbasis grondig met het PDMS-prepolymeeruithardingsmiddel in een massaverhouding van 9: 1 (ten minste 10 g materiaal is nodig voor elke mastermal). Eenmaal grondig gemengd, breng het niet-uitgeharde PDMS over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g .
3. Zodra de oppervlaktebehandeling is voltooid, plaatst u de hoofdmal in een aluminiumfolieschaal en giet u het niet-uitgeharde PDMS bovenop de mal, zodat de functies volledig onder water staan. Plaats de aluminiumfolieschaal in een vacuümkamer en trek aan het vacuüm (relatieve druk: -20 in. Hg) gedurende 1 uur om luchtbellen te verwijderen.
4. Verwijder de aluminiumfolieschaal uit de vacuümkamer. Plaats afstandhouders van 800 μm aan de uiteinden van de mastermal en leg een schone glazen schuif op de mastermal, waarbij u ervoor zorgt dat er geen luchtbellen ontstaan. Gebruik binderclips om de mal en de schuif aan elkaar te klemmen, waarbij de klemkracht over de afstandhouders wordt gelokaliseerd (aanvullende figuur 2).
5. Plaats de structuur gedurende ten minste 4 uur in een oven die op 120 °C is ingesteld om het prepolymeer in PDMS-mallen uit te harden.
6. Verwijder de structuur uit de oven, laat de bindmiddelclips voorzichtig los en scheid de hoofdvorm voorzichtig van de uitgeharde PDMS-mal met behulp van een scheermesje.
   OPMERKING: De 3D-geprinte mastermal kan worden hergebruikt om extra PDMS-mallen te genereren.

3. PLGA film fabricage

1. Weeg 450 mg PLGA af (zie materiaaltabel) en plaats deze op een anti-aanbakpolymeerplaat van 76 mm bij 76 mm in een 250 μm dikke ringshim, met een binnendiameter van 50,8 mm. Plaats een tweede anti-aanbakpolymeerplaat over de PLGA en druk de stapel tussen twee aluminium blokken met behulp van een 101,6 mm c-klem tot een vingerdicht.
   OPMERKING: 502H PLGA werd uitsluitend in deze studie gebruikt; andere soorten PLGA zijn echter compatibel met dit proces.
2. Plaats het c-geklemde samenstel in een vacuümoven op 120 °C gedurende 30 minuten onder vacuüm, met een relatieve druk van -30 in.Hg. Verwijder vervolgens de montage en draai de klem stevig vast voordat u deze nog eens 30 minuten in de vacuümoven plaatst.
   OPMERKING: Het primaire doel van het gebruik van een vacuüm is om PLGA-degradatie te voorkomen, die bij hoge temperaturen wordt versneld.
3. Haal het geheel uit de oven en laat het 4 uur afkoelen in een exsiccator.
4. Eenmaal afgekoeld, maakt u de klem los, verwijdert u de PLGA-film van de anti-aanbakpolymeervellen en plaatst u de film in een gelabelde petrischaal. Bewaar de petrischaal in een exsiccator voor later gebruik.

4. PLGA deeltjes generatie

1. Behandel het oppervlak van de PDMS-mal zoals eerder beschreven in stap 2.1.
2. Knip met een pincet en/of een scalpel een deel van de 250 μm PLGA-film, ongeveer zo groot als de array, uit en plaats deze op de behandelde PDMS-mal.
3. Leg een schone glazen microscoopschuif bovenop de PLGA-film en PDMS-mal en klem de componenten aan elkaar door een veerklem direct over de array en PLGA-film te plaatsen.
4. Plaats de geklemde matrijsassemblage in de vacuümoven die is ingesteld op 120 °C en trek het vacuüm met een relatieve druk van -30 in. Hg gedurende 1 uur.
   OPMERKING: De tijd die nodig is om de deeltjes te vormen is afhankelijk van de PLGA en kan variëren van 1-12 uur.
5. Haal de geklemde vormset uit de oven en laat deze ongeveer 15 minuten passief afkoelen bij kamertemperatuur, of tot het afkoelt.
6. Oefen met een scheermesje voorzichtig druk uit tussen de PDMS-mal en de PLGA-deeltjesarray om de twee te scheiden. Bewaar de PLGA-deeltjes in een exsiccator voor toekomstig gebruik.

5. Antigeenconcentratie en -zuivering

1. Ontdooi één aliquot van in de handel verkrijgbaar RABV-antigeen (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur.
2. Monteer de filtratie-opstelling door twee centrifugale spinfilters met een 100 kDa molecuulgewichtsafsnijding (MWCO; zie materiaaltabel) in twee opvangbuizen te plaatsen.
3. Maak de twee centrifugale centrifugaalspinfilters voor door 500 μL UltraPure-water toe te voegen.
4. Draai de filters op 2.400 x g gedurende 1 minuut in een benchtopcentrifuge bij kamertemperatuur.
5. Verwijder het water uit zowel het bovenste als het onderste compartiment van de filtratie-opstelling met behulp van een pipet van 200 μL.
   OPMERKING: Laat het voorbevochtigde centrifugeerfilter niet uitdrogen.
6. Voeg 400 μL gedestilleerd water toe aan het bovenste compartiment van elk centrifugeerfilter, voeg vervolgens 100 μL van het ontdooide RABV-antigeen toe en meng met de pipet.
   OPMERKING: Deze studie concentreerde het antigeen ongeveer vijfvoudig en verminderde de concentratie van hulpstoffen < 100 kDa met ~ 50-voudig.
7. Laad de twee centrifugaalspinfilters in een tafelcentrifuge en zorg ervoor dat de filters naar het midden van de centrifuge zijn gericht. Markeer welke kant van het filter naar het midden van de centrifuge is gericht.
   OPMERKING: Als de oplossingen verkeerd zijn georiënteerd, worden ze niet goed gefilterd/geconcentreerd.
8. Centrifugeer de filters op 14.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
9. Haal de filters uit de centrifuge. De opvangbuizen bevatten het filtraat, terwijl de filters het geconcentreerde monster bevatten (aanvullende figuur 3A).
10. Verwijder het filtraat in de opvangbuizen met een pipet en gooi het weg.
11. Voeg 450 μL gefilterd gedestilleerd water toe aan elk filter en meng het geconcentreerde monster en water door zes keer op en neer te pipetteren.
12. Centrifugeer de twee centrifugeerfilters een tweede keer op 14.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de filters in dezelfde richting naar het midden van de centrifuge zijn gericht als in stap 5.7.
13. Haal de filtereenheden uit de centrifuge en verwijder en gooi het filtraat net als voorheen met een pipet uit elke buis.
14. Verwijder de spinfilters uit de opvangbuizen en sluit de filterbehuizingen af met de bovenkant van de opvangbuizen (aanvullende figuur 3B).
15. Plaats de bodem van de centrifugeerbehuizingen direct op een vortex en vortex bij 3.000 tpm gedurende 30 s terwijl u de filterbehuizingen rechtop en onder een hoek van 45° houdt (aanvullende figuur 3C).
    OPMERKING: Deze stap is bedoeld om RABV-antigeen dat tijdens het centrifugeerproces een pellet heeft gevormd, te resuspenderen.
16. Verwijder voorzichtig de dop van de opvangbuizen uit de centrifugeerfilterbehuizingen. Plaats de filterbehuizingen terug in de meegeleverde opvangbuizen en voer een snelle draai (2-3 s) uit om het volume te verzamelen dat mogelijk in de dop is vastgelopen.
    OPMERKING: Deze snelle spin moet worden uitgevoerd in een benchtop microcentrifuge. De filters moeten raken aan de centrifuge, in tegenstelling tot de vorige configuratie, om ervoor te zorgen dat er geen oplossing verloren gaat door de filters.
17. Keer elke spinfiltereenheid om in een nieuwe opvangbuis die bij de spinfilterkit wordt geleverd (zie materiaaltabel) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.000 x g bij kamertemperatuur om de geconcentreerde monsters te verzamelen.
18. Consolideer de geconcentreerde monsters uit de twee opvangbuizen in één opvangbuis. Meet en registreer het resulterende volume.
    OPMERKING: Het resulterende monster heeft 5x de initiële antigeenconcentratie als de stam, heeft een kleine concentratie van het hulpstof (<100 kDa) die ongeveer 50 keer lager is dan de stam en ziet er enigszins melkachtig wit uit. Het totale volume moet ongeveer 44-48 μL zijn.
19. Bewaar het 5x geconcentreerde, tweemaal gewassen antigeen bij 4 °C tot het moment van doseren, maar niet langer dan 16 uur. Voordat u deeltjes met deze oplossing vult, centrifugeert u de buis gedurende 1 minuut op 1.000 x g om eventuele bellen te verwijderen. De oplossing mag met gedestilleerd water worden verdund om de nominale streefconcentratie voor afgifte te bereiken.

6. Deeltjesvulling

1. Vacuümfilter 500 ml gedeïoniseerd water door een vacuümfilter van 0,22 μm en ontgast vervolgens de oplossing door een vacuüm toe te passen (relatieve druk: -20 in. Hg) tijdens ultrasoonapparaat gedurende 20 minuten.
2. Bevestig gedurende deze tijd de piëzo-doseercapillairen (PDC's; zie materiaaltabel) aan de piëzo-elektrische dispenser.
3. Bereid de machine voor volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) en plaats de dia met de PLGA-deeltjes in het doseergebied.
4. Stel de "Find Target Reference Points" in, Run en stel vervolgens het "Target Substrate" in, volgens aanvullende figuur 4.
5. Laad 25 μL van het geconcentreerde antigeen in de bronplaat en laad het in de machine. Zuig met behulp van de PDC's 10 μL geconcentreerd antigeen in de doseerpunt, was de buitenkant van de punt en kalibreer vervolgens de uitlijning van de dosering (aanvullende figuur 5).
6. Voer "Target Setup parameters" in en klik op de Run (Aanvullende figuur 6).
7. Zodra u klaar bent, verwijdert u de gevulde deeltjes en controleert u of ze onder een stereoscoop zijn gevuld.
8. Ga direct naar de volgende stap in het protocol.

7. Deeltjesafdichting en oogst

1. Plaats een roestvrijstalen blok (zie materiaaltabel) op een kookplaat. Plaats twee microscoopglaasjes op het roestvrijstalen blok zodat ze evenwijdig zijn. Zorg ervoor dat het roestvrijstalen blok waterpas staat, zet vervolgens de kookplaat aan en stel de temperatuur zo in dat de oppervlaktetemperatuur van het roestvrij staal 200 °C is. Controleer de temperatuur van de kookplaat voordat u deze afdicht.
2. Hang de gevulde PLGA-deeltjes boven de kookplaat door ze op de twee glazen dia's te plaatsen en start vervolgens onmiddellijk een timer voor 18 s.
   OPMERKING: De hoeveelheid tijd en warmtedeeltjes die moeten worden afgedicht, is afhankelijk van de chemische eigenschappen van de PLGA die wordt gebruikt om de deeltjes te maken. Een aangepaste 3D-geprinte diahouder kan worden gebruikt om de dia's op een veilige afstand van de kookplaat te verwerken. Het STL-bestand wordt geleverd als Supplementary Coding File 2.
3. Eenmaal verzegeld, verwijdert u de deeltjesarray van de kookplaat en hangt u deze boven de laboratoriumbank door de deeltjesarray op twee afzonderlijke glazen dia's te plaatsen. Laat de deeltjes 1 minuut afkoelen.
4. Eenmaal afgekoeld, kunnen de deeltjes worden geoogst met behulp van een scalpel terwijl ze door een stereoscoop kijken. Houd het scalpel met het mes in een hoek van 45° ten opzichte van de dia en oefen druk uit op de basis van het deeltje om het van de glasplaat te scheiden.
5. Eenmaal geoogst, gebruik het scalpel om de deeltjes over te brengen in 0,5 ml eiwitarme bindbuizen (zie tabel met materialen). Vul vervolgens de buizen met 250 μL van een 1x fosfaatbufferoplossing (PBS) met 30 mg / ml runderserumalbumine (BSA) en 1 mg / ml glucose.
   OPMERKING: De 30 mg/ml BSA en 1 mg/ml glucose-oplossing bereid in PBS zal de stabiliteit van het RABV-antigeen behouden.
6. Plet de deeltjes onder een stereoscoop met een pincet met een fijne punt. Zorg ervoor dat het RABV-antigeen in de kern van het deeltje beschikbaar is om te worden opgelost in de omringende oplossing. Bewaar de monsters in een koelkast van 4 °C totdat de antigeenpotentie kan worden geëvalueerd met behulp van een ELISA. Monsters moeten binnen 7 dagen na bereiding op een ELSIA worden uitgevoerd.

8. Evaluatie van het antigeen door ELISA

LET OP: Laat de microplaatjes op geen enkel moment uitdrogen. Stapel platen altijd en bedek de bovenste plaat altijd met een plastic afdichting, een lege plaat of een deksel om uitdroging te voorkomen.

1. Bereid de buffers voor volgens de instructies in Aanvullend Dossier 1.
2. Bereid 5 ml coatingoplossing (carbonaat-bicarbonaatbuffer, pH 9,6) in een concentratie van 2,5 μg/ml door 25 μl van het coatingantilichaam toe te voegen aan 4975 μl coatingbuffer bij pH 9,4-9,6.
   OPMERKING: 5 ml is nodig om 96 putten te coaten met elk 50 μL (met extra volume voor pipetteerverlies). Verhoog het totale volume met 5 ml voor elke extra ELISA-plaat die nodig is.
3. Gebruik een meerkanaalspipet om 50 μL van de coatingoplossing in elk putje van de microplaat te doseren. De oplossing moet onmiddellijk na de bereiding voor coating worden gebruikt.
4. Tik zachtjes langs de plaatranden op een gehandschoende handpalm om ervoor te zorgen dat de bodem van elke put gelijkmatig bedekt is met vloeistof.
5. Sluit de plaat af met kleeffolie en plaats deze gedurende 1 uur op 37 °C en breng deze vervolgens een nacht over naar 4 °C.
6. Haal de platen uit de koelcel en was ze drie keer met 200 μL wasbuffer in elk putje.
7. Verwijder de wasbuffer en doseer 300 μL blokkeringsbuffer in elk putje.
   LET OP: Wanneer u meerdere platen uitvoert met dezelfde monsters die op verschillende platen worden herhaald, is het belangrijk om plaat voor plaat verder te gaan (d.w.z. plaat 1 vullen met het materiaal voordat u doorgaat naar plaat 2 en vervolgens naar plaat 3 enzovoort). Breng materiaal X niet aan op alle platen en vervolgens op materiaal Y, enz., Omdat dit het risico op uitdroging van putten zou vergroten. Na de laatste wasstap moet de wasbuffer in de putjes van de plaat blijven en alleen onmiddellijk worden weggegooid voordat monsters aan de plaat worden toegevoegd. Een plastic 96-well plaatdeksel moet worden gebruikt om alle putten van de ELISA-plaat te bedekken die niet meteen worden gedoseerd, en het deksel wordt sequentieel verplaatst om extra putten te onthullen die met materiaal moeten worden gevuld.
8. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie (zie materiaaltabel) en plaats ze gedurende 60 ± 5 minuten in een incubator bij 37 ± 2 °C.
9. Bereid de standaardcurve en testmonsters voor die tijdens deze incubatie moeten worden geëvalueerd.
   OPMERKING: Het antigeen dat wordt geëvalueerd, moet vooraf worden verdund in verdunningsbuffer met een aanbevolen verdunning van 0,125 IE/ml, met een overmaat aan volume van ten minste 40 μl om pipetteerverlies te voorkomen. Alle monsters worden in tweevoud (twee technische replicaties) op elke ELISA-plaat beoordeeld. Voor de standaardcurve moet in de kolommen 2 en 3 van elke Elisa-plaat een tweevoudige verdunningsreeks voor in totaal acht punten worden opgenomen. Voor alle andere monsters kan een verdunningsreeks worden uitgevoerd met een passend aantal punten op basis van de voorspelde hoeveelheid antigeen die wordt geëvalueerd. Hoewel minder rigoureus voor een hogere doorvoer, kan een enkele monsterverdunning worden gebruikt als alternatief voor de hierboven beschreven beplating. De verwachte concentratie van een enkele verdunning moet echter binnen het standaardcurvebereik vallen.
10. Voer in eiwitarme 96-putplaten of eiwitbuizen met een lage binding (zie materiaaltabel) een tweevoudige verdunningsreeks van elk monster uit langs de kolommen van de plaat.
11. Belast het begin van de verdunningsreeks in rij A voor elk respectievelijk monster met het dubbele van het vereiste eindvolume (per plaat is 100 μL monster per put vereist, dus alle putjes in A2-A11 moeten ten minste 240 μL van een monster bevatten, met een extra volume van 40 μL om pipetteerverlies te compenseren).
12. Laad 120 μL verdunningsbuffer in alle andere putjes op de eiwitplaat met een lage binding, met uitzondering van de kolommen 1 en 12 (d.w.z. B2 tot en met H11).
13. Gebruik een meerkanaalspipet geladen met 10 tips, voer seriële verdunning uit door 120 μL monster over te brengen van A2-A11 naar B2-B11 en meerdere keren op en neer te pipetteren om te mengen terwijl spatten en bellen worden vermeden. Herhaal dit proces en beweeg langs de plaat langs de kolommen naar de putjes H2-H11. Gooi het resterende volume van 120 μL dat uit de laatste rij putjes is geaspireerd, weg.
    OPMERKING: De monsters zijn nu klaar voor analyse. Als de blokkeringsfase tegen die tijd nog niet is voltooid, zorg er dan voor dat de monsters op ijs worden bewaard.
14. Was aan het einde van de incubatiestap de platen drie keer met 200 μL wasbuffer.
15. Breng met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL verdunningsbuffer over in de kolommen 1 en 12 als de "blanco's".
16. Breng met behulp van een meerkanaalspipet 100 μL over van elke put van de eiwitarme 96-putplaat met monsterverdunningen naar de gewassen ELISA-plaat. Herhaal dit voor alle ELISA-platen die worden uitgevoerd.
17. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie en plaats ze gedurende 60 ± 5 minuten in een incubator bij 37 ± 2 °C.
18. Bereid de oplossing voor het detectieantilichaam (zie de tabel met materialen) in een concentratie van 0,2 μg/ml door 4,4 μl van de antilichaamoplossing toe te voegen aan 10,995,6 μl van de verdunningsbuffer en meng goed door op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Een totaal van 11 ml is nodig voor 96 putten van elk 100 μL (met extra volume voor pipetteerverliezen). Verhoog het totale volume met 11 ml voor elke extra ELISA-plaat die wordt geëvalueerd. De oplossing moet onmiddellijk na de bereiding worden gebruikt.
19. Was aan het einde van de incubatiestap de platen vijf keer met 200 μL wasbuffer.
20. Zuig de resterende wasbuffer op en doseer 100 μL van de detectieantilichaamoplossing in elk putje op de microplaat met behulp van een meerkanaalspipet.
21. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie en plaats ze gedurende 60 ± 5 minuten in een incubator bij 37 ± 2 °C.
22. Bereid het conjugaat voor tegen het einde van de incubatiestap van het detectieantilichaam door 4,4 μl streptavidine-peroxidaseconjugaatoplossing (zie materiaaltabel) toe te voegen aan 10.995,6 μl wasbuffer.
    OPMERKING: Een totaal van 11 ml is nodig voor 96 putten van elk 100 μL (met extra volume voor meerkanaals pipetteren). Verhoog het totale volume met 11 ml voor elke extra ELISA-plaat die wordt geëvalueerd.
23. Was de borden vijf keer met 200 μL wasbuffer.
24. Zuig de resterende wasbuffer aan en doseer 100 μL van de geconjugeerde oplossing aan elk putje.
25. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic folie en plaats ze in een incubator van 37 °C gedurende 60 ± 5 minuten bij 37 ± 2 °C.
26. Bereid het substraat voor tijdens de laatste wasstap volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Los voor elke plaat één tablet o-fenyleendiamine dihydrochloride (OPD; zie tabel met materialen) op in 9 ml gedeïoniseerd water in het donker en vul vervolgens aan met 1 ml 10x stabiele peroxidebuffer. Pas het aantal tabletten en het totale volume van de oplossing (10 ml) aan op basis van het aantal platen dat wordt geëvalueerd.
27. Was de borden vijf keer met 200 μL wasbuffer.
28. Doseer 100 μL van het substraat aan elke put met behulp van een meerkanaalspipet.
29. Sluit de platen af met een zelfklevende plastic film en laat ze 10-20 minuten op de bank liggen, beschermd tegen licht, met aluminiumfolie.
    OPMERKING: Controleer de kleurontwikkeling visueel om verzadiging te voorkomen.
30. Voeg onmiddellijk 50 μL stopoplossing toe aan elke put en de afleesplaat voor absorptie bij 492 nm en een referentieabsorptie van 620 nm.
31. Analyseer de gegevens met behulp van de gecorrigeerde absorptiewaarde (aflezing bij 492 nm minus de aflezing bij 620 nm) en trek het gemiddelde van de blanco van alle monsters af. Gebruik een sigmoïdale 4PL-interpolatiemethode om absorptiewaarden om te zetten in IE/ml. Vermenigvuldig ten slotte met de 250 μL (totaal monstervolume) om om te zetten in IE.
    OPMERKING: Deze analyse kan worden uitgevoerd met behulp van data-analysesoftware.

Resultaten

Het afdichten en vullen van deeltjes zijn twee van de meest kritieke stappen in dit protocol. Deeltjes werden gevuld met fluoresceïnenatriumzout om de ideale vulling en enkele veel voorkomende fouten aan te tonen. Fluoresceïnenatriumzout werd gebruikt in plaats van het RABV-antigeen voor eenvoudige visualisatie. Tijdens het vullen is het belangrijk om de oplossing in de bodem van de deeltjeskernen te doseren en vervolgens voldoende tijd te geven om het oplosmiddel / water te laten verdampen. Eenmaal voltooid, blijft een depot van de opgeloste stof over in de bodem van de deeltjeskern (figuur 1A). Eenmaal gevuld, is het van cruciaal belang om de deeltjes correct af te sluiten. Figuur 1B toont verschillende uitkomsten (succesvol en onsuccesvol) van het afdichtingsproces. Na 12 s sealtijd blijft er een duidelijk pad over van het deeltjescentrum naar de buitenkant van het deeltje, wat een deeltje aantoont dat niet volledig is afgesloten. Omgekeerd, als het 36 s wordt afdicht, smelt de PLGA bijna volledig, wat resulteert in een microstructuur met een ondiep profiel. De ideale morfologie kan worden gevisualiseerd wanneer deeltjes gedurende 18 en 24 s worden afgesloten, omdat ze lading bevatten die volledig is ingekapseld door het polymeer met behoud van een deeltjesstructuur. Figuur 1C toont verschillende mogelijke uitkomsten na het vullen en afdichten. Tijdens het doseren, als het oplosmiddel de deeltjesbodem niet bereikt, laat het opgeloste stof gedroogd in het midden van de deeltjeskern (verkeerd gevuld); Hoewel deze deeltjes nog steeds kunnen afdichten, kan de slechte belading van lading de laadefficiëntie beperken. Als deeltjes worden gevuld met te veel lading (overgevuld), wordt het afdichtingsproces geremd, omdat de lading voorkomt dat PLGA over de opening stroomt. Wanneer ze correct worden gevuld en verzegeld, zijn deeltjes van deze geometrie klein genoeg om gemakkelijk in een naald van 19 G te passen. Verder stroomden 10 deeltjes consequent door een naald van 19 G (100% ± 0%) wanneer ze werden geïnjecteerd met een viskeuze oplossing zoals 2% carboxymethylcellulose (aanvullende figuur 7).

Figuur 1: Veelvoorkomende problemen met het vul- en afdichtingsproces . (A) Afbeeldingen tonen de verdamping van oplosmiddel na één vulcyclus, waarbij deeltjes worden geladen met 6 nL 100 mg/ml fluoresceïnenatriumzout opgelost in water. (B) Representatieve beelden van 502H PLGA-deeltjes verwijderd uit het afdichtingsproces bij 0, 12, 18, 24 en 36 s. (C) Verschillende uitkomsten van het afdichtingsproces wanneer deeltjes correct, onjuist of overgevuld zijn. Afbeeldingen worden gegenereerd door meerdere afbeeldingen te stapelen en samen te voegen met behulp van focus stacking-software. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het verwerken van het antigeen door een spinfilter voordat het in de deeltjes wordt geladen, is om twee redenen belangrijk. Ten eerste dient de centrifugatie om voorraadhulpstoffen in de vaccinoplossing te verwijderen, die de laadcapaciteit van deeltjes kunnen beperken met behoud van het RABV-antigeen. Het huidige protocol zuivert het antigeen ongeveer 50-voudig. Ten tweede wordt het antigeen ook geconcentreerd tijdens dit proces. Figuur 2A toont een microfoto van intacte RABV-virionen in het geconcentreerde antigeenmonster. Dit antigeen is ongeveer 4,4 keer geconcentreerder dan de uitgangsvoorraadoplossing (figuur 2B). De hoeveelheid antigeen die aanvankelijk in de centrifugale spinfilters wordt geladen, kan worden gewijzigd om de uiteindelijke vouwconcentratie te moduleren. Het laden van 40 μL stockantigeen resulteert bijvoorbeeld in een concentratie van ongeveer 1,75 keer. Aanvullende figuur 8 toont het belang van vortexing (stap 5.15) in het concentratieproces. Het nalaten van vortex of het onjuist vortexen van de monsters beperkt het concentratieproces.

Figuur 2: Antigeenconcentratie. De concentratie van antigeen door centrifugale filtratie aangetoond door transmissie-elektronenmicroscopie (A) en bevestigd door ELISA (B). Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Statistische analyse wordt gedaan met behulp van Tukey's meerdere vergelijkingstests met eenrichtings-ANOVA. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3A toont geconcentreerd antigeen gevuld in niet-verzegelde en verzegelde deeltjes. Hoewel een aanzienlijke hoeveelheid antigeen in de deeltjes wordt geladen (0,0469 ± 0,0086 IE), omvat dit materiaal <90% van de deeltjescapaciteit, waardoor er voldoende ruimte is voor het laden van extra antigeen. Interessant is dat niet-verzegelde deeltjes slechts 0,0396 ± 0,0077 IE bevatten, wat slechts 85% ± 16% van de totale geladen hoeveelheid omvat. Hoewel het een statistisch onbeduidend verlies is, kan een deel van het RABV-antigeen gedenatureerd zijn tijdens herhaalde rehydratatie en droging in het vulproces. Na afdichting blijft 69% ± 5% van het antigeen ingekapseld in een bioactieve vorm. Hoewel dit suggereert dat er aanzienlijk verlies optreedt tijdens het afdichtingsproces als gevolg van thermische stress, blijft het grootste deel van het geïnactiveerde virale antigeen intact (figuur 3B). Co-inkapseling van stabiliserende hulpstoffen samen met het antigeen is een mogelijke strategie om de antigeenstabiliteit tijdens het fabricageproces verder te verhogen, en is eerder succesvol geweest met andere geïnactiveerde virusantigenen^14,15.

Figuur 3: Bioactief RABV-antigeen na deeltjesfabricage . (A) Afbeeldingen tonen niet-verzegelde en verzegelde deeltjes die het RABV-antigeen bevatten. (B) Antigeenstabiliteit door het deeltjesfabricageproces (n = 4). Belastingscontrole wordt gegenereerd door het antigeen rechtstreeks in de oplossing te doseren. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Schaalbalk = 200 μm. Statistische analyse wordt gedaan met behulp van Tukey's meerdere vergelijkingstests met eenrichtings-ANOVA. *p < 0,05. Afbeeldingen worden gegenereerd door meerdere afbeeldingen te stapelen en samen te voegen met behulp van focus stacking-software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Deeltjes-, fiduciale en arraydimensies. De figuur toont de geometrische eigenschappen van de vierpuntige ster fiduciaal (A), het cilindrische microdeeltje (B), de vijfpuntige ster fiduciaal (C) en een array van deeltjes met fiducialen (D) weergegeven in de CAD-software. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Deze figuur toont een dwarsdoorsnede van de structuur die in de oven is geplaatst om PDMS-mallen uit te harden. Pijlen geven aan waar bindmiddelklemmen worden aangebracht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Juiste techniek om geconcentreerd antigeen efficiënt terug te winnen. Aan het einde van de eerste spin wordt het geconcentreerde monster dat rood omcirkeld is (A) in het filter vastgehouden, terwijl het filtraat wordt verzameld in de bodem van de opvangbuis (grotere buitenbuis). Om het gepelletiseerde antigeen te resuspenderen, wordt de centrifugaalfiltereenheid afgedekt met behulp van de opvangbuis (B) ter voorbereiding op vortexing. Bij vortexing wordt de punt van de buis in contact gehouden met de vortexpad en wordt het uiteinde van de dop rondgedraaid met behoud van een hoek van 45° met de vortexpad (C). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Pre-run programmering piëzo-elektrische dispenser. (A) Stel de "Find Target Reference Points" in door van het "Main tab" naar de Robot Setup > Miscellaneous >Div. Function > Find Target Reference Points te gaan. Gebruik de blauw gemarkeerde knoppen om de fiduciaire markeringen in te stellen. Selecteer eerst Sjabloon leren en teken een vak rond het fiduciaire merk van belang, controleer de nauwkeurigheid van de sjabloon door op Sjabloon zoeken te klikken en sla de sjabloon op. Doe dit voor de vier- en vijfpuntige sterren en sla de bestandsnamen op volgens de instructies onder Twee verschillende sjabloonafbeeldingen gebruiken. Zorg er vervolgens voor dat alle parameters in de zwarte dozen overeenkomen. Laad de vierpuntige sterfiducial met behulp van de Load Template (groen vak). Sla het programma "Find Target Reference Points" op door Takenlijst (oranje vak) te selecteren. (B) Stel de Run in door naar het tabblad Robotinstellingen > Taken te gaan en laad vervolgens de reeks taken die in het blauwe vak worden weergegeven door taken uit de takenlijst (zwart vak) toe te voegen met behulp van de Taak in Selecties uitvoeren (groen vak). Sla ten slotte de taak op (oranje vak). (C) Stel het "doelsubstraat" in door naar de robotinstellingen > doelsubstraat te navigeren en voeg vervolgens een doel toe (blauw vak). (D) Voer de hier getoonde parameters in en selecteer Opslaan (blauw vak). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Antigeen laden en dispending uitlijnen kalibreren. (A) Navigeer naar het tabblad Nozzle Setup > Do Task en zuig 10 μL van het antigeen in de doseertip door TakeProbe10 uL (zwarte doos) te selecteren en op DO (zwarte doos) te klikken. (B) Dit opent een apart venster. Selecteer de put waarin het geconcentreerde antigeen is geladen en selecteer OK (blauw vak). (C) Nadat het antigeen is aangezogen, wast u de punt door de blauwe doos te selecteren en herhaalt u deze wasbeurt nog twee keer. Selecteer de camera (zwarte doos) en bepaal het dropvolume door dropvolume (groen vak) te selecteren. Zorg ervoor dat er een stabiele daling wordt gevormd met een standaardvolumeafwijking (%) <2 (oranje doos). (D) Als u deze stappen volgt, wordt de Snap Drop Cam geopend; selecteer Afbeelding (blauw vak) in het vervolgkeuzemenu en selecteer Wizard Nozzle Head Camera. Dit opent een nieuw venster. Voer de volgende reeks stappen snel uit. (E) Zorg ervoor dat het doel in aanvullende figuur 4 is geladen en selecteer vervolgens Verplaatsen naar doel (blauw vak). Stel de druppels in op 15 en selecteer Spot (black box). Eenmaal gespot, selecteert u onmiddellijk Verplaatsen (groen vak). Zorg ervoor dat Automatisch zoeken is geselecteerd en verwijder de deeltjesgrootte = 12 en klik vervolgens op Start (oranje vakken). Als de automatische detectie mislukt, herhaalt u dit proces nadat u naar een ander gebied op de dia bent gegaan (paars vak). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 6: Spotting array programmeren en de run starten. (A) Navigeer naar de doelinstellingen > Doel en vul vervolgens de parameters in die in het blauwe vak worden weergegeven. (B) Navigeer vervolgens naar het tabblad "Veldinstellingen" en voer 20 in het nee in. van het druppelveld (blauwe doos), selecteert u een put (zwarte doos) en selecteert u vervolgens doelen/deeltjes om in te doseren (groene doos). Door een andere put te selecteren en de doelen/deeltjes opnieuw te selecteren, worden tijdens één run extra vulcycli uitgevoerd. (C) Controleer op het hoofdscherm of de run en het doel die in aanvullende figuur 5 zijn gemaakt, zijn geselecteerd. (D) Navigeer naar het tabblad "Uitvoeren" en selecteer Start Run (blauw vak). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Injecteerbaarheid van microdeeltjes. (A-C) Focus-gestapelde stereoscoopbeelden van microdeeltjes gevuld met fluoresceïnenatriumzout en verzegeld in een naald van 19 G. (D) In totaal werden 10 deeltjes geïnjecteerd door een naald van 19 G met behulp van een 2% carboxymethylcelluloseoplossing (n = 8). Schaalbalk = 1 mm. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Mogelijke problemen met de antigeenconcentratie. De rode lijn geeft de verwachte vouwtoename in concentratie aan. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Statistische analyse werd gedaan met behulp van Tukey's meerdere vergelijkingstests met eenrichtings-ANOVA. P < 0,001, ****p < 0,0001. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 1: Voorbereiding van buffers en oplossingen voor RABV ELISA. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: STL-bestand met deeltjesarray. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 2: STL-bestand met geometrie voor de aangepaste diahouder die wordt gebruikt voor het afdichten van deeltjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het is mogelijk om de deeltjesgeometrie aan te passen aan specifieke behoeften; Voor cilindrische structuren raden de auteurs echter aan om een verhouding van 5: 4: 1 te handhaven van de hoogte : diameter : wanddikte beschreven in het protocol. Deze beeldverhouding zorgt ervoor dat er voldoende PLGA-materiaal aanwezig is om de deeltjes af te dichten en mechanisch robuust genoeg blijft voor hantering. Deeltjesafmetingen en -vormen kunnen eenvoudig worden gewijzigd tijdens het CAD-proces, waardoor een groot aantal geometrieën kan worden gegenereerd. De combinatie van de flexibiliteit van de CAD met 3D-printen maakt de snelle iteratie van microdeeltjesontwerpen mogelijk. Hoewel dit protocol een multi-foton 3D-printer gebruikt, kan elke 3D-printer met specificaties die in staat zijn om de microstructuurafmetingen in een geschikt materiaal te printen, worden gebruikt om de initiële mastermal te genereren. Verder is fotolithografie eerder gebruikt om vergelijkbare structuren in arrays veel groter te maken dan die geproduceerd in dit protocol; De arbeid, vertraging van het bestellen van op maat gemaakte fotomaskers en de toegankelijkheid van apparatuur zouden het iteratieve ontwerpproces echter vertragen¹⁶. Ten slotte kan het genereren van mastermatrijzen worden uitbesteed aan fee-for-service-bedrijven als interne master-matrijsfabricage niet haalbaar is. Ongeacht de 3D-printer of de methode die wordt gebruikt om de mastermallen te genereren, is de hechting van de print op het substraat van cruciaal belang voor stroomafwaartse stappen. In het bijzonder, als de hechting onvoldoende is tijdens het genereren van PDMS-matrijzen, blijven geprinte deeltjes in de PDMS-mal hangen, waardoor handmatige verwijdering van de geprinte deeltjes en vernietiging van de hoofdmal vereist is.

Deeltjesvulling is een ander kritisch aspect om te overwegen. Microdeeltjes hebben beperkte vulcapaciteiten, dus filtratie wordt niet alleen gebruikt om het RABV-antigeen te concentreren, maar ook om voorraadhulpstoffen te verwijderen die anders een groot deel van het kernvolume van microdeeltjes zouden innemen. Gezien de grote omvang van het RABV-antigeen (ongeveer 60 nm bij 180 nm)¹⁷ is het echter mogelijk om het antigeen tijdens de centrifugatiestappen gedeeltelijk uit te pelleteren. Om deze reden is het belangrijk om het antigeen te resuspenderen door pipetteren of vortexing na centrifugeren om een hoog herstel van het RABV-antigeen te bereiken. Een sterk geconcentreerde oplossing is ideaal voor het doseren, omdat het de doseercycli vermindert en daardoor de afbraak van antigeen tijdens het vullen beperkt. Viscositeit is echter een belangrijke beperking van piëzo-elektrische doseerrobots die een stabiele druppel vormen, dus het doseren van een oplossing met een zeer hoge concentratie is misschien niet mogelijk of raadzaam. Het verdunnen van de vuloplossing is de gemakkelijkste manier om een stabiele druppelvorming te bereiken, maar antigeenstabiliteit gedurende de extra vulcycli die nodig zijn om de gewenste belasting te bereiken en de langere tijd die nodig is om deeltjes te vullen, moet worden overwogen.

Beperkingen
Deze methode vereist zeer gespecialiseerde apparatuur om de initiële mallen te produceren en een gespecialiseerd vulinstrument voor de productie van microdeeltjes. Hoewel de behoefte aan een 3D-printer met een printresolutie die in staat is om de initiële mastermallen te genereren, kan worden ondermijnd door een fee-for-service-benadering, is de toegankelijkheid tot een piëzo-elektrische doseerrobot beperkt. De aanschaf van een piëzo-elektrische doseerrobot vereist een aanzienlijke initiële investering vooraf, vaak in het bereik van $ 80.000 tot $ 200.000, afhankelijk van het merk, de doorvoer en de mogelijkheden. Hoewel verschillende andere vulmethoden mogelijke alternatieven zijn, zijn deze methoden niet gevalideerd met behulp van het RABV-antigeen¹².

Toekomstige toepassingen
Een aanzienlijk deel van het ingekapselde RABV-antigeen bleef stabiel tijdens het afdichtingsproces. In theorie, door dit antigeen op te nemen in deeltjes die zijn samengesteld uit verschillende soorten PLGA die de toedieningstijdlijn van profylaxebehandeling na blootstelling nabootsen, kunnen alle doses in één injectie worden toegediend. Het elimineren van de noodzaak van herhaalde ziekenhuisbezoeken om extra doses toe te dienen, zal de therapietrouw van de patiënt verbeteren, wat resulteert in betere behandelingsresultaten. Voorts is het, na het aantonen van het vermogen om de ELISA-reactiviteit van het zeer complexe geïnactiveerde rabiësvirus te behouden, waarschijnlijk dat andere antigenen, waaronder subunitvaccins, compatibel zouden zijn met deze inkapselingsmethode. Het gebruik van andere profylactische antigenen met GEPULSEERDE microdeeltjes kan miljoenen levens redden in LMIC's door de vaccinatiegraad van ondergevaccineerde populaties te verhogen. Om dit te bereiken, moeten vaccins echter stabiel blijven door niet alleen inkapseling, maar ook door afgifte, wat een uitdaging kan zijn omdat de lading zal worden blootgesteld aan verhoogde temperaturen en een potentieel zure micro-omgeving als gevolg van lichaamswarmte en PLGA-afbraakproducten¹⁸. Toekomstig werk zal streven naar stabiliserende strategieën van het antigeen door middel van afgifte, wat het potentieel zou openen voor een vaccinatieplatform met één injectie dat breed toepasbaar is om veel infectieziekten te voorkomen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 µm PES filter	Cole-Parmer+B4B2:B63	04396-26
0.25 mm Shims	McMaster Carr	98090A935
0.75 inch Binder Clips	Staples	480114
10 mL Syringe	Becton, Dickinson and Company	309604
10 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11E
101.6 mm C-Clamp	Amazon	PT-SD-CP01A	Black handle will eventually fall off. Use pliers to adjust once this happens.
19 G needle	EXCELINT	26438
25 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11
3-(Trimethoxysilyl) Propyl Methacrylate	Millipore Sigma	M6514-25ML
5 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Eppendorf	22431081
50 mL Centrifuge Tubes	Corning	352098
50 mL Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe	Fisherbrand	13-678-11F
Acetone	Fisher	AC268310010
Aluminum Block	McMaster Carr	9057K175
Aluminum Foil	VWR	89079-069
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters, 100 kDa	Millipore Sigma	C82301
Anti-Rabies Virus Antibody, Serum Free Antibody, clone 1112-1, 100	Fisherbrand	13-678-11D
Anti-Rabies Virus Mouse Monoclonal Antibody, Clone D1-25, biotinylated	Fisherbrand	14-388-100
Carboxymethyl Cellulose	Tokyo Chemical Industries	C0045
ClipTip 300, Filter, Racked	Fisherbrand	13-678-11
Costar 0.65 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3206
Costar 1.7 mL Low Binding Snap Cap Microcentrifuge Tube	Corning	3207
Describe	Nanoscribe		Software used to define the printing parameters for Nanoscribe 3D printer is step 1.2. Software provided with the printer.
Desiccator	Fisher Scientific	10529901	Of gelijkwaardig
Double-Sided Tape	Staples	649280
DPBS (10x), No Calcium, No Magnesium	Gibco	14200075
Ethanol	VWR	89370-084
F1-ClipTip Multichannel Pipettes, 30 to 300 µL	Fisherbrand	13-678-11E
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 0.1 – 10 µL	Fisherbrand	13-678-11F
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 100 – 1000 µL	Fisherbrand	03-448-17
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 2 – 20 µL	Fisherbrand	FB14955202
Fisherbrand SureOne Aerosol Barrier Pipette Tips, 20 – 200 µL	Fisherbrand	13-374-10
Fisherbrand Elite Pipette Kit	Fisherbrand	05-408-137
Fisherbrand Pipet Controller	Fisherbrand	FB14955202
Glass Petri Dish, 90 mm	VWR	470313-346
Glass Slides	Globe Scientific	1380-10
Helicon Focus 8	HeliconSoft		Software gebruikt om beeldstacks te focussen
IP-Q Resin	Nanoscribe		Printerhars is compatibel met de 10x lens en wordt gebruikt voor het printen van grote microstructuren op de Nanoscribe Photonic Professional GT2
Lascar EL-USB-TC-LCD Thermocouple	Amazon	5053485896236	Of gelijkwaardig
Microscope Slide Box	Millipore Sigma	Z374385-1EA	Of gelijkwaardig
Nanoscribe Photonic Professional GT2 with 10X Objective	Nanoscribe
NanoWrite	Nanoscribe		Software gebruikt om te communiceren met de nanoscribe 3D-printer. Software geleverd met de printer.
Nunc MaxiSorp Flat-Bottom 96-well Plate	Invitrogen	44-2404-21
OPD Substrate Tablets (o-Phenylenediamine Dihydrochloride)	Fisherbrand	02-707-432
Parafilm M Wrapping Film, 4 in.	Fisherbrand	13-374-10
PDC 60 with Type 3 Coating	Scienion	P-2020
PDMS Particle Molds	Rice University	n/a	N/A- Deeltjes zijn 400 μm in diameter met een wanddikte van 100 μm en een hoogte van 500 μm, resulterend in een binnendiameter van 200 μm. De arrays zijn 14 x 22 deeltjes met een onderlinge afstand van 600 μm. 4- en 5-punts sterren worden gebruikt als fiducials, gepositioneerd 600 μm rechts en links van de bovenste rechter en bovenste linker deeltjes op de array.
Petri Dish	Fisher Scientific	08-757-100D
Pierce Stable Peroxide Substrate Buffer (10x)	Fisherbrand	02-707-430
Plastic Cups	Fisher Scientific	S04170
PLGA Film, 502H	Sigma	502H: 719897-1G
Propylene Glycol Monomethyl Ether Acetate	Millipore Sigma	484431
Rabies Antigen	Chiron Behring and Bharat Biotech International		Materiaal werd verkregen door een overeenkomst voor materiaaloverdracht met het bedrijf aan te gaan.
Razor Blades	VWR	5